WB实验步骤详细总结.docx
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WB实验步骤详细总结
蛋白提取（所有操作在冰上进行）
1.裂解
1）配裂解液：
PMSF=100:
1，（裂解液和PMSF在-20C保存，提前一天4C解冻）
取2ml裂解液，加20MPMSF混匀
2）称取30mg组织，切碎放入标记好的AP管中，加入600讪上述1中液体（加入液体与组织比例为20：
1），冰上静置10min
2.匀浆
先用超纯水润洗一下匀浆机的钢头，（同时进行几组匀浆时，组间也要润洗钢头）
在匀浆机（在生化室）上每次匀浆10s,两次（间隔5s），冰上静置30min
3.离心（在基础4楼416室）
1）自带1ml枪以及蓝枪头和黄枪头，三个1.5的离心管（①，②两个标记，③加少量
超纯水，③号是为了离心平衡，对称放置）
2）将离心机预冷至4C为止，以1200X10r/min离心15min
3）用移液枪将上层清液取出放入①②号管中
4.变性（上样缓冲液：
样品=4:
1）
将样品转移至2~3个0.5mlAP管中
加上样缓冲液，100C变性10min
仪器屏幕：
S5
00:
10
S5
100.
0
00:
10
1
温度「C）时间（时：
分钟）
5.保存
变性结束后，打开AP管盖放一下气，然后4C保存，点样是取出即可用
WB实验步骤
1.清洗玻璃板：
清洗玻璃板后风干，将玻璃板对齐后放入夹中卡紧，操作时要使两玻璃对
齐，以免漏胶。
2.配制分离胶
1）准备：
1ml枪（蓝色枪头），200讪枪（黄色枪头）10讪（白色枪头）
2）10%分离胶的配置：
（用50ml烧杯。
1.0mm板配1.5块胶，1.5mm板配2块板）
5.91ml
超纯水
4.95ml
丙烯酰胺（30%）避光保存极易失效
3.75ml
Ph8.8Tris?
HCL
150M
10%SDS
150
AP（催化剂促凝作用）
9讪
TEMED
混合摇匀（用移液枪抽吸混匀液体，不要将液体完全打出防止气泡）
3.灌胶
沿玻璃板右上角缓慢匀速加入分离胶（用1ml移液枪，不要将移液管内液体完全打出
防止气泡）保持液面平稳上升至上方绿色线为止
4.水封
立即用1ml超纯水进行水封（利用重力把胶压平），如有气泡则用针头吸出防止影响
电泳效果，等待20-30min
5.浓缩胶的配制（5%）
4.13ml
超纯水
1ml
丙烯酰胺（30%）避光保存极易失效
750M
Ph6.8Tris?
ICL
60m
10%SDS
60M
AP（催化剂促凝作用）
6讪
TEMED
6.电泳（电泳液最多使用两次）
1）安装电泳装置
低板对内，上方夹住，往两板中加入电泳液至黑线并观察是否漏液，缓慢拔掉梳子（注意两手平衡拔岀防止拔歪）
2）点样（不易时间过长，防止样品条带扩散）
Mark
4讪
（Proternladder）推荐9卩，实际4卩已经足够
样品
8讪
7-10讪均可内参挑齐即可
组数少时尽量靠中间点样，边缘易跑歪
3）连接电泳仪
电泳池与电泳盖连接：
黑对黑，红对红电永池的两个电极插入电极盖孔内，打开开关恒压电泳
先调电压至70mV，跑约20min。
（Mark跑开，分出彩带即可）
再调电压至120mV，跑约60min。
（不能跑过下面的玻璃板）
注：
Mark的条带从红色条带往下依次为：
70-55-40-35-20，待测蛋白的分子量再哪一区域就在
哪L段剪。
用绿色的切板切割待测区域，边缘留点空余，以防止切到条带。
放入装有转移液的皿中浸泡
7.转膜（转移液可用3-4次）
1）剪四层滤纸（大小与膜相，近可大不可小）浸入转移液皿中。
然后再讲其剪成与胶一致大小（胶始终保持湿润）
2）剪PVDF膜（用上述滤纸，勿用手直接接触PVDF膜），然后用甲醇活化10s以上
3）“夹三明治”再大塑料盆中加入少量转移液，将夹板、海绵、滤纸、膜均放入浸泡，夹板黑板在下、
两层滤纸-胶-膜-两层滤纸（胶的大分子量条带在上方，即在右上方）
4）安装转膜装置：
黑板对黑板，电极黑对黑，红对红。
加入转膜液至满（否则仪器无法启动）
5）打开开关，调节电流至100mA，转膜2h（恒流）盆中加满冰
转膜成功标志：
胶上的条带均转移的膜上，胶呈无色
8.圭寸闭
1）配制5%脱脂奶粉：
2.5g脱脂奶粉
［小烧杯中混匀加入皿中
50mlTBST..
2）将膜取出放入上述加入了5%脱脂奶粉中的皿中常温慢摇60min（转移液回收其余清理掉，转移
液可以重复利用2次）
9.一抗
1）用TBST配，每一格加5mlTBST，再分别加入抗体
抗体的量：
21（Psmad2l）免抗
1:
1000
5讪：
5ml
58（分子量）
21（Psmad2l）免抗
1:
500
10讪：
5ml
58
Jnk免抗
1:
1000
5讪：
5ml
双带
内参（小鼠抗GAPH）单抗，中杉金桥
1:
5000
1讪：
5ml
36
2）膜上用圆珠笔标记，分别放入小格中（正面朝上）
3）4°C冰箱中，慢摇过夜（正面朝上，摇床416室）
10.洗脱
用TBST在皿中洗脱，摇床10min每次，洗三次。
11.二抗
1）用3%的脱脂奶粉
1.5g的脱脂奶粉[
>小烧杯中混匀加入皿中
50mlTBST丿
2）每格吸入5ml3%脱脂奶粉，抗体与奶粉比例均为1:
5000，即加入1讪
注意：
吸入微升时，一定要检查是否吸到液体，一抗用鼠抗则二抗用鼠抗，一抗用免抗二抗用免抗
3）膜分别加入小格，慢摇1-2h（常温）
12.洗脱
用TBST在皿中洗脱，摇床10min每次，洗三次
13.显影:
U盘
A液，B液（显影液。
4C保存）
所需物品<
200pl枪+枪头（黄）
<膜（置于皿中）
1）开机后自动预冷，温度降到1-20'C才可
2）显影液现配现用（A液：
B液=1:
1）
3）膜正面朝上放于暗箱，（即大分子量再左上角）用移液枪吧显影液均匀涂在膜上
4）先点击自动曝光，看下效果，显示不清晰再手动该曝光时间，内参一般显影15s（影像的条带粗细深浅一致则说明已调齐）内参好说明各步实验操作均无误，目的蛋白结果好坏就取决于抗体的专一性。
5）每张图保存多张不同清晰度的以备用，拷贝至U盘
试剂配方:
5J3O°oAcrBic07,5:
1）
丙烯醜胺（Act）
23.1g
甲叉双丙烯®t胺（Bic）
075£
剖纯水至
100mJ
IRAcr28Jg,加超纯水〔约80ml）,搅拌’待A席帑解后*WBic0.75g.溶解
后定容电100ml,转移至哋庾战扇瓶C100ml）
4:
C避光保存口
6）L5MTrisHCl（pH88）
Tfis（MW12L14）
4543g
超纯水
200ml
洛解后•用浓盐酸调pH至86室诅保存.
7）LOMTrisHCI（|：
H7,5）
Tris（MWJ21J4）
30.29g
J3纯水
200ml
溶解后，用浓盐酸调pH7.5（浓盐检加入休积约161111），牢温恨存。
8）0.5MTrisHC1〔pH&8）
Tris（MW12144）15.14g
超纯水200nil
潘解后，川浓衣酸调pH至6&窒常保
9）10%SDS（I.烷基硫隈讷）
SDS10袞
趙纯水100ml
5FC水浴，至禿分ifijW,室隘探存b（如果艮期保疗屮出现沉淀，水浴溶化后・可继续便用）
10）10%AP（过流酸做｝
AP0.1g
超纯水1ml
涪解£,化斑光保存,保#时何为1周.
11）20°°TwecnlO
Tween2020ml
超存水80nil
混匀后，4=C保石*
12）10%分离胶<1块胶）
超纯水3.94ml
30°4AcrL5MTn^HCl〔pH&8>25ml
13%SDS】00卩】
10%AP100pl
TEMED6山
13）1$%分离股（1块胶）
剖纯水23ml
30%Ac「BX5,0ml
15MT11SHC1（pH8.8）2.5ml
14）5%浓缩胶胶）
SO%ActBic
10ml
05MTiisHCl
（pH6.8）
075nil
10%EDS
60llI
10%AP
60jd
TEMED
6[d
15）电泳液<1000ml）
甘氨酸
IKSg
Tris
3Q4a
SDS
lg
趙纯水
1000ml
搅徉溶解后备用,应在三天内使用乜
16）转移液（1000ml）
U氨酸
144g
Tris
304g
SDS
0^Se
匚
超纯木
£00ml
搅捋溶解后.加
甲醉
200ml
混匀.静置20mill后，转移至硬质玻璃柢中，
盖保存*
应在三天内使用口
趙纯水
4,13ml
17）TBST（1000ml）Buffer
8.8g
990ml
NaCJ
超纯水
搅样洛解Er,加
l.OMTnS'HCl（pH75）1Cnil
20%TwccnlO236ml
混匀rR移至硬质玻漏瓶中备用，应在三灭内使用口
18）封闭液（5%脱脂奶粉〉
2.5g脱脂奶粉-50nJTEST搅件溶解，现呢先川便用。
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