mirRNA引物设计2.docx
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mirRNA引物设计2
miRNA常用实验方法；一、miRNA的检测方法；miRNA的realtime-PCR检测方法；1、realtime-PCR引物设计；miRNArealtime-PCR引物设计方法：
；1）stem-loopRT引物设计：
基于通用的茎；GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG；2）realtime上游引物设计：
miRNA序列；3）下游引物是通用的，序列miRNA常用实验方法
一、miRNA的检测方法
miRNA的realtime-PCR检测方法
1、realtime-PCR引物设计
miRNArealtime-PCR引物设计方法：
1）stem-loopRT引物设计：
基于通用的茎环结构，只需要按照不同的miRNA序列修改最末端6个碱基即可。
通用茎环结构序列为：
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC例如设计miR-1（UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU）的RT引物，只需在通用茎环序列后架上miRNA3’末端的6个碱基的反向互补序列，即
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACATACAT
2）realtime上游引物设计：
miRNA序列除去3’端6个碱基的剩余部分作为上游引物，如miR-1的上游引物为（注意把U改为T）：
TGGAATGTAAAGAAGT.检查引物的Tm值（一般参考DNAMAN），如果Tm值较低，则在5’端加GC使Tm值接近60度。
因此miR-1的上游引物可设计为：
GCGCTGGAATGTAAAGAAGT，61.4度。
3）下游引物是通用的，序列为GTGCAGGGTCCGAGGT。
4）引物设计好后，需要通过预试验检测引物的特异性。
一般需要做溶解曲线来检测引物的特异性；同时最好将PCR产物进行电泳检测产物是否单一（因产物长度很小，需要3%以上的琼脂糖胶）。
2、miRNA反转录
miRNA的反转录与一般基因的反转录过程基本相同。
因为其产物很短，用最普通的逆转录酶即可。
我们一般使用的是TIANGEN的MLV，逆转录体系为：
RNA500ng~2ug
5xbuffer2ul
dNTP0.25ul
DDT0.25ul
RRI0.25ul
MLV0.25ul
RTprimer0.5ul
H2O（RNasefree）补至10ul
程序为（PCR仪中通常命名为CTFRT）16度，30min；42度，60min；85度，5min；4度，hold。
！
！
做miRNA的反转录时，注意不要忘记内参的RT，即一个样品至少要做目的miRNA和内参两管反转录反应。
3、realtime-PCR实验
miRNA逆转录完成后得到的cDNA即可进行下一步PCR。
在确认引物的特异性后，我们可以进行正式实验。
一般每个样品至少需要3个平行孔。
RealtimePCR体系为（ABI定量PCR仪需要加ROXdyeII，Biorad定量PCR仪不需要加ROX）：
2XSYBR10ul
ROXII0.4ul（Biorad不加）
Primer1ul
Template1ul
H2O7.6ul（Biorad8ul）
需要注意的几点：
1）在配制PCR体系时，请一定配制总体系，逐步分装。
每步分装前充分混匀。
这一点是PCR平行性的保证。
2）配制体系尽量在冰上进行。
3）请选用比较准确的枪进行体系配制，并注意体系的冗余。
一般来说，配制一整个96孔板的PCR体系，我会配制100个反应的总量，保证分装到最后稍有剩余。
PCR程序：
95度，1min；95度，5s；60度，34s（此步在读取荧光值）。
40到45个循环。
4、realtimePCR结果分析
realtimePCR反应结束后返回Ct值，可以利用定量PCR仪软件自带的程序进行分析，也可以利用EXCEL表格进行相对定量计算。
具体的计算方法：
将三个平行孔的数值拷入到EXCEL表格的相应位置，即可自动计算出相对值。
注意，第一组样品的值将被默认为归一为1。
其他的样品与之相比得出相对值。
EXCEL表格公式见附件。
二、miRNA靶基因的预测
miRNA靶基因预测软件简介
1、TargetScan：
http:
//www.targetscan.org/
首先选择预测的物种，如果要预测小鼠的miRNA和靶基因，则点击右上角的“
Goto
TargetScanMouse”。
第二个选项可输入基因名（有时不识别别名），点击submit即可，此操作可预测可能靶向该靶基因的miRNA；或者输入miRNA的名字，点击submit，此操作可以预测该miRNA的靶基因。
2、Pictar：
http:
//pictar.bio.nyu.edu/
输入网址后进入pictar主页，下面有几个可选用的数据库，一般选用最后两个数据库即可。
点击进入预测界面。
选择物种，选择要预测的miRNA（注意：
如果你感兴趣的miRNA在下拉菜单中未列出，则不可预测，可考虑换用其他软件）并点击searchfortargetsofamiRNA或输入geneID（注意：
与targetscan不同，pictar一般不识别基因名，最好输入gene号：
NM_*****）点击searchforallmiRNAspredictedtotargetagene.进行预测。
3、Mirbase：
http:
//www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/cgi-bin/targets/v5/search.pl分别输入miRNA名或基因名即可进行预测。
其他选项不用更改。
预测结果的处理和分析
我们通常会将三种不同软件的分析结果做比较，选取两种以上软件预测的交集部分作为我们候选的靶基因。
如果这样的结果仍然过多，可以选取三种软件预测的交集进行下一步筛选。
如果三种软件预测的结果没有交集部分，可以取并集，然后从中按功能提示进行挑选。
三、miRNA的过表达和敲低
1、过表达
过表达miRNA一般可采用两种方法：
a构建过表达载体；b人工合成成熟miRNA。
a构建过表达载体
1）获取miRNA基因的序列及旁侧序列进入Ensembl（http:
//www.ensembl.org/index.html）主页。
输入miRNA名，点击进入。
在exportdata页面上选择输入5’flankingsequence和3’flankingsequence分别为200bp（见下图），然后点击next即可得到包括前体和左右侧翼200bp的序列。
2）基于这段序列，我们可以设计该miRNA的表达序列。
引物设计原则：
扩增产物包括前体，并左右各有至少70bp的侧翼序列，长度一般在200bp-500bp。
其他同一般引物设计。
载体可以选用任意使用RNApolII识别的启动子的载体，包括T7，CMV等。
常用的是pcDNA3.1，不要带标签的。
注意：
如果miRNA位于cluster中，则扩增长度要控制，避免同时包括两个或两个以上的miRNA。
完成表达载体的克隆并测序确认后，转入到细胞中进行表达检测。
如果目的miRNA的表达明确，则载体构建完成。
b合成成熟的miRNA序列查出miRNA的准确序；2、敲低；目前做内源性miRNA的敲低一般使用人工合成的m；报告基因实验方法；一、miRNA靶基因筛选；荧光素酶报告基因实验；1、荧光素酶报告基因质粒的构建；载体质粒为经过改造的pcDNA3.1，其图谱见下；NotI.；XhoI；XbaI；靶基因3’UTR的获得；2、荧光素酶实验；构建好荧光素酶报告基因实验后
b合成成熟的miRNA序列查出miRNA的准确序列，请公司合成成熟的序列。
常用的公司有：
上海吉凯；invitrogen等。
2、敲低
目前做内源性miRNA的敲低一般使用人工合成的miRNA的反义链，即成熟miRNA的序列的反义互补序列。
如mir-x序列为UCACACAACCCACCACCAUUG，则其inhibitor序列为CAAUGGUGGUGGGUUGUGUGA.将该序列送交公司合成即可。
报告基因实验方法
一、miRNA靶基因筛选
荧光素酶报告基因实验
1、荧光素酶报告基因质粒的构建
载体质粒为经过改造的pcDNA3.1，其图谱见下图。
可用的酶切位点为NotI，XhoI及XbaI.推荐优先使用XhoI和XbaI两个酶切位点。
如过不能用，可用
NotI.
XhoI
XbaI
靶基因3’UTR的获得。
3’UTR序列是指从Mrnaz终止密码子后的第一个碱基开始到mRNA最后一个碱基（通常是polyA结尾）。
模板可采用相应物种的cDNA或基因组。
在选择模板时要注意：
一般来讲，cDNA适于所有的3’UTR扩增，但有时3’端AT过多导致引物设计困难时，可以考虑用基因组做模板。
但是基因组做模板的前提是靶基因3’UTR由一个外显子组成。
相关信息可以从ensembl中查阅外显子信息可以知道。
一般尽可能全面的扩增3’UTR，但如果3’UTR过长或引物设计困难，可以选取包括miRNA结合位点的一段3’UTR。
引物设计的原则同一般引物设计。
2、荧光素酶实验
构建好荧光素酶报告基因实验后，准备开始做报告基因实验前，你还需要准备以下材料：
1）TK质粒，作为共转染的内参。
2）miRNA的过表达质粒或合成的miRNA。
质粒的浓度尽量在500ng/ul以上，合成的miRNA稀释到20uM。
3）状态良好的细胞。
1）分细胞。
我们常用24孔板进行报告基因实验。
分细胞时保证细胞铺板均匀（摇匀细胞的方法见细胞培养的方法），每孔细胞数目相当。
以293ET细胞为例，我们转染的密度一般在60-80%作用，如果用威格拉斯转染试剂，细胞密度可以稍高些，
因为转染后细胞
死亡较多。
2）转染。
转染时必须配总体系再依次分成小体系。
这一步决定着每个孔的平行性和实验的
可重复性。
转染核酸用量为每孔：
luc-3’UTR200ng；TK50ng；miRNA-pcDNA3.11ug或合成的miRNA2.5ul（终浓度100nM）。
Vig每孔用量为1ul，lip2000为2ul。
转染后4-6h换液。
如果用vig转染必须及时换液，否则细胞会尸横遍野。
注意设立合理的对照，通常用pcDNA3.1（或miRNANC）代替miRNA-pcDNA3.1（miRNA）做miRNA的对照。
3）收细胞。
转染24-48h可以收取细胞。
用生理盐水或PBS清洗细胞两次，因293细胞极
易脱落，建议操作温柔，如果对自己的操作没有自信，可以增大生理盐水量只洗一次。
之后吸干生理盐水。
每孔加入80ul1Xpassivebuffer（裂解液的量可视细胞数目稍作调整），室温摇20min，如果细胞裂解充分会看到白色粘稠状细胞碎片。
如果不马上测，可连同24孔板冻于-80度，
测时再取出解冻。
-20度可
保存一周。
4度可保存一天。
4）测定荧光素酶活性。
使用中
心实验室108室turner仪
器进行双荧光素酶的测量。
具体仪器操作方法可学习
相关教程或请教师兄师姐。
我们使用的试剂盒为
promega的双荧光素酶报告
系统：
bufferII为萤火虫荧
光素酶的底物，测量数值为
我们的报告基因的活性；
S&Gbuffer作用是淬灭萤
火虫荧光素酶的活性并提
供海肾荧光素酶反应的缓
冲环境，测定的数值为内参
的活性。
测定时，取细胞裂解液8ul到96孔板中（专用的96孔板）上机测量。
每种底物每孔加30ul。
3、结果分析
测定荧光素酶后会返回三个值：
萤火虫荧光素酶活性、海肾荧光素酶活性及两者的比值。
比值将作为最后的分析数据，反映了该孔报告基因的相对活性。
通常将对照归一为1，实验组与其相比取相对值。
此相对值用于最后作图和统计分析。
归一方法和作图请自学EXCEL或请教其他同学。
GFP报告基因实验
1、GFP报告基因质粒构建：
与荧光素酶报告基因质粒构建方法同。
仅仅是用GFP取代
luciferase。
2、实验方法及结果分析
1）转染。
一般使用12孔板进行实验，每孔转染量：
GFP-3’UTR，200ng-500ng；miRNA，
1ug质粒或100nM合成的miRNA。
2）转染48h后，用荧光显微镜照相，观察绿色荧光的强度；收取细胞，用GFP抗体检测
GFP
表达水平。
建议做三个平行孔，结果需要进行统计学分析以判断差异是否显著。
二、转录因子调控分析
1、启动子的预测、确认
启动子是指RNA聚合酶识别并结合的DNA序列，并包括促进这一过程的调节蛋白的结合位点。
启动子位于转录起始位点附近，而真核基因的转录起始位点通常需要实验进行确定。
5’RACE是确定基因转录起始位点的经典方法。
在不知道转录起始位点时，我们也可以对启动子进行预测。
预测基因启动子的软件有：
NCBIpromoterscan（http:
//www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/）等。
2、转录因子的预测
通常我们比较关心哪些转录因子可以调控我们感兴趣的基因，这就涉及到该基因的转录因子的预测和鉴定。
转录因子的预测软件有：
SignalScanhttp:
//www-bimas.cit.nih.gov/molbio/signal/
TFsearchhttp:
//www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html等。
将待预测的上游调控序列输入进行分析，即可知道该序列中含有哪些转录因子的结合位点。
（说明：
这两个软件提供的预测结果不够全，有一些转录因子没有被包括其中。
）
3、报告基因质粒的构建
我们经常使用的质粒载体为PGL-Basic，质粒图谱见下图。
我们要将待分析的启动子序列插入到luciferase基因上游。
推荐使用kpnI，XhoI，BglII和HindIII这几个酶切位点，但不建议用XhoI和BglII双酶切，因为这两个酶切位点有重合。
该载体测序用RVP3（正向）和GLP2（反向）。
4、实验方法及结果分析
常见的启动子（转录因子）活性分析实验：
1）连续截短确定核心启动子。
克隆基因的上游调控序列，做连续的截短，如构建
-2000~-1500，-1500~-1000，-1000~-500，-500~0，0~500一系列克隆，转入细胞，观察荧光素酶活性，以此判断哪一段序列对于该基因的转录活性起关键作用。
例如：
-2000~-1500和-1500~-1000有很高的活性，而-1000~-500活性很弱，则可判断核心启动子区在-1500~-1000。
2）特定转录因子对转录活性的分析。
我们构建包含该转录因子的启动子序列（上游调
控序列）的报告基因质粒，与转录因子的过表达载体（或RNAi）共转染细胞，观察转染前后报告基因活性的变化。
如果转染后报告基因活性发生明显改变，则可判断该转录因子可能调控目的基因的转录。
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