实时荧光定量PCR具体实验步骤.docx

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实时荧光定量PCR具体实验步骤

实时荧光定量PCR操作步骤

以下实验步骤仅供参考：

1样品RNA的抽提

①取冻存已裂解的细胞.室温放置5分钟使其完全溶解。

②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿.盖紧管盖。

手动剧烈振荡管体15秒后.15到30℃孵育2到3分钟。

4℃下12000rpm离心15分钟。

离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相.中间层以及无色水相上层。

RNA全部被分配于水相中。

水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。

③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。

加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA.混匀后15到30℃孵育10分钟后.于4℃下12000rpm离心10分钟。

此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

④RNA清洗移去上清液.每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制）.清洗RNA沉淀。

混匀后.4℃下7000rpm离心5分钟。

⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液.使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时.先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次.使其完全溶解.获得的RNA溶液保存于-80℃待用。

2RNA质量检测

1）紫外吸收法测定

先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。

然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:

100）后.读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值.测定RNA溶液浓度和纯度。

①浓度测定

A260下读值为1表示40µgRNA/ml。

样品RNA浓度（µg/ml）计算公式为：

A260×稀释倍数×40µg/ml。

具体计算如下：

RNA溶于40µlDEPC水中.取5ul.1:

100稀释至495µl的TE中.测得A260=0.21

RNA浓度=0.21×100×40µg/ml=840µg/ml或0.84µg/µl

取5ul用来测量以后.剩余样品RNA为35µl.剩余RNA总量为：

35µl×0.84µg/µl=29.4µg

②纯度检测

RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度.比值范围1.8到2.1。

2）变性琼脂糖凝胶电泳测定

①制胶

1g琼脂糖溶于72ml水中.冷却至60℃.10ml的10×MOPS电泳缓冲液和18ml的37%甲醛溶液（12.3M）。

10×MOPS电泳缓冲液

浓度  成分

0.4M  MOPS.pH7.0

0.1M  乙酸钠

0.01M  EDTA

灌制凝胶板.预留加样孔至少可以加入25µl溶液。

胶凝后取下梳子.将凝胶板放入电泳槽内.加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。

②准备RNA样品

取3µgRNA.加3倍体积的甲醛上样染液.加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10µg/ml。

加热至70℃孵育15分钟使样品变性。

③电泳

上样前凝胶须预电泳5min.随后将样品加入上样孔。

5–6V/cm电压下2h.电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2–3cm。

④紫外透射光下观察并拍照

28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型）.上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。

还有可能观察到一个更小稍微扩散的带.它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。

在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质.可能是由mRNA和其它异型RNA组成。

RNA制备过程中如果出现DNA污染.将会在28S核糖体RNA带的上面出现.即更高分子量的弥散迁移物质或者带.RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。

用数码照相机拍下电泳结果。

3样品cDNA合成

①反应体系

序号  反应物  剂量

1  逆转录buffer  2μl

2  上游引物  0.2μl

3  下游引物  0.2μl

4  dNTP  0.1μl

5  逆转录酶MMLV  0.5μl

6  DEPC水  5μl

7  RNA模版  2μl

8  总体积  10μl

轻弹管底将溶液混合.6000rpm短暂离心。

②混合液在加入逆转录酶MMLV之前先70℃干浴3分钟.取出后立即冰水浴至管内外温度一致.然后加逆转录酶0.5μl.37℃水浴60分钟。

③取出后立即95℃干浴3分钟.得到逆转录终溶液即为cDNA溶液.保存于-80℃待用。

4梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（β-actin）实时定量PCR

①β-actin阳性模板的标准梯度制备阳性模板的浓度为1011.反应前取3μl按10倍稀释（加水27μl并充分混匀）为1010.依次稀释至109、108、107、106、105、104.以备用。

②反应体系如下：

标准品反应体系

序号  反应物  剂量

1  SYBRGreen1染料  10μl

2  阳性模板上游引物F  0.5μl

3  阳性模板下游引物R  0.5μl

4  dNTP  0.5μl

5  Taq酶  1μl

6  阳性模板DNA  5μl

7  ddH2O  32.5μl

8  总体积  50μl

轻弹管底将溶液混合.6000rpm短暂离心。

管家基因反应体系：

序号  反应物  剂量

1  SYBRGreen1染料  10μl

2  内参照上游引物F  0.5μl

3  内参照下游引物R  0.5μl

4  dNTP  0.5μl

5  Taq酶  1μl

6  待测样品cDNA  5μl

7  ddH2O  32.5μl

8  总体积  50μl

轻弹管底将溶液混合.6000rpm短暂离心。

③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机.反应条件为：

93℃　2分钟.然后93℃1分钟.55℃2分钟.共40个循环。

5制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板

①针对每一需要测量的基因.选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。

反应体系：

序号  反应物  剂量

1  10×PCR缓冲液  2.5ul

2  MgCl2溶液  1.5ul

3  上游引物F  0.5ul

4  下游引物R  0.5ul

5  dNTP混合液  3ul

6  Taq聚合酶  1ul

7  cDNA  1ul

8  加水至总体积为  25ul

轻弹管底将溶液混合.6000rpm短暂离心。

35个PCR循环（94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟）；72ºC延伸5分钟。

②PCR产物与DNALadder在2％琼脂糖凝胶电泳.溴化乙锭染色.检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。

③将PCR产物进行10倍梯度稀释:

将PCR产物进行10倍梯度稀释:

设定PCR产物浓度为1×1010.依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。

6待测样品的待测基因实时定量PCR

①所有cDNA样品分别配置实时定量PCR反应体系。

体系配置如下：

序号  反应物  剂量

1  SYBRGreen1染料  10ul

2  上游引物  1ul

3  下游引物  1ul

4  dNTP  1ul

5  Taq聚合酶  2ul

6  待测样品cDNA  5ul

7  ddH2O  30ul

8  总体积  50ul

轻弹管底将溶液混合.6000rpm短暂离心。

②将配制好的PCR反应溶液置于RealtimePCR仪上进行PCR扩增反应。

反应条件为：

93℃2分钟预变性.然后按93℃1分钟.55℃1分钟.72℃1分钟.共40做个循环.最后72℃7分钟延伸。

7实时定量PCR使用引物列表

引物设计软件：

PrimerPremier5.0.并遵循以下原则：

引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发DNA聚合反应（即错配）。

8电泳

各样品的目的基因和管家基因分别进行RealtimePCR反应。

PCR产物与DNALadder在2％琼脂糖凝胶电泳.GoldView™染色.检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。

实时荧光定量PCR

组织RNA提取：

一般认为100mg肝组织提取RNA500ng.100mg肺提取RNA200ng.脑内的RNA丰度适中.100mg脑组织.提取RNA5-200ng。

所以一个10mg的海马可匀出RNA约为20ng。

反转录反应

反转录反应参照TaKaRaRT-PCR说明书。

反转录反应条件如下。

37°C15min（反转录反应）

85°C5sec（反转录酶的失活反应）

RealTimePCR反应

选用脑源神经营养因子（BDNF）为目标基因.核糖体18SrRNA（18SrRNA）做为内参。

基因

引物序列

扩增片段长度

NR2B

NR2B（+）

CCGCAGCACTATTGAGAACA

213bp

NR2B（–）

ATCCATGTGTAGCCGTAGCC

18srRNA

18srRNA（+）

tttgttggttttcggaactga

198bp

18srRNA（–）

cgtttatggtcggaactacga

1）按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。

试剂

使用量

终浓度

SYBR®PremixExTaqTM（2×）

12.5μl

1×

PCRForwardPrimer（10μM）

1μl

0.4μM

PCRReversePrimer（10μM）

1μl

0.4μM

模板（cDNA溶液）

0.5μl

dH2O

10μl

Total

25μl

全班40人.分为5组.每组做8管。

4管做BDNF.4管做18SrRNA。

4管BDNF或者18SrRNA.采用相应的正反PCR引物。

每种基因做两个模板.一个模板采用原液浓度.一个模板采用稀释一倍浓度.体积均为0.5μl。

2）三步法PCR

首先95°C作用3min。

PCR进行35个循环。

步骤

温度

时间

变性

95°C

30秒

退火

58°C

30秒

延伸

72°C

30秒

融解曲线

温度

时间

变温速度

95°C

0秒

20°C/秒

55°C

15秒

20°C/秒

95°C

0秒

0.1°C/秒

PCR疑难解答

当PCR结果不甚满意时.首先检查以下几方面并遵照执行：

1将PCR反应的试管与反应板紧贴。

2当酶反应混合物以70℃“热启动”开始循环时.切记在加入酶后稍3微振荡一下.因为在0.2-ml的PCR管中不能均匀传热。

4不要随意减少dNTP的用量.它是一个系统的因素.必须与其它成份保持平衡。

5对于有问题的PCR反应.例如模板的量少.模板不纯和环状模板等.先尝试加Taq酶前的体系进行预变性.后加模板进行正常PCR扩增。

没有扩增产物：

1在提供MgCl2缓冲液中.以0.25mmol/L为梯度增加MgCl2浓度；无MgCl2的缓冲液以0.5mmol/L为梯度增加MgCl2浓度。

2泳道中出现模糊条带.如果DNA模板中存在RNA.则按上述提示浓度补加MgCl2.因为在PCR反应中可能缺少游离的Mg2+。

3检查退火温度和变性条件.如果有需要的话.可降低退火温度。

4检查模板和引物的用量。

5增加循环次数和/或模板DNA的用量。

泳道中出现模糊条带：

1减少循环次数或模板DNA的用量。

2提高退火温度.但不要超过68℃。

3重新设计引物或设计更长的引物。

其他值得注意的条件：

1建议使用0.2-ml薄壁管。

厚壁管在92℃时不能有效地使模板变性。

2最佳反应体积为50ml.推荐用30ml矿物油覆盖（对盖子加热的PCR仪可以不加）。

3大多数反应中.0.75ml（0.5~1ml）的酶量在大多数情况下可以得到满意的结果。

4建议使用1.75mmol/LMgCl2∶350mmol/LdNTP或2.25mmol/LMgCl2∶500mmol/LdNTP组合的混合物。

然而要得到最佳结果.优化Mg2+的浓度是必需的。

5基因组DNA模板的质量显著影响PCR反应。

因此推荐使用琼脂糖凝胶电泳来检测DNA的长度。

DNA片段长度可以超过50kb.传统的基因组DNA能扩增片段至10kb。

6要扩增更长的片段应使用超纯或高分子量的DNA。

请查阅高分子量DNA提取操作过程相关文献。

7降低二级结构和引物二聚物形成的可能性。

进行长片段PCR扩增时.引物长度一般为24~34个核苷酸.溶点在60~68℃间。

使用这类引物可提高PCR反应的退火温度来增加反应的特异性。

这点非常重要.长片段扩增的效果往往受到非特异性短片段优先扩增的影响。

8变性：

第一步变性在94℃下进行2分钟。

在循环过程中尽可能缩短变性时间（94℃下进行20--30秒）.除非模板中富含GC.则95℃下变性30秒。

这可以防止DNA脱嘌啉和链断裂.对于所需扩增的基因组DNA片段终长度超过12kb时.应该尽可能的降低变性温度。

9延伸：

68--72℃下进行延伸操作。

10循环延伸：

尽量采用循环延伸的条件.若PCR仪无此功能.则必须增加延伸的时间.例如在扩增10kb片断时.延伸时间用10分钟替代原来的8分钟。

11长片断PCR系统扩增的片断其3’-末端带有一个突出的A.因此建议采用T/A克隆。

若要进行平端可隆.可用Klenow酶和T4DNA多聚酶将PCR产物补平后再进行。

12测序时因酶的混合物带有3’→5’外切酶活性.用Sanger方法进行测序不能产生均一的（染色体）带型。

13在无菌的0.5ml或0.2ml离心管中按下列操作程序加样：

14反应物加样顺序体积（μl）终浓度

去离子水129.4

10×BufferB251×

10×PCR Buffer成分：

Tris-HClpH8.5100mM

KCl500mM

MgCl15mM

4×dNTP混合物35各200μmol/L 

MgCl2 431.5mmol/L

有义引物52.60.25μmol/L

反义引物62.60.25μmol/L

模板720.1μg

TaqDNA聚合酶80.41unit

2.  用微量可调加样器和一次性Tip向每一管中加50μl矿物油。

每加一管换一次Tip。

3.  振荡每只管.然后短暂离心。

4.  将管放到预热的热循环中.按下列程序开始循环：

预变性94℃4分钟1次

变性94℃1分钟

退火37-65℃1分钟

延伸72℃1分钟

循环30次

终延伸72℃7分钟1次

保存4℃ 

讨论

1.假阴性.不出现扩增条带

　　PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备.②引物的质量与特异性.③酶的质量.④PCR循环条件。

寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

　　模板：

①模板中含有Taq酶抑制剂.②在提取制备模板时丢失过多.或吸入酚。

③模板核酸变性不彻底。

在酶和引物质量好时.不出现扩增带.有可能是模板核酸提取过程出了毛病.可使用阳性对照的DNA模板配合检查模板质量。

　　酶失活：

需更换新酶.或新旧两种酶同时使用.以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。

　　引物：

引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称.是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。

有些批号的引物合成质量有问题.两条引物一条浓度高.一条浓度低.造成低效率的不对称扩增.对策为：

①选定一个好的引物合成单位。

②引物的浓度不仅要看OD值.更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳.一定要有引物条带出现.而且两引物带的亮度应大体一致.如一条引物有条带.一条引物无条带.此时做PCR有可能失败.应和引物合成单位协商解决。

如一条引物亮度高.一条亮度低.在稀释引物时要平衡其浓度。

③引物应高浓度小量分装保存.防止多次冻融或长期放冰箱冷藏.导致引物变质降解失效。

④引物设计不合理.如引物长度不够.引物之间形成二聚体等。

　　Mg2+浓度：

Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大.浓度过高可降低PCR扩增的特异性.浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

　　反应体积的改变：

通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul、或100ul.应用多大体积进行PCR扩增.是根据科研和临床检测不同目的而设定.在做小体积如20ul后.再做大体积时.一定要模索条件.否则容易失败。

　　物理原因：

变性对PCR扩增来说相当重要.如变性温度低.变性时间短.极有可能出现假阴性;退火温度过低.可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率.退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。

有时还有必要用标准的温度计.检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度.这也是PCR失败的原因之一。

靶序列变异：

如靶序列发生突变或缺失.影响引物与模板特异性结合.或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列.其PCR扩增是不会成功的。

2.假阳性

　　出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致.有时其条带更整齐.亮度更高。

　　引物设计不合适：

选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性.因而在进行PCR扩增时.扩增出的PCR产物为非目的性的序列。

靶序列太短或引物太短.容易出现假阳性。

需重新设计引物。

靶序列或扩增产物的交叉污染：

这种污染有两种原因：

一是整个基因组或大片段的交叉污染.导致假阳性。

这种假阳性可用以下方法解决：

①操作时应小心轻柔.防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。

②除酶及不能耐高温的物质外.所有试剂或器材均应高压消毒。

所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。

③必要时.在加标本前.反应管和试剂用紫外线照射.以破坏存在的核酸。

二是空气中的小片段核酸污染.这些小片段比靶序列短.但有一定的同源性。

可互相拼接.与引物互补后.可扩增出PCR产物.而导致假阳性的产生.可用巢式PCR方法来减轻或消除。

3.出现非特异性扩增带

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致.或大或小.或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。

非特异性条带的出现.其原因：

一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。

二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低.及PCR循环次数过多有关。

其次是酶的质和量.往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现.酶量过多有时也会出现非特异性扩增。

其对策有：

①必要时重新设计引物。

②减低酶量或调换另一来源的酶。

③降低引物量.适当增加模板量.减少循环次数。

④适当提高退火温度或采用二温度点法（93℃变性.65℃左右退火与延伸）。

4.出现片状拖带或涂抹带

　　PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。

其原因往往由于酶量过多或酶的质量差.dNTP浓度过高.Mg2+浓度过高.退火温度过低.循环次数过多引起。

其对策有：

①减少酶量.或调换另一来源的酶。

②减少dNTP的浓度。

③适当降低Mg2+浓度。

④增加模板量.减少循环次数。

　 PCR技术类似于DNA的天然复制过程.其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：

模板DNA经加热至93℃左右一定时间后.使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离.使之成为单链.以便它与引物结合.为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：

模板DNA经加热变性成单链后.温度降至55℃左右.引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：

DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下.以dNTP为反应原料.靶序列为模板.按碱基配对与半保留复制原理.合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程.就可获得更多的“半保留复制链”.而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需2～4分钟.2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

到达平台期（Plateau）所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

　PCR的三个反应步骤反复进行.使DNA扩增量呈指数上升。

反应最终的DNA扩增量可用Y＝（1＋X）n计算。

Y代表DNA片段扩增后的拷贝数.X表示平（Y）均每次的扩增效率.n代表循环次数。

平均扩增效率的理论值为100%.但在实际反应中平均效率达不到理论值。

反应初期.靶序列DNA片段的增加呈指数形式.随着PCR产物的逐渐积累.被扩增的DNA片段不再呈指数增加.而进入线性增长期或静止期.即出现“停滞效应”.这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。

大多数情况下.平台期的到来是不可避免的。

  PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。

短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间.是需要扩增的特定片段。

短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的.以一个原始模板为例.在第一个反应周期中.以两条互补的DNA为模板.引物是从3’端开始延伸.其5’端是固定的.3’端则没有固定的止点.长短不一.这就是“长产物片段”。

进入第二周期后.引物除与原始模板结合外.还要同新合成的链（即“长产物片段”）结合。

引物在与新链结合时.由于新链模板的5’端序列是固定的.这就等于这次延伸的片段3’端被固定了止点.保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。

不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加.而“长产物片段”则以算术倍数增加.几乎可以忽略不计.这使得PCR的反应产物不需要再纯化.就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。

基因表达谱

　　基因表达谱（geneexpressionprofile）：

指通过构建处于某一特定状态下的细胞或组织的非偏性cDNA文库,大规模cDNA测序,收集cDNA序列片段、定性、定量分析其mRNA群体组成,从而描绘该特定细胞或组织在特定状态下的基因表达种类和丰度信息,这样编制成的数据表就称为基因表达谱

　　基因表达谱的获得与表示

　　在基因芯片的实验中.首先选取来自不同状态的样本.如正常组织与肿瘤组织、不同发育阶段组织.或用药前后的细胞或组织等。

其中一种被称为实验样本.另一种就是相应地被称为参考样本。

实验样本和参考样本mRNA在逆转录过程中.分别用不同的红、绿荧光基团标记.并将它们混合.与微阵列上的探针序列进行杂交.经过适当的洗脱步骤后.用激光扫描仪对芯片进行扫描.获得对应于每种荧光的荧光强度图像.通过专用的图像分析软件.可获得微阵列上每个点的红、绿荧光强度（Cy5和Cy3）.其比值（Cy5/Cy3）称为该基因在实验样本中的表达水平。

　　Step1：

基因芯片的制备。

在硅胶、玻璃片、聚丙烯或尼龙膜等载体上按特定的排列方式固定大量的探针.形成DNA芯片。

芯片种类较多.制备方法也不尽相同.基本上可以分为两大类：

原位合成和直接点样法。

　　Step2：

荧光标记探针的制备。

将待分析的基因探针在芯片杂交之前进行纯化、逆转录或扩增级荧光标记。

最普遍的荧光标记法是用Cye3-dUTP（绿色荧光）标记对照样本.Cye5-dUTP（红色荧光）标记实验室样本。

　　Step3：

标记探针与芯片杂交。

选择杂交条件.将制备的荧光探针与芯片进行杂交.一定时间以后.洗去未结合探针.然后进行荧光信号的扫描与分析。