陈念《非水短肽合成》.docx
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陈念《非水短肽合成》
《Review:
ProteinaseCatalysedShort-PeptidesSynthesis（2ed.）》
2002Jie,BiochemistryandMolecularBiologyDepartment,LifeScienceCollege,
SouthernChinaAgriculatureUniversity,
（GuidedTeacher:
XiangYang.Gao,Editor:
NianChen）
Content
1.Preclude
1.1.Thesignificancesofshortpeptidesynthesis
1.2.Theexcellenceandshortcomingsofenzyme-catalyzedsynthesiscomparedwithothersynthesismethods
2.Themechanismsofenzyme-catalyzedpeptidessynthensisinorganicsolvent
3.Theinfluencingfactors
3.1.Factorsoftheenzyme
3.1.1Preparation
3.1.2ThepHandtheionstrengthofthebuffer
3.2Carrier
3.2.1Themethodsoftheenzyme-immobiliation
3.3Modification
3.3.1Modificationoftheenzyme
3.4Thesolventsystem
3.4.1Thecharactersofthesolventsystem
3.5Thecharactersofthereactantandtheoffspring
3.5.1.Thesolubilityandconcentrationofthereactants
3.5.2.Thewatercontentandactivity
3.5.3.Thehydrophobilityoftheprotectinggroups
3.6.Otherfactors
3.6.1.Temperature
3.6.2.Saltsaddedintothereactionsystem
3.6.3Polarityadditives
4.Summary
4.1Keyproblemsneedtobesolvedinthepeptidesythensis
5.Accessarytables
5.1.Thecollectionsoftheexamplesaboutshortpeptidesynthesis
5.2.LogPdatasofsomeorganicmedia
5.3.LogPdatasofsomeenaymecarrier
6.Postscripts
《蛋白水解酶催化短肽合成研究综述（第二版）》
华南农业大学生命科学学院2002届生物化学与分子生物学专业
（作者：
陈念指导老师：
高向阳）
一．前言
（一）肽合成的意义
1.现代生物代谢研究发现：
人类摄取蛋白质经消化道的多种酶水解后，并非完全以氨基酸的形式吸收，更多是以低肽形式直接吸收，而且二肽三肽的吸收比同一组成的氨基酸快。
其中某些低肽不仅能提供人体生长发育所需的营养物质，且同时具有促进矿质吸收、提高肌体免疫力等重要的生理功能。
2.生物活性肽是一类多功能因子，它们涉及许多生理代谢和调节功能。
日本利用生物活性肽以开发出许多功能性食品，取得了良好的经济和社会效益。
（二）相对其它方法酶法肽合成的优、缺点
1.（居乃虎[]）酶反应通常是在水为介质的系统中进行的，但是，人们研究发现，在有机介质中酶反应也能进行。
近来，核磁共振、X-射线衍射和傅立叶变换红外光谱的研究表明，在非水相中，酶分子结构中α-螺旋含量减少，β-折叠含量增加二级结构的有序性增加，因而，提高了酶的稳定性。
目前，非水系统中的酶催化作用已广泛的用于药物、生物大分子、肽类、手性化合物化学中间体和非天然产物等的有机合成，引起人们的极大关注。
2有机介质中的酶促反应（尤其是合成只含几个氨基酸的小肽片段）较传统化学合成法有明显优势：
a能催化水中不能进行的反应，可以使反应平衡由水解向肽合成方向逆转
b酶的立体专一性强，避免了化学法合成中产物的消旋问题
c较少用侧链保护基；可抑制由水等引起的副反应（例如水会使酶分子形成不规则结构、二硫键被破坏、Asp肽键水解、Asn和Gln残基脱酰胺、酰卤和酸酐水解）；且无微生物污染
d可提高疏水性底物（氨基酸及脂类衍生物）的溶解度，利于高浓度底物连续生物转化
e酶源广泛，也可通过微生物发酵生产制备大量的酶
f固定化可以提高酶的稳定性
g酶不易溶于有机介质利于回收再利用；而且从低沸点溶剂中分离纯化产物也比水中容易
h酶能合成或转化大量有机物，绝大多数有机化合物在非水系统中溶解度高
i酶反应条件温和，可催化很多对酸、碱敏感的分子参加的反应
3.亲水氨基酸在有机溶剂中溶解度小，而且多数蛋白酶不能以D型氨基酸为底物，故在方法上含上述两种氨基酸的肽的合成有待改进。
有机溶剂中脂肪酶也有合成肽键的功能，而且其无酰胺酶活性，肽的水解被抑制，这对寡肽合成有利，而蛋白酶相对来说稳定性较差，而且水的存在可能使肽降解（此处来源待查－文献11[25/26]）。
二．酶有机相催化肽合成的机理
1.从宏观分析：
一些蛋白解酶、羧酸脂酶在有机溶剂中底物专一性完全逆转，原因在于越亲水的底物与水形成的氢键越强，从而不利于酶－底物络合物的形成，使得在水中，氨基酸优先与水形成亲键；在有机溶剂中，则是氨基酸优先与酶结合。
2.Klibanov（1977）[]以及Martinek[]对有机介质中酶促合成机理进行过详细的讨论。
认为有机相和水相的体积比（α）以及反应底产物在两相中的分配系数（Pi）决定了水-有机溶剂体系和单一水相中酶促肽合成的有效平衡常数的比值（K/Kw）。
在一般两相体系中，可以假设α和Pi约等于100，则可以推导出（公式见文献1）K＞2500Kw，这从理论上解释了为什么蛋白水解酶在有机溶剂中会催化肽合成反应。
3.水解反应是合成肽的竞争性反应，水解反应强弱直接影响肽合成产率。
在有机介质中合成小肽的关键问题是在实践中如何提高肽产物收率。
目前，酶合成多肽较常采用的方法有两种：
（1）通过热力学控制的平衡合成（特点：
通过控制温度、有机辅助溶剂、形成不溶产物改变反应平衡，速度较慢）。
在热力学控制的肽合成中，最佳pH相对较低，这是因为在pH提高使非质子化亲核体浓度增加的同时羧基组分的离子化程度也会增加，两者相互平衡的结果使pH不可能太高。
（BlancoRM文献23[12]）
（2）通过动力学控制的非平衡合成，首先是N-保护的氨基酸酯与酶快速反应形成活泼的酰基化酶中间体，此中间体迅速与亲核试剂（氨基酸酯或氨基酸酰胺）进行转酯化反应生成肽。
在动力学控制的肽合成中，进攻酰化酶中间体的亲核体一般不带电荷，当溶液pH高于亲核体pKb两个单位时，亲核体会有98％去质子化，利于平衡向肽键形成反向移动。
然而pH值过高，[OH]浓度增加又会导致水解反应发生。
（WilsonSA文献23[15]）
三．影响酶（木瓜蛋白酶）有机相催化肽合成的因素
A酶本身
（一）酶的制备
1.NoritomiH[]在有机溶剂中，酶活也是制备方法的函数，制备方法还会影响酶的其它催化性质。
这是因为蛋白质脱水冻干后构象会发生不可逆变化，制备方法不同会形成不同的构象。
2.ZaksA.[]发现酶在有机溶剂中能保持酶冻干前一定pH和离子强度缓冲液的构象，两者最适pH一致，这称为酶的“记忆”功能。
因此可以通过在酶冻干前加入底物类似物等配体可将酶的催化构象“锁住”，使之高活性构象形式在有机溶剂中得以保持，以增加酶的活力，这种技术称为分子印迹（molecularimprinting）。
在水溶液中，这种印迹则容易失去。
KDabulis.[]研究了四种蛋白酶和三种脂肪酶发现，酶与配体共存的水溶液经冷冻干燥，比没有配体的活力大大提高。
配体是指酶的抑制剂或抑制剂类似物，另外一些冷冻干燥剂（lyoprotectants）（如PEG、山梨醇、甘露醇、海藻糖）和附形剂（excipient）也可以起到类似作用。
生物印迹的修饰方法（待查！
参见文献35[14、15、16]）。
3.（文献35[17]）Okahata[]还发现印迹可以提高脂肪酶在无水异辛烷中催化苯乙醇和月桂酸的酯化反应的对映体选择性。
4.因此，制备酶时应使用具有最适pH和离子强度的缓冲溶液溶解在冷冻干燥，以保证有机溶剂中酶的微环境具有最适pH值。
5.在制备酶的过程中，还应注意一些问题：
所使用的酶尽可能纯化，以减少杂质干扰，提高重复性；酶的反应活性与立体选择性受制备过程中酶颗粒聚结的影响很大。
如果先把纯化过的酶溶解于缓冲溶液中，然后再加入有机溶剂，酶不易聚结分散性较好；控制酶的颗粒大小，颗粒小可以增大酶与有机溶剂的界面，提高反应速度。
6.（文献19[18]）FaburK[]发现，同一种脂肪酶，即使不同的来源对pH的敏感程度也不同。
7.（文献7[17]）加酶量对反应速率也会有影响
（二）缓冲液pH和离子强度
1.缓冲液有三个重要因子：
pH、缓冲液类型（注意！
）、缓冲液用量（待查，文献33[16]）。
2.在冻干前，用缓冲液调pH值对提高酶活有一定作用，但复杂的反应体系影响会造成蛋白质表面的电荷重新分布，如酸碱参加的反应。
由于体系中有机相占绝大多数，故直接测定pH值会很困难。
3.由于酶活性基团的离子化状态与活力关系密切，（待查，文献33[18]）用有机相缓冲液（氨基酸－氨基酸氯盐对）控制低水有机介质中的酸碱条件，通过影响酶分子离子化状态来影响酶活。
4.酶催化反应的最适缓冲液pH值和离子强度除与酶本身来源和底物的pK影响，还与载体带电性质有关。
Zhang[]利用固定化木瓜蛋白酶合成各种二肽时发现，不带电荷的载体适于较低的离子强度，而带电荷的载体则需较高离子强度。
B载体
（三）酶的固定化载体和方法
1.在生物体物质的转化中，许多酶是以与膜结合的状态行使功能的，如催化亲酯性化合物转化的酶，此类酶从膜中释放出来后稳定性降低。
尽管可以使用酶粉作催化剂，但效果并不好，原因在于天然酶在有机溶剂中易失活，且酶粉的分散性差，易聚结成团。
在酶浓度高时会出现自溶现象和不易分离的缺点。
酶粉不利于底物和酶分子间的质量扩散。
固定化酶则不仅简化了纯化工艺，利于酶的回收和连续化生产。
还可用于多酶反应体系。
固定化酶有利于提高其在有机溶剂中的扩散效果和热力学稳定性，固定化还有利于把反应器设计成大规模的连续反应的填充床反应器。
2.有机相中载体选择与水相中的不同在于需满足酶在有机相反应时的最适微水环境、稳定性及扩散。
载体与溶剂间极性相差越大，酶越不易暴露于有机溶剂，因而失活的可能性越小。
Reslowetal[]提出了LogAq值（分配到载体和溶剂中的水量之比）代表载体的亲水性大小，发现亲水性强的载体不利于酶活力提高。
即使向亲水性强的载体中加水也不足以达到低亲水载体的反应速率。
Adlerereutz[]（文献34[5]）的试验也发现载体亲水性强的不利于酶活力提高。
3.（李继衍[]详见文献46）所述工业上常用的四种固定化方法及常用的酶的形状
固定化生物催化剂的物理形状：
根据底产物性质和酶的反应特点及所用反应器类型的差异，需采用不同物理形状的生物催化剂。
有膜、片、块、纤维、珠、管、微囊等形状。
而且同一材料可以制成不同的催化剂。
其中膜载体具有组装连续运转生物反应器的优势。
4.常见的固定化方法有：
从原则上讲，载体结合法、交联法、包埋法均可用于有机溶剂中催化，但使用较多的使载体吸附法（酶）和凝胶包埋法（细胞）。
（李彦锋[]文献31）工业上酶的四种固定化方法及特点：
a包埋法：
分为网格型和微囊型两类，其制备工艺简便且条件温和，可以获得较高的酶活力回收。
但高分子凝胶或半透膜的分子尺寸选择性不利于大分子底物和产物的扩散
b交联法（架桥法）：
将酶的氨基酸残基与交联剂反应而被固定化，可得酶蛋白单位浓度较高的固定化酶。
但酶活损失大。
c吸附法：
包括物理吸附和离子结合法，工艺简便而且条件温和酶活损失小固定化和纯化可以同时实现。
但酶易脱落。
d共价结合法：
稳定性和重复性高，是目前研究最为活跃的一种方法。
酶活损失大。
共价结合固定化酶较牢固，尤其是多点共价结合在高度活化的载体上的稳定性更强，适于工业上较激烈的反应条件。
但共价结合时，酶活损失较大，而且有时需引入手臂活化，避免载体对底物的空间阻碍。
5.载体对酶催化反应的影响有以下几个方面:
a酶固定在载体上，保护了酶的水化层，稳定了酶的催化构象，从而提高了对有机溶剂的抗性。
SergeevaMV[]发现酶与载体结合的键越多，酶稳定性越高。
b载体LogAq值影响底产物在酶微环境中的局部浓度。
对于疏（亲）水性底物，载体疏水性越强（弱）酶反应速度越快。
原因在于与载体亲疏水性相差较大的底物由溶剂向酶微水相扩散的阻力也较大。
载体的这种性质对受底产物抑制的酶影响较大。
c载体对酶的动力学有直接影响。
即使在酶水合程度一定的条件下，反应的速率也会因载体的不同而有很大差别，可以相差一个数量级。
d酶固定后会部分失活，加入蛋白质和PEG会减弱酶的失活。
6.用于有机介质固定化常见的载体有：
硅胶、硅藻土、玻璃珠、纤维素、微孔陶瓷、凝胶、树脂。
载体的选择在酶的固定化方面具有相当重要的地位，在选择载体时应考虑的因素有：
a首先要考虑载体的表面性质，共价结合时有可活化的基团，酶是否可以吸附在其表面上，载体上是否含有可以固定化的基团，是否要对载体进行化学修饰等。
b载体应具有一定的亲水性。
亲水性较低的载体（如硅藻土）酶活较高，这是由载体与酶之间对水的竞争造成的。
在低水含量的有机溶剂中酶的必需水易被亲水性强的有机溶剂剥夺；在含水量较多的溶剂中，亲水性强的载体会使酶分子活性中心完全被水包围，酰化酶中间体易水解。
提高载体疏水基的含量可以提高酶对疏水底物的催化活性。
c载体的选择是控制酶催化中底、产物浓度的一个有效方法，提高载体疏水基含量可以提高催化剂对疏水底物的活性。
d载体应具有良好的稳定性，对酸碱有一定的耐受性；有一定的疏松网状结构及机械强度，颗粒均匀；可耐受酶及微生物的作用，不致引起变性；廉价易得。
e载体酸碱性强弱也会影响酶的催化活性（文献23[4]NilsonK.[][23]XINGGuo-Wen[]），阳/阴离子交换树脂导致最适pH偏低/高（文献23[15]WilsonS.A.）
f载体孔径与颗粒大小也可能会对反应产生影响。
孔径小、颗粒大的载体易产生较强的传质限制（masstransferlimitation）对酰基供体、亲核体选择性、以及立体选择性都会产生影响。
此外，还应考虑的因素有载体上酶的负载量、载体表面积。
g适当的选择载体能提高酶的选择性。
例如把α-胰凝乳蛋白酶固定在含葡萄糖的微孔玻璃上有利于水解反应，而在含已烷基的微孔玻璃上有利于醇解反应。
h要综合各种因素选择最佳载体。
蔡谨[]研究了几种载体对酶固定化的影响，结构发现，壳聚糖固定化酶的相对比活较高，但其吸附量太小，综合比较异硅藻土为优。
C修饰
（四）酶的化学修饰
1.有机相酶催化反应酶的利用形式一般有三种：
酶粉、修饰酶、固定化酶。
双亲分子PEG共价修饰或二烷基型脂质非共价修饰酶分子表面，可以增加酶分子表面疏水性而均一的溶于有机溶剂。
PEG长链共价结合到酶表面的Lys残基上，在酶周围形成一个水化层，避免了溶剂与酶的直接作用，Yoshimoto[]（文献12[14]）用这种方法制备了在有机溶剂（如苯、氯仿）中完全可溶的酶。
Takahashi[]（文献12[15]）只要为酶的水合提供适量的水，PEG修饰酶在有机溶剂中就能保持一定的活性。
2.G.Ottolina.etal[]研究了脂蛋白脂酶以酶粉、PEG修饰酶（又分三种）、硅藻土吸附酶不同的形式加入甲苯中其酶活的变化。
发现酶的形式对活性有极大的影响。
D溶剂反应体系内的性质
（五）溶剂性质
1.按催化介质的不同对反应体系进行分类，有以下几种：
无溶剂
体系
低共溶多相混合体系（详见文献9[24～26]）（Heterogeneouseutecticmixtures）
溶
剂
体
系
有
水
溶
剂
体
系
纯水溶剂
单一的水相体系，产物以沉淀形式析出，但水解副反应竞争强烈，酶用量相对较多，产物覆盖在酶周围造成扩散限制，因此在工业上应用受到限制。
但Haensler[]报道通过冷冻反应体系可以抑制副反应。
在水相中加入盐、聚醇、糖也可以降低水解活性。
单相
体
系
单相共溶剂体系：
采用与水互溶的有机溶剂（如甲醇、乙醇、丁二醇、丙酮、乙腈（jing）、二甲亚砜（DMSO）、DMF、THF、二甲替甲酰胺、二氧六环等）。
若同时加入甘油等多元醇可通过减少水活度增加酶的稳定性。
LozanoP[]（详见参考文献23[16]）在一般情况下，肽收率在一定范围内随有机溶剂浓度的增加而增加，而且有机溶剂亲水性愈强最佳浓度愈大，酶催化活性愈高。
相对两相体系来说由于酶与有机溶剂接触面积大更易使酶失活。
两
相
体
系
一般两相体系：
采用与水不互溶的有机溶剂（如脂肪醇、丙醇；酯、乙酸乙酯；乙醚、二异丙基醚；氯代烷烃、二氯甲烷、三氯甲烷、氯仿；烃类、环己烷、异辛烷）时，一般也是疏水强的有机溶剂有利于酶活。
这种体系适于水溶性差的底物（如固醇、脂肪），底物不断从有机相进入水相，产物不断从有机相中析出。
特点：
体系易构建，产物易与酶分离，避免了水解反应和产物抑制。
但该体系在塔式体系中会出现沟流，在工业应用上有一定难度。
低水溶剂体系－ Microaqueousmedia（如正己烷、环己烷、二氧杂环己烷、辛烷、氯仿、苯等脂肪烃和芳香烃）。
相对来说，低水溶剂体系对有机合成特别有利，因为产物的回收和酶的重复使用特别容易。
优点：
易构建，特别适于非常疏水的溶剂体系，适于较高温度的反应。
混合有机溶剂体系（文献23[18、19]）
三
相
体
系
反相胶束体系（reversedmicelles）（文献5）优点：
胶团内部为酶催化提供最佳微环境，胶团体系是透明的和热力学上稳定的，方便用光学方法跟踪酶反应进程，适于疏水化合物的酶促合成和转换。
非水体系
均相
体系
超临界流体（参见相关文献,很多！
）
2.从宏观上看，有机溶剂的极性是对酶活最主要的影响因素：
Laane[]用LogP（一种有机溶剂在正辛醇-水两相溶液中分配系数的对数）作为衡量有机溶剂极性的指标，研究100多种溶剂的LogP值与酶活的关系后发现LogP＞4时是理想的介质，LogP＜2则极性太强，并指出在常用有机有机中只有约1/5可用于酶促反应。
3.但也有不少例外的情况，说明LogP并非选择溶剂的唯一标准。
（参见Clapes[]文献17[12]）。
参见文献33[8、9、19]的观点。
同时参见（文献34[4]）也有例外的情况，即溶剂的亲疏水性不仅影响酶分子表面必须水的多少，同时也通过影响溶剂在必须水中的浓度间接影响酶活。
而两者随溶剂亲疏水性变化对酶活的最终影响是相反的。
4.GololobovMY[]认为在酶促合成肽反应中，对不同的酶来说适宜的有机溶剂体系是不同的。
改变有机溶剂的类型，不同酶反应速度可能朝相反方向变化，说明不同酶在催化中与有机溶剂作用的反应机理不同。
5.溶剂影响酶活性的机理：
a酶的几个不可逆失活过程（脱氨基、水解、胱氨酸分解）都需要水。
有机溶剂中此类反应影响较小，使得酶的稳定性提高
b夺走吸附在酶分子上的水份，或者在两相界面直接与酶（活性中心）接触而使酶失活。
c溶剂改变底物或酶底物复合物的能级从而改变酶反应的活化能
d溶剂直接与底、产物分子发生反应或影响其在水相和有机相中的分配而改变其在酶分子表层中的浓度（这对受底、产物抑制的酶尤为重要）
e有机溶剂还可通过影响底、产物的扩散从而影响酶活。
6.选择溶剂时应注意：
a溶剂对反应是惰性的。
例如，醇与酯间的酰基转移反应，不能用醇或酯作为溶剂。
b溶剂对底、产物溶解性好，利于其扩散
c一般说来，亲（疏）水性底物选择疏（亲）水性溶剂进行反应，这可能是由底物在酶的微环境和溶剂间分配不同造成的
d亲水底物在疏水性较强的溶剂中易进入酶的疏水袋，因此亲（疏）水性底物应选择疏水性较强（弱）的溶剂。
但考虑到亲水性氨基酸底物在疏水性有机溶剂中溶解度很低。
例如，酶催化糖修饰反应必须在亲水性与水互溶的溶剂中进行，否则底物不会溶解，酶促反应不能发生。
（注意！
！
！
有点矛盾）
e产物与溶剂的互溶性也很重要，极性产物长分散在酶的周围，造成抑制作用。
例如，Fitzpatrick.P.A.etal.[]催化多酚氧化的反应，产物醌在正己烷中不溶并在酶周围的水层中发生聚合（酶表观失活），而以氯仿作溶剂时，醌易分配到溶剂中，故酶不失活。
溶剂还会影响酶的对映体选择性。
f溶剂的毒性、成本、密度、粘度、表面张力、废物的处理及产物从溶剂中分离的难易。
7.仿水溶剂Kitaguchi.Hetal.[]研究嗜热杆菌蛋白酶合成肽。
仿水溶剂（water-mimickingsolvent）――甲酰胺、二甲基甲酰胺（DMF）、乙二醇、甘油、四氢呋喃可与酶分子形成氢键，起到一定的调节酶活性与选择性的作用，尤其是对水特别敏感的肽合成反应。
（六）体系水含量与水活度
1.水是影响酶稳定性和对映体选择性的重要因素之一。
研究非水相酶促反应中的水作用，常使用体系最佳加水量、酶分子表面必需水含量、水活度三个参数。
一般说来，在有机溶剂中随着水含量增加酶稳定性减弱，而减小水的活度有利于肽键的生成。
2.是，各种水活度的测定故方法均容易产生较大的误差，原因在于：
a在反应体系中水分子通过扩散达到平衡状态是一个动态的过程，很容易受到反应体系的影响而发生变化。
通常假设水在反应体系中很快达到平衡：
在混合体系中，RupieyJA[]（文献34[9]）水的分散过程只是在近距离的移动和分散；而在非混合体系中，由于蛋白质的水合作用具有明显的滞后性水的分配在短时间很难达到平衡。
b在处理样品时不可避免的水份的挥发和吸附在容器的器壁上，使水份很容易重新进行二次分配。
5.水活度的控制：
虽然水活度不容易精确测定，但是，在有机相反应中连续控制水活度可以提高反应产率和反应速率。
有关控制方法的报道如下：
aHalling（文献34[15]）加入具有缓冲作用的水合盐的方法，由于不同水合盐代表不同的水活度，故只要向反应体系中加入不同水合盐（常为0.2g/ml）就可以产生不同的水活度。
bKvittingenL.etal.（1992）常见的获得恒定水活度的方法是向干燥的反应混合物中加入一种盐的高水合物（NaSO4/NaSO4·10H2O），是一种很好的水活度缓冲剂。
但是水合盐可能会对酶活产生影响（文献34[3]）。
c（注意文献6中[14]相关叙述！
！
！
也见文献19[13]）对于酯合成和肽键形成的反应，体系中水的积累会降低酶活性，在体系中加入乙基纤维素、分子筛可以有效去除多余水份。
E底产物性质
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