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蛋白质结构原理
蛋白质结构原理
[引言]
蛋白质工程是20世纪80年代初诞生的一个新兴生物技术领域。
其时，结构生物学揭示了大量蛋白质分子的精确立体结构及其与复杂生物功能的关系，为设计改造天然蛋白质提供了蓝图；同时分子遗传学发展了以定位诱变为中心的基因操作技术，为通过基因修饰改造蛋白质提供了工具。
这两方面的融合，促成了蛋白质工程这一新兴生物技术领域的诞生。
1982年，Winter等首次报道通过基因定位诱变获得改型酪氨酸tRNA合成酶；1983年，Ulmer在“Science”上发表以“ProteinEngineering”为题的专论，一般将此视为蛋白质工程诞生的标志。
蛋白质工程的主要内容和基本目标：
以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系为基础，通过有控制的基因修饰和基因合成，对现有蛋白质加以定向改造，设计、构建并最终生产出性能比自然界存在的蛋白质更加优良、更加符合人类社会需要的新型蛋白质。
这是第一代遗传工程。
基因工程原则上只生产自然界中已存在的蛋白质。
作为基本的生命物质，天然蛋白质都是在生命有机体中进化和发展的，经大自然精雕细刻所形成的优异结构与性能只在这一特定环境中具有最佳状态。
而对人类的社会生产和生活，常常必须在非生命与非自然的状态下广泛应用蛋白质，这就必须对天然蛋白质加以适当的改造方可获得最佳的结构与性能。
如许多工业酶，必须改变天然酶的特性（如热稳定性、最适温度、最适pH、对蛋白水解酶的抗性、底物结合特性、底物和反应专一性等），方可适应生产和使用的需求。
蛋白质工程研究通过定位的或有控制的基因修饰，提供改变蛋白质结构与性能的最有效的实用方法和技术途径，使天然蛋白质的改造成为可能。
同时，结合蛋白质结构与功能关系的研究和蛋白质折叠机制的研究，通过基因合成，蛋白质工程有可能制造出结构和性能全新的蛋白质。
以上述为基础，与基因工程有关技术的紧密结合，蛋白质工程正在形成以改造现有蛋白质和制造新型蛋白质为中新的第二代遗传工程。
与此同时，蛋白质工程作为一种新型的强有力的研究手段，蛋白质工程对一些基本生物学问题的研究和解决，发挥了重要的作用。
从酪氨酸tRNA合成酶开始，蛋白质工程被广泛应用于研究各种蛋白质的结构与功能、蛋白质折叠、蛋白质分子设计等一系列基本分子生物学问题。
由于基因定位诱变的自如性，时这方面的工作突破了过去所用方法的局限性，达到前所未有的深度和广度。
蛋白质工程对于揭示生命现象的本质和生命活动的规律具有重大意义。
随着这一领域的不断开拓和发展，大量性能优良的新型蛋白质将被生产出来，并广泛应用于医药、工业、农业、环境保护等方面。
蛋白质工程的基本目标：
按预期的结构和功能，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质加以定向改造，设计、构建并最终生产出性能比天然蛋白质更加优良、更加符合人类社会学要的新型蛋白质。
第一节蛋白质结构的基本组件
学习目的：
各类蛋白质组件是构成蛋白质分子的基本要素，也是设计和构建新蛋白质的主要基础。
一、20种天然常见氨基酸
1．基本结构：
19种氨基酸的化学通式，1种脯氨酸主链为N原子。
甘氨酸的侧链只有一个氢原子使蛋白质出现有甘氨酸的地方具有显著的构象柔性（flexibility）。
2．基本性质：
疏水氨基酸；极性氨基酸；荷电氨基酸
3．单一构型和旋转异构体：
（1）构型（configuration）与构象（confirmation）：
构型：
是一个分子中原子的特定空间排布，构型的转变需有共价键的断裂和重新形成。
最基本的构型有L型和D型。
构象：
组成分子的原子或基团绕单件旋转而形成的不同空间排布。
（2）天然氨基酸的单一构型：
与蛋白质结构组织上表现出来的选择性和择优性有密切关系。
（3）优势构象与旋转异构体：
交错构象（staggedconfirmation）：
是能量上最有利的排布，一个碳原子的取代基正好处于另一个碳原子的两个取代基之间。
旋转异构体：
大多数氨基酸残基的侧链都有一种或少数几种交错构象作为优势构象出现在天然蛋白质中，称为旋转异构体（rotamer）。
二、肽单位和多肽链
1．肽链和肽单位
（1）肽键（peptidebond）与多肽：
肽键：
一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基经缩合反应形成的共价连接。
肽链（polypeptidechain）：
通过肽键将多个氨基酸连接在一起构成。
N端：
多肽链的第一个氨基酸具有自由的NH2，称为氨端或N端。
C端：
最末一个氨基酸的羧基是自由的，称为羧端或C端。
主链（mainchainorbackbone）：
多肽链种由肽键连接的部分，在所有氨基酸中都相同。
肽键不能旋转，因此具有顺式和反式结构。
（2）肽单位和多肽主链：
肽单位（peptideunit）：
局部双键的性质使其连接的基团处于同一平面，具有确定的键长和键角，是多肽链中的刚性结构。
多肽链主链：
有序连接的肽单位就是多肽链的主链。
2．多肽链的构象：
扭角（torsionangle）或双面角（dihedralangle）：
多肽链的构象角：
Ramachandran构象图（简称拉氏构象图）及多肽链构象的允许区：
最先由印度人Ramachandran利用这一方式计算多肽链构象的允许区。
三、α螺旋
1951年美国加州理工大学LinusPauling首先提出α螺旋并预言它稳定存在于蛋白之中。
1．基本结构参数
2．螺旋偶极子
3．两亲性（amphipathicity）螺旋：
许多α螺旋的一侧主要分布着亲水（荷电、极性）残基，另一侧主要集中疏水残基，并按螺旋旋转周期规律地相间分布，使之产生两亲性。
可用螺旋转轮（helicalwheel）预测。
4．倾向于形成α螺旋的氨基酸
Ala、Glu、Leu、Met；反之，Pro、Gly、Tyr、Ser。
5．310螺旋和π螺旋
四、β层
1.β链
β层（β-sheet）：
基本单位是β链，它在多肽链中具有几乎全伸展的构象，可视为每圈具有2个氨基酸残基和每个残基有0.34nm平移距离的特殊螺旋。
由序列上离得很远的（分子内）或不相关的（分子间）不同多肽链区域组合而成的。
2．平行β层和反平行β层
β层中的肽链可以平行盒饭平行方式相互作用，在蛋白质结构中形成平行层（parallelβ-sheet）和反平行层（antiparallelβ-sheet）两种基本类型。
在蛋白质结构中，所有平行β层、反平行β层和混合型β层中的β链都是沿其前进方向不断扭转的肽链（twistedstrand），从而使蛋白质结构中出现扭转层，具有手性。
五、环肽链
相对刚性的α螺旋和β层组合构成蛋白质的完整三维结构时，必须由环状肽链相连接。
1．回折（reverseturn）：
使其所连接的肽链发生180℃急转弯。
（1）β转折（βturn）是由四个氨基酸残基顺序连接的一段短肽链，具有180℃弯折的特殊构象。
4→1氢键：
标准β转折的第四个残基（i+3）NH与第一个残基（i）的C′=O间的氢键。
β转折三种类型及对映体：
Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型；Ⅰ′型、Ⅱ′型、Ⅲ′型。
γ转折（γturn）：
有三个氨基酸构成的转折。
2．β发夹
（1）β发夹（hairpin）：
通过一段短的环链将两条相邻的β链连接在一起的结构。
经常出现在蛋白质结构中参与配体—复合体结合、酶的活性中心等重要功能。
（2）β凸起（β-bulge）:
在两个连续β型氢键之间的一个凸起区域，一股链上的两个残基对着另一股链上的一个残基。
3．环肽链的构象和优势氨基酸
环肽链一般都暴露在溶剂中含有较多的荷电和极性亲水残基；在环链区经常出现一些氨基酸残基的插入和删除，难于有稳定构象；短的环肽链具有明显的构象选择性。
由于环肽链是连接二极结构元素的主要结构因素，在确定蛋白质三级结构时，环肽链构象的确定具有基本的意义。
同时，由于环链区常常出现在生物活性位置，构建其三维结构也具有功能上的意义。
六、疏水内核
蛋白质结构具有一个共同的特征：
分子内都有一个疏水内核，由紧密堆积的疏水侧链构成。
蛋白质的内核疏水同有机分子的油-水分离现象类似，但其密堆积特性使之具有更大的能量稳定性。
疏水内核还是推动以二级结构为基础的蛋白质分子骨架形成的重要因素。
分子骨架中的结构组件只有很小的柔性，是蛋白质分子最固定的部分。
疏水作用（hydrophobicinteraction）：
指非极性基团在任何极性环境中强烈趋于彼此聚集的择优效应。
疏水作用在本质上是一种能量效应，是一个从高能态趋于低能态的自动发生过程。
第二节蛋白质结构的组织和主要类型
蛋白质的基本结构组件在三维空间中一非常转一的方式组织、结合在一起、构成特定的三维结构，形成功能性蛋白质分子。
与其它分子结构比较，具有复杂的结构层次是蛋白质结构组织的基本特征。
在每个结构层次中具有多种结构模式，在不同结构层次的组合中具有多样组装方式，为蛋白质结构和功能多样性的形成提供了基本途径。
近年发现，结构域（domain）是蛋白质结构和功能的基本单位。
尽管蛋白质分子外貌具有多样性，但结构域只表现出有限的类型，据此可进行蛋白质分类。
学习目的：
蛋白质结构层次和类型的知识是设计和构建新蛋白质的基本蓝图。
一、蛋白质结构的层次体系
丹麦生物化学家KaiLinderström首先将蛋白质结构划分为一级、二级、三级结构；之后，英国化学家Bernal又使用四极结构来描述复杂多肽链蛋白质分子的亚基结构。
在二级结构和三级结构之间又发现了结构模体（超二级结构）和结构域，从而揭示了蛋白质结构的丰富层次体系（structurehirarchy）。
聚合体
↑
球状蛋白
↑
结构域/亚基
↑
模体（超二级结构）
↑
二级结构
↑
氨基酸序列
1．一级结构（primerystructure）
一级结构指多肽链中的氨基酸顺序或氨基酸沿线性多肽链的排列。
在有二硫键的蛋白质结构中，一级结构的内容也包括二硫键的数量和配对方式。
一级结构是决定更高层次结构的主要因素。
同源性（homology）：
两个或两个以上不同蛋白质一级结构具有显著相似性。
2．二级结构（secondarystructure）
如果多肽链规则折叠，在一段连续的肽单位中具有统一酰对取向，可以用相同的构象角（Φ,Ψ）来表征，构成一种特征的多肽链现行组合，称为蛋白质的二级结构。
在天然蛋白质中已经观察到的二级结构包括α螺旋、平行β层、反平行β层，β转折、310螺旋。
二级结构的规则构象主要被其内部形成的主链氢键所稳定，因此氢键的排布方式也是二级结构的重要特征。
3．结构模体（motif，structuremotif）
在蛋白质结构中，一级顺序上相邻的二级结构在三维折叠中也靠近，彼此按特定的几何排布形成简单地组合，以同一结构模式出现在不同的蛋白质中，这些组合单位称为结构模体。
结构模体是一类超二级结构，许多模体没有专一的生物功能，只是大结构和组装体的一个组成部分，有的模体于特定功能相关，如与DNA结合。
大多数已发现的模体都是α螺旋、链域环肽链（包括转折肽）的组合，其基本组合类型为（ααα）、（βββ）、（βαβ），但由此衍生出组合方式的多样性。
（1）螺旋—转折—螺旋模体[helix-turn（loop）-helixmotif，HTH]
具有特定功能的最简单的模体是由一个环区连接的两段螺旋组成。
HTH有专一地与DNA结合的DNA结合模体（DNAbindingmotif）及专一地与钙结合的钙结合模体（calciumbindingmotif）。
E、F手：
HTH钙结合模体出现在小白蛋白（parualbumin）、钙调蛋白（calmodulin）、肌钙蛋白（troponin-C）中及其他与钙结合蛋白中。
构成模体的两段螺旋在整体结构中命名为E、F手（EFhand）。
（2）发夹式β模体（hairpinβmotif）
两段相邻的反平行β链被一环链连接在一起构成的形似发夹的结构，也称ββ组合单位（ββunit）。
（3）反平行β层回纹模体
4段反平行的β链常常以特定的来回往复方式组合，通过长的反平行结构以特定的折叠方式形成的。
（4）β-α-β模体
这是连接两股平行β链的结构元素组合。
在这一模体中，α螺旋将一股β链的羧基端与另一股β链的氨基端连接起来，通常螺旋轴近似地平行于β链。
在这种模体中，除了两股β链和一段α螺旋外，还必须有两个环链区。
两个环链区具有不同的作用，一般连接β链的羧端与α链的氨端的环肽链常常是蛋白质功能结合部位或活性位置的组成部分，在同源蛋白质中是保守的；另一个连接螺旋C端和第二条β链N端的环链，至今未发现它有任何生物活性相关作用。
（5）复杂模体（complexmotif）
两个相邻的β发夹型模体通过环链相连，可构成更多复杂的模体。
组合方式24种中有8种被观察到，而且全部都是以4股链反平行方式组合。
4．结构域
二级结构和结构模体以特定的方式组织连接，在蛋白质分子中形成两个或多个在空间上可以明显区分的三级折叠实体，称为结构域。
一个分子中的结构域区之间一共价键相连接，这是与蛋白质亚基结构（非共价缔合）的基本区别。
5．三级结构
结构域在三维空间中以专一的方式排列组合，或者二者结构、结构模体及其与之相关联的各种环链在空间中的进一步协同盘曲、折叠，形成包括主链、侧链在内的专一排布，这就是蛋白质的三级结构。
6．四级结构（quaternarystructure）
这个概念最早是指蛋白质分子的亚基结构。
完整的蛋白质活性分子有两条以上的肽链各自以独特的一级、二级、三级结构相互以非共价作用联结。
蛋白质四级结构的内容：
亚基的数目、类型、空间排布方式、亚基间相互作用的性质，蛋白复合体、组装体及其所有三级折叠单位的组合方式。
水是构成蛋白质结构和功能整体的有机组成部分。
二、蛋白质结构分类
1．按结构域分类
（1）α型结构
（2）β型结构
（3）α/β型结构
（4）α+β型
（5）无规型/富含二硫键和金属离子型
2．系统分类
按蛋白质层次体系进行分类的新方法、新程序。
数据库有SCOP（StructureClassificationofProtein）、CATH（Class,Architecture,Topology,HomologousSuperfamily）、DALI/FSSP（FoldclassificationbasedonStructure-Structurealignmentofproteins）/DDD（DALI DomainDirectionary）。
相关Website：
PDB:
http:
//www.rcsb.orgSCOP:
http:
//SCOP.mre-.ac.uk/SCOP
CATH:
http:
//www.biochem.ucl.ac.uk/daliDALI:
http:
//www2.embl-ebi.ac.uk/daliFSSP:
http:
//www2.embl-ebi.ac.uk/dali/fssphttp:
//www.bioscience.org/urlists/protdb.htmhttp:
//www2.ebi.ac.uk/msd/Links/fold.shtml
三、三类主要蛋白质结构
即α型结构、β型结构、α/β型结构。
1．型结构（αdomainstructure）
（1）线绕式α螺旋（coiled-coilαhelix）：
在蛋白质中α螺旋被稳定的最简单方式是两股螺旋通过疏水侧链彼此堆积在一起，使侧链间的相互作用达到最大程度。
其长度可达到几百个氨基酸残基，形成长而有柔性的二聚体，产生纤维的足够长度和挠性。
线绕式α螺旋指两股α螺旋彼此缠绕，象两股线缠绕成一股绳索似的超盘绕（supercoil）排布。
七联重复体（heptadsrepeat）：
线绕式α螺旋每圈包含的残基为3.5个，因此每经7个残基后侧链的作用完全重复，这一结构特征反映在序列上就称之为七联重复体。
七联重复体主要在血纤蛋白原、一些RNA和DNA结合蛋白、一类称为集合素（collectin）的细胞表面辨识蛋白、肌动蛋白等。
（2）四螺旋束（fourhelixbundle）
是蛋白中常见的一种域结构，由四股螺旋排布成一束状结构，其间各段螺旋的轴向近似平行，称为四螺旋束。
这种结构中的疏水残基被包埋在螺旋之间，亲水残基暴露在束体表面，这使其束水侧链沿螺旋长度堆积，在束体中心形成疏水内核。
组合方式：
1相邻螺旋全部反平行。
2两对平行螺旋以反平行方式连接。
3两组线绕式螺旋通过侧链相互作用堆积在一起。
（3）球状折叠（globinfold）
是一类8段α螺旋组合，彼此被短环链区连接，螺旋通过特定的空间排布形成活性位置。
是最重要的一类α螺旋。
存在于一大组蛋白质中，同源性较高，显示了在蛋白质进化过程中，三维结构比氨基酸序列更为保守，为更本质地辨识分子进化关系提供了新指标。
（4）复杂螺旋组合
已知一些酶含有300-400个氨基酸残基的长多肽链，它们形成20多个螺旋，彼此堆积形成球结构域。
2．α/β型结构
基本特征是：
以平行的或混合的β层为中心四周围绕α螺旋。
大量的酶分子都属于这类结构。
所有的α/β型结构都是β-α-β模体。
基本类型：
TIM桶式折叠、扭转开放式折叠、马蹄式折叠三种。
（1）TIM桶式折叠（TIMbarrele）：
核心结构是折叠成桶状的平行β层，其中的β链被位于外沿的α螺旋连接。
这以结构域首次发现在丙糖磷酸异构酶（triosephateisomerase）的晶体结构中，因此以此英文名及其外貌特征来命名。
β层象一个封闭的桶，一般要多于4股β链才能形成闭合的结构。
在目前观察到的TIM桶式结构中都包含8股平行β链，少数10股。
主要存在于酶蛋白中。
在α/β桶状结构中，β链和α螺旋形成酶分子的结构框架，环链区决定分子的活性。
（2）开放扭转式折叠（rossmanfold）：
基本特征是一个开放的扭转β层两侧被α螺旋围绕，也称Rossman折叠。
在这一结构中，连接两条β链与α环链之间在β层的羧端形成一缝隙，几乎所有这类蛋白质的结合位置都在这一缝隙中。
（3）马蹄式折叠（horseholdfold）：
由富含亮氨酸模体（leucine-richmotif）串联式组合而成。
这类结构的一个代表是核糖核酸酶抑制剂的晶体结构，在链的末端由两个短的非同源序列。
亮氨酸在两种重复模体的序列中有规律地出现，具有重要的结构作用。
一个右手型β-环链-α结构作为基本单元重复出现，彼此以类式桶状结构的方式连接，形成一个平行的β层，所有α螺旋都位于这一β层的一侧。
3．β型结构
反平行β结构是第二大类蛋白质域结构。
其核心是以反平行方式排列的β链，数量从4股、5股、10股以上不等，形成相互连接和堆积的两个β层，它们以常有的扭转方式形成类似圆桶状结构，在桶内有一个由侧链构成的疏水核心。
分为上-下桶式、开放式折叠、希腊钥匙（回纹）式折叠、β螺旋折叠。
（1）上-下β桶（up-and-downβbarrel）和上-下开放式β层（up-and-downopenβsheet）：
结构特点是β链以反平行的上-下方式顺序连接起来，直到最后一股链与第一股链以氢键结合，形成一个类似桶状的结构。
例：
神经氨酸酶
（2）希腊月式（回纹）式β桶折叠（Greekkeyβbarrel）：
在这类结构中，β以反平行方式折叠成两个分开的β层，它们彼此堆积形成一个变形的圆桶状，其间β链1、2、3、4和5、6、7、8分别形成希腊钥匙形（回纹）模体。
例：
γ晶体蛋白
有一类的β链间连接横穿圆桶的两端，也称面包圈式β桶（Jerryrollβbarrel）。
例：
大多数球状病毒的衣壳蛋白、植物凝集素（伴刀豆球蛋白A）、流感病毒中的血凝素蛋白。
（3）平行β螺旋折叠（parallel-β-helixfold）：
是一种较新的折叠类型，于1993年在细菌果胶酶中被发现，随后在其它蛋白质中也被发现，如胞外细菌蛋白酶、噬菌体P22尾棘（ji）蛋白等。
在这些β螺旋结构中，多肽链卷曲折叠为由β链与环链区相间构成的宽松螺旋。
1双层β螺旋（two-sheetβhelix）：
最简单，每圈螺旋由两股β链与两段环链区相间构成。
形成结构域时这一基本结构重复三次，产生一个右手缠绕螺旋结构，它由两个相邻的三股β层及其间疏水内核组成。
与α/β结构类似，区别在于：
第一、在β螺旋中连接β链的单位是环链—β链—环链，而α/β结构是环链—α螺旋—环链。
第二、β螺旋只有两个平行的β层，而α/β结构是β层与一堆α螺旋相邻。
第三、在β螺旋中β层近乎平面并形成平直的壁层，而α/β结构中β层都是扭转的。
2三层β螺旋：
出现在果胶酶与P22尾棘蛋白中更为复杂的β螺旋。
其每圈螺旋具有三段含3~5个氨基酸残基的短β链，彼此由环链连接。
第三节蛋白质结构的形成—多肽链的生物合成与折叠
学习目的：
了节复杂蛋白质的形成机理，对于以设计和构建新型蛋白质为目标的蛋白质工程的战略性考虑和具体途径的选取，都有十分重要的意义。
蛋白质在体内大致可分为两个阶段：
多肽链的生物合成——在遗传密码的指导下将氨基酸按特定序列在核糖体上连接起来，形成只有一维结构（氨基酸序列）的多肽链。
蛋白质折叠——合成的多肽链以现在尚不清楚的机制自动折叠成特定的三维结构，形成具有完整结构和功能的蛋白质分子。
一、多肽链的生物合成
一级结构：
蛋白质分子拥有的多肽链的数量、组成氨基酸的序列以及链间或链内共价连接的方式。
主要环节：
基因携带规定氨基酸序列的核苷酸三联体遗传密码；双链DNA分子的遗传信息转录到单链mRNA；mRNA在核糖体上的翻译。
1．遗传密码与基因
遗传密码：
在所有有机体中，合成蛋白质一级结构的所有信息都是以三联体核苷酸的形式编码在染色体的遗传物质DNA上，这种三联体密码即遗传密码。
4种核苷酸是：
A/T（U）/G/C。
基因：
一段特定的DNA或RNA区域编码一个蛋白质的一级结构，在这一区域的两侧还有一些片段参与该遗传信息的调节和表达，它们共同组成DNA或RNA的一个功能单位，称为基因。
上游：
下游：
顺反子：
外显子：
内含子：
密码子：
遗传密码的简并性：
摆动配对：
2．编码信息的转录
真核生物RNA聚合酶的功能：
RNA聚合酶ⅠⅢⅡ
启动子：
增强子：
3．编码信息的翻译
二、多肽链的折叠——蛋白质三维结构的形成
1．蛋白质折叠的热力学：
天然蛋白质的三维结构取决于氨基酸序列一级结构决定高级结构的原理：
即天然态三维结构是由各种组成原子间相互作用（氨基酸序列）决定的。
蛋白质复性：
在不同的环境（溶剂、pH值、离子强度、温度以及其它成分的存在）条件下可使蛋白质变性，变性蛋白质恢复生物活性与功能的过程称为复性。
天然稳定性脆弱焓与熵
2．蛋白质折叠的动力学
（1）动力学途径在蛋白质折叠中的重要性和问题：
蛋白质分子在体外和体内的折叠只需要0.1~1000s的短时间，在折叠过程中必须有一定的动力学途径指导其折叠过程，避开无规构象的取样。
因此，动力学途径具有极大的重要性。
动力学途径对正确折叠产生的障碍：
中间体通过外露疏水基团的聚合；不正确二硫键的形成；脯氨酸残基的异构化。
（2）熔球态是折叠的中间体，疏水侧链内埋是重要驱动力：
熔球体（meltonglobule）：
柔性无序的未折叠多肽卷折成局部有组织的可观侧中间体。
特性：
具有天然态的大多数二级结构，不如天然结构致密，蛋白质内部的密堆积相互作用尚未形成，侧链是活动的。
疏水侧链的包埋驱动非折叠态卷折产生熔球体的过程包含了蛋白质折叠的主要奥秘。
（3）蛋白质折叠可采取多途径：
3．协助折叠的蛋白质和酶
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