原创紫外分光光度法应用讲座1.docx

原创紫外分光光度法应用讲座1.docx

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原创紫外分光光度法应用讲座1

一定性分析

判断异构体：

紫外吸收光谱的重要应用在于测定共轭分子。

共轭体系越大，吸收强度越大，波长红移。

如：

    和

　　前者有紫外吸收，后者的lmax<200nm。

同样，CH3COCH2CH2COCH3的最大吸收波长要短于CH3CH2CO-COCH2CH3。

下面两个酮式和烯醇式异构体中，烯醇式结构的摩尔吸光系数要远大于酮式，也是由于烯醇式结构中有双键共轭之故。

　　　　　　　　CH2COCH2COOC2H5　　　　　　　CH3C（OH）=CHCOOC2H5

酮式（lmax=275nm,e=100）　　烯醇式（lmax=245nm,e=18,000）

判断共轭状态：

可以判断共轭生色团的所有原子是否共平面等。

如二苯乙烯（ph-CH=CH-ph）顺式比反式不易共平面，因此反式结构的最大吸收波长及摩尔吸光系数要大于顺式。

　　顺式:

lmax=280nm,e=13,500;反式:

lmax=295nm,e=27,000

已知化合物的验证：

与标准谱图比对，紫外-可见吸收光谱可以作为有机化合物结构测定的一种辅助手段。

[原创]紫外分光光度法应用讲座-2

单组分定量分析

紫外-可见吸收光谱是进行定量分析最广泛使用的、最有效的手段之一。

尤其在医院的常规化验中，95%的定量分析都用此法。

其用于定量分析的优点是：

可用于无机及有机体系。

一般可检测10-4-10-5mol/l的微量组分，通过某些特殊方法（如胶束增溶）可检测10-6-10-7mol/l的组分。

准确度高，一般相对误差1-3%，有时可降至百分之零点几。

  2.1分析条件的选择

    2.1.1溶剂的选择

    2.1.2测定浓度的选择

  2.1.3测定波长的选择  

  2.2定量分析方法

  2.2.1标准曲线法

  2.2.2标准加入法

接下来咱们分别看一下:

2.1.1溶剂的选择

所选择的溶剂应易于溶解样品并不与样品作用，且在测定波长区间内吸收小，不易挥发。

下表为某些常见溶剂可用于测定的最短波长。

可用于测定的最短波长（nm）

常见溶剂

200

蒸馏水，乙腈，环己烷

220

甲醇，乙醇，异丙醇，醚

250

二氧六环，氯仿，醋酸

270

N,N-二甲基甲酰胺（DMF），乙酸乙酯，四氯化碳（275）

290

苯，甲苯，二甲苯

335

丙酮，甲乙酮，吡啶，二硫化碳（380）

2.1.2浓度的选择

溶液吸光度值在0.2-0.8范围内误差小（A=0.434时误差最小），因此可根据样品的摩尔吸光系数确定最佳浓度。

根据吸收定律，（方程1,  2,  3）

　　要使测定浓度的相对误差最小，应满足条件

（1）

　　即吸光度A=0.4343时，吸光度测量误差最小。

（方程1，2，3及要满足的条件1见下一帖）

2.1.3波长的选择

一般选择最大吸收波长以获得高的灵敏度及测定精度。

但所选择的测定波长下其他组分不应有吸收，否则需选择其他吸收峰。

2.2.1标准曲线法

配制不同浓度的标准溶液，由低浓度至高浓度依次测定其吸收光谱，作一定波长下浓度与吸光度的关系曲线，在一定范围内应得到通过原点的直线，即标准曲线。

通过标准曲线可求得未知样品的浓度。

2.2.2标准加入法

样品组成比较复杂，难于制备组成匹配的标样时用标准加入法。

将待测试样分成若干等份，分别加入不同已知量0,C1,C2…,Cn的待测组分配制溶液。

由加入待测试样浓度由低至高依次测定上述溶液的吸收光谱，作一定波长下浓度与吸光度的关系曲线，得到一条直线。

若直线通过原点，则样品中不含待测组分；若不通过原点，将直线在纵轴上的截距延长与横轴相交，交点离开原点的距离为样品中待测组分的浓度。

这一讲就到这里,下一讲我们讲"混合物分析"

[原创]紫外分光光度法应用讲座-3

混合物分析

根据吸光度的加和性，测定混合物中n个组分的浓度，可在n个不同波长处测量n个吸光度值，列出n个方程组成的联立方程组。

如三组分体系：

    A1=e11C1+e12C2+e13C3

      A2=e21C1+e22C2+e23C3

    A3=e31C1+e32C2+e33C3

　　式中eij为在波长i测定组分j的摩尔吸收系数，Ai为在波长i测得的该体系的总吸光度，Cj为第j组分的浓度。

上述方程组的解为

　　　　　　　　　　Cj=Dj/D,  j=1,2,3　　　式中  

          e11e12e13

D=      e21e22e23

          e31e32e33

            A1e12e13

  D1=    A2e22e23

            A3e32e33  

            e11A1e13

  D2=    e21A2e23

            e31A3e33

            e11e12A1

D3=      e21e22A2

            e31e32A3

  　　方法的关键是选择合适的测定波长。

在某一测定波长下其他组分的贡献要小。

分别测定纯组分1，2，3及混合物的吸收光谱，可得A1,A2,A3,e11,e12,e13,e21,e22,e23,e31,e32,e33。

在下一讲我们将讲到如何用紫外法进行平衡常数的测定.[原创]紫外分光光度法应用讲座-4

平衡常数的测定

在化学平衡研究、分子识别中常常需要测定酸解离常数、pH值、氢键结合度等等。

设均一水溶液中酸解离及其与金属的络合平衡如下：

（1）      

（2）        

  （3）    

（4）

由物料平衡，

　　　　[（HL）t]=[HL]+[MHL]+[L-]+[ML]=[HLt]+[Lt]　  （5）　　

　　　　[HLt]=[HL]+[MHL]=[HL]（1+KMHL[M+1）　        （6）　　　　　　

　　　　[Lt]=[L-]+[ML]=[L-]（1+KML[M+]）　　　      （7）　　　　  

由

（1）,（5）,（6）,（7）式得：

  （8）

只考虑酸解离型体的吸收时，酸解离引起的吸光度增加

　∆AL=A-Aun=εL-[L-]+εML[ML]=[L-]（εL-+εMLKML[M+]）=B[L-]　　　　（9）

Aun为低pH下酸性型体HL,MHL的吸收，为一常数。

根据（8）,（9）式，得

      （10）

由此得到

（11）

因此，以[H+]DAL对DAL作图得直线，从直线斜率可求得表观酸解离常数Kaapp：

  （12）

若不加金属离子，只存在酸解离平衡时，（11）式简化为：

（13）

从直线斜率可直接求得Ka。

这一讲到此结束,下一讲我们将讲到  "络合物结合比的测定".再见.

紫外分光光度法应用讲座-5

络合物结合比的测定

通过紫外-可见吸收光谱的测定，可以求得主客体络合物的结合比。

常用以下几种方法。

　1.摩尔比法

　2.连续变换法或Job法

　3.斜率比法

　4.B-H方程（Benesi-HildbrandMethod）  

下面我们来讲一下.

1.摩尔比法

    设有络合反应mM+nY=MmYn，固定一个组分（如M）的浓度不变，改变另一组分（如Y）的浓度，求得一系列[Y]/[M]比，在络合物MmYn的最大吸收波长处测定吸光度的变化。

则开始时，随[Y]/[M]的增加，溶液吸光度线性增加，到达络合物的组成比后，继续增加[Y]/[M]，会有三种不同情况：

　吸光度达到饱和，不再增加。

说明试剂Y无吸收，吸光度的增加只是络合物的单独贡献。

如Fe（III）-钛铁试剂络合物。

　吸光度出现一转折点后继续增加。

说明试剂Y在络合物的lmax处稍有吸收。

如Zn-PAN络合物。

PAN：

1-（2-吡啶基偶氮）-2-萘酚。

　吸光度出现一转折点后呈直线下降。

说明分步生成了摩尔吸光系数小于络合物e的高次络合物。

如Bi-二甲酚橙络合物。

2.连续变换法或Job法

保持金属离子M和络合剂Y的总摩尔数不变，连续改变两组分的比例，并逐一测定体系的吸光度A。

以A对摩尔分数fY=[Y]/（[M]+[Y]）或fM=[M]/（[M]+[Y]）作图，曲线拐点即为络合物的组成比。

但此法对n/m>4的体系不适用。

3.斜率比法

配制两个系列的溶液，其一是络合剂的初始浓度[Y]0保持过量且恒定，改变金属离子M的浓度形成络合物MmYn，测定相应溶液的吸光度，以A对[M]作图得直线1；另一系列是使金属离子的初始浓度[M]0保持过量且恒定，改变络合剂Y的浓度形成络合物MmYn，测相应的吸光度，以A对[Y]作图得直线2。

两直线的斜率分别是SM和SY。

则：

[Y]0过量时，平衡状态下，

　　　　[M]=[M]0-m[MmYn]=0，A=eb[MmYn]=eb[M]0/m　　　    

（1）

A对[M]0作图时直线斜率为　

                    SM=eb/m　　　　　　　　　　　　                            

（2）

[M]过量时，平衡状态下，

　　　　[Y]=[Y]0-n[MmYn]=0，A=eb[MmYn]=eb[Y]0/n　　　　      （3）

A对[Y]0作图时直线斜率为　

                  SY=eb/n　　　　　　　　　　　　                                  （4）

        则　n/m=SM/SY　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（5）

这一讲此结束,至于"4.B-H方程（Benesi-HildbrandMethod）"由于内容较多,我们放在下一次讲.

再见

[原创]紫外分光光度法应用讲座-6

4.B-H方程（Benesi-HildbrandMethod  

若络合反应、酸碱反应、二聚体生成、主-客体反应等可用反应物A（分析浓度CA）与反应物B（分析浓度CB）按1:

1生成C（平衡浓度）表示，

则平衡常数  :

（1）

以光路长为bcm的吸收池测定该溶液的吸收光谱，波长l下测得的吸光度为D。

各组分的摩尔吸光系数分别以

表示时，

（2）

令:

  （3）

    （4）

则:

（5）

因此:

  （6）

（7）

（8）

代入

（1），得：

（9）

若组分B在l处几乎无吸收（eB=0），使加入的B组分大大过量（CB>>CA），则（9）式简化为：

（10）

变形后得：

（11）

（11）式称扩充的Benesi-Hildbrand方程。

固定组分A的分析浓度，改变组分B的分析浓度并测定相应的吸光度，以CA/（d-d0）对1/CB作图得一直线。

由直线斜率及截距可求得K。

但上式只在CB>>CA或K值较大时成立。

若A和B都无吸收，则（11）式可简化为：

（12）

（12）式称Benesi-Hildbrand方程。

Benesi-Hildbrand方程也适合用荧光法、核磁共振法测定平衡常数。

本来该课程到此结束语,可是后面"分子荧光、磷光和化学发光"内容不太多,就在下一次再讲一次吧.

[原创]紫外分光光度法应用讲座-7

分子荧光、磷光和化学发光

这一节本不属于紫外法应用的内容,不过我还是在此讲一下吧,内容不多.

荧光、磷光和化学发光分析统称为发光分析（luminescence）。

荧光和磷光是分子吸光成为激发态分子，在返回基态时的发光现象，又称光致发光分析（photoluminescence）。

发光分析具有如下特点：

　灵敏度高。

检测限比吸收光谱法低1-3个数量级。

通常在ppb级。

　发光参数多，可进行动力学分析。

而吸收光谱法只能研究基态分子的反应。

　分析线性范围比吸收光谱法宽许多。

　选择性比吸收光谱法好。

能产生紫外-可见吸收的分子不一定发射荧光或磷光。

　由于能进行发光分析的体系有限，故应用范围不及吸收光谱法广。

但采用探针　

　　技术可大大拓宽发光分析的应用范围。

具体内容大家可参考其它的专业书.至此关于紫外的应用就告一段落了,再见