各组均数间差异无显著性；F值>F0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
1.6结果判定
受试样品组与对照组比较，存活时间延长，并具有统计学意义，则判定该实验结果阳性。
1.7注意事项：
1.7.1每个磨口瓶内只放1只小鼠。
1.7.2磨口瓶一定要密闭封严，以防漏气，否则会影响实验结果。
1.7.3磨口瓶必须等容量（误差1ml），实验前先用水加以校正。
1.7.4每批实验动物的体重应尽量保持一致。
2常压缺氧损伤模型实验
2.1原理
在总大气压保持不变的情况下，降低空气中氧的百分含量，机体吸入氧量降低，导致血液中氧含量降低，组织细胞不能从血液中获得充足的氧而使能量代谢障碍，导致重要脏器组织细胞的损伤。
2.2仪器
低氧分压呼吸效应实验系统、血细胞分析仪、可见光分光光度计、酶标仪、微量加样器、恒温水浴锅、普通离心机、混旋器、具塞离心管、组织匀浆器。
2.3实验动物
推荐用近交系成年小鼠，单一性别，体重18－22g，每组10-15只。
2.4实验方法
2.4.1剂量和分组
至少设三个剂量组，同时设阴性对照组和模型对照组二个对照组。
以人体推荐量的10倍为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，最高剂量不得超过人体推荐量的30倍。
2.4.2受试样品的给予
经口灌胃给予受试样品，受试样品给予时间30天，必要时可以延长至45天。
2.4.3实验步骤
2.4.3.1造模方法
每日经口灌胃给予受试样品，阴性对照组和模型对照组给予同等容量溶剂。
将动物每周称重两次，以调整受试样品剂量。
每次给予样品后，将模型对照组与各剂量组的实验动物依次放入常压缺氧装置中，通过充入氮气方法把装置内的氧含量从21%大气氧含量调整下降至10.0±0.5%氧含量，维持此低氧含量处理样品组和模型对照组动物6～8h/天，每周5～6次，连续2～3周。
末次缺氧处理后，采血并取脑进行各项指标的检测。
2.4.4指标检测
体重、血红蛋白含量（Hb）、脑匀浆丙二醛（MDA）、总抗氧化能力（T-AOC）。
2.4.4.1血红蛋白含量测定方法
EDTA·K2能与血液中的钙离子结合成为螯合物，从而阻止血液凝固，全血抗凝后用一般血常规检验的血细胞分析仪检测（仪器法）。
2.4.4.1.1试剂配制
乙二胺四乙酸二钾（EDTA·K2·2H2O，MW404.47）,称量8mgEDTA·K2加纯净水至100ml制成抗凝剂，50μl抗凝剂可抗凝1ml小鼠全血。
1.5～2.2mg的EDTA·K2可阻止1ml血液凝固。
2.4.4.1.2采血
以摘除小鼠眼球的方法采集全血，采用干净无菌的眼科镊子摘取小鼠一侧或双侧眼球，让血液自由滴入装有抗凝剂的1.5ml离心管（或商品化的抗凝管）中，采血过程中不断混匀血液与抗凝剂防止血液凝固，每只动物采集抗凝全血约1ml。
2.4.4.1.3检测分析
上机前血液颠倒混匀，注意检查是否存在凝块。
在24h内以全血细胞分析仪检测血液红Hb。
上机操作参照仪器说明书。
2.4.4.2组织中过氧化脂质降解产物丙二醛（MDA）含量测定
2.4.4.2.1原理
MDA（malondiadehycle）是细胞膜脂质过氧化的终产物之一，测其含量可间接估计脂质过氧化的程度。
1个丙二醛（MDA）分子与2个硫代巴比妥酸（TBA）分子在酸性条件下共热，形成粉红色复合物。
该物质在波长532nm有极大吸收峰。
可用分光光法进行测定。
2.4.4.2.2试剂
0.2M乙酸盐缓冲液pH3.5
0.2M乙酸溶液185mL
0.2M乙酸钠溶液15mL
1mmol/L四乙氧基丙烷（贮备液，4℃保存3个月），临用前用水稀释成40nmol/mL
8.1%十二烷基硫酸钠SDS
0.8%硫代巴比妥酸TBA
0.2M磷酸盐缓冲液pH7.4
0.2M磷酸氢二钠1920mL
0.2M磷酸二氢钾480mL
2.4.4.2.3实验步骤
2.4.4.2.3.1样品制备
组织匀浆样品：
取一定量的大脑组织，生理盐水冲洗、拭干、称重，置匀浆器中，加入0.2M磷酸盐缓冲液，以20000r/min匀浆10s，间歇30s，反复进行3次，制成10％组织匀浆（W/V），3000r/min离心5－10min，取上清液待测。
2.4.4.2.3.2样品测定
试剂
空白管
样品管
标准管
10％脑组织匀浆
0.2mL
40nmol/mL四乙氧基丙烷
0.2mL
8.1%SDS
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.2M乙酸盐缓冲液
1.5mL
1.5mL
1.5mL
0.8%TBA
1.5mL
1.5mL
1.5mL
H2O
0.8mL
0.7mL
0.7mL
混匀，避光沸水浴60min，流水冷却，于532nm比色
注：
如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行
2.4.4.2.3.3计算
B-AB-A1
过氧化脂质含量＝————×C×K=———×40×————————
（nmol/mg组织）F-AF-A0.2×10%×1000
A:
空白管吸光度
B：
样品管吸光度
F：
四乙氧基丙烷吸光度
C：
四乙氧基丙烷浓度（40nmol/mL）
K：
稀释倍数
2.4.4.3组织中总抗氧化能力（T-AOC）测定方法
2.4.4.3.1原理
机体中有许多抗氧化物质，能使Fe2+还原成Fe3+，后者可与菲啉类物质形成稳定的橙黄色络合物，通过在520nm比色可测出其抗氧化能力的高低。
2.4.4.3.2试剂
采用商品试剂盒：
抗氧化能力（T-AOC）测定试剂盒。
2.4.4.3.3样品制备
准确称取脑组织重量，按重量体积比加9倍生理盐水，以20000r/min匀浆10s，间歇30s，反复进行3次，制成10％组织匀浆（W/V），2000～2500r/min离心10min，取上清液待测。
同时用双缩脲试剂测定10%脑组织匀浆蛋白。
2.4.4.3.4样品测定：
按试剂盒的操作要求进行。
如：
试剂
对照管（mL）
样品管（mL）
10％脑组织匀浆
ａ*
试剂一
1.0
1.0
试剂二
2.0mL
2.0mL
试剂三应用液
0.5mL
0.5mL
漩涡混匀器充分混匀，37℃水浴30分钟
试剂四
0.2mL
0.2mL
待测样本
ａ*
试剂五
0.2mL
0.2mL
混匀，放置10分钟，蒸馏水调零1cm光径，520nm测各管吸光度。
*参考取样量：
10%组织匀浆参考取样量：
0.1～0.2ml
2.4.4.3.5计算
ODU-ODC
总抗氧化能力＝——————÷30×N÷Cprot
（单位/mg蛋白）0.01
ODU:
测定管吸光度
ODC：
对照管吸光度
N：
反应体系稀释倍数（反应液总体积/取样量）
Cprot：
稀释倍数待测样本蛋白浓度（mg/ml）
2.5数据处理
数据采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验。
方差齐，计算F值，F值F0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计。
对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
2.6结果判定
模型对照组与阴性对照组比较，Hb、MDA升高、T-AOC含量降低有统计学显著性意义（P<0.05），表示模型成立。
在模型成立的前提下，受试样品组MDA含量降低或T-AOC含量升高有统计学意义（P<0.05），且Hb＜210g/L，判定该项实验结果阳性。
注:
红细胞增多症评价标准参考值Hb＞210g/L。
3亚硝酸钠中毒缺氧实验
3.1原理
亚硝酸钠使二价铁血红蛋白转变为三价铁血红蛋白，生成高铁血红蛋白（MetHb），破坏血红蛋白携氧能力，造成组织细胞缺氧，随着亚硝酸钠剂量的增加，MetHb含量增加，导致组织缺氧直至死亡。
3.2实验动物
推荐使用近交系成年雄性小鼠，体重18～22g，每组10～15只。
3.3材料
亚硝酸钠,20μl毛细管,1ml注射器，秒表。
3.4剂量分组
实验设三个剂量组和一个阴性对照组，以人体推荐量的10倍为其中的一个剂量组，另设两个剂量组。
受试样品给予时间30天。
3.5缺氧损伤实验
3.5.1实验步骤
各剂量组经口给予不同浓度受试样品，阴性对照组按等同容量灌胃给予溶剂，连续30天,于末次给样后1小时，各组按80～100mg/kgBW剂量腹腔注射亚硝酸钠（注射量为0.1ml/10gBW），1h、2h各采血一次，测全血高铁血红蛋白（MetHb）含量。
3.5.2全血高铁血红蛋白（MetHb）含量测定方法
（参照GB8788—1988高铁血红蛋白定量测定法）
3.5.2.1原理
高铁血红蛋白在波长630nm处有一特有的吸收光带，当加入氰化物后，高铁血红蛋白即转化为氰化血红蛋白，此吸收光带亦随即消失。
因此加入氰化物前后用分光光度计（或光电比色计）测定其吸光度之差，按标准计算高铁血红蛋白的含量。
3.5.2.2试剂
1/15M磷酸氢二钠溶液：
准确称取Na2HPO4·12H2O23.87g，用蒸馏水溶解稀释至1L。
1/15M磷酸二氢钾溶液：
准确称取KH2PO49.07g，用蒸馏水溶解稀释至1L。
1/60MpH6.6磷酸盐缓冲液：
量取1/15M磷酸氢二钠溶液3.75ml，1/15M磷酸二氢钾溶液6.25ml，蒸馏水30m1，混合后即可使用（此液用时配制）。
5％（W/V）氰化钾（钠）溶液。
5％（W/V）高铁氰化钾溶液。
1％tritonX－100（辛烷基酚聚氧乙烯醚）溶液。
3.5.2.3操作步骤
取2支小试管，以“A”、“B”编号，各加1/60MpH6.6磷酸盐缓冲液4.5ml，被检查末梢血40μl，0.5ml1％tritonX－100。
“A”管于630nm波长，以磷酸盐缓冲液或蒸馏水调零测得吸光度为D1后，加入5％氰化钾（钠）溶液50μl，混匀，放置2min，以同样波长测得吸光度为D2。
“B”管加入5％高铁氰化钾溶液50μl，在2～5min后，在630nm波长处测得吸光度为D3，然后加入5％氰化钾（钠）液50μl，混匀，放置2min，以同样波长测得吸光度为D4。
3.5.2.4计算方法
D1－D2
高铁血红蛋白/总血红蛋白（%）－---------×100
D3－D4
3.5.2.5方法说明
高铁血红蛋白形成后，由于红细胞中还原酶的存在，可使高铁血红蛋白逐渐还原消退，因此必须立即采样，若现场不能分析，可将抗凝血直接采于缓冲液内，贮存在2～4℃冰壶内（保存期不超过10h），带回实验室测定。
抗凝剂以肝素为佳，禁用草酸盐，因其会导致高铁血红蛋白生成。
本法必须使用分辨能力强的分光光度计，而且在使用前必须校验分光器的波长是否准确。
全血在加入试剂后，血细胞破坏。
由于少量碎片的存在，使溶液发生混浊，影响吸光度（尤其是正常人会出现负值），使用非离子表面活性剂tritonX－100稀释液，或经过离心步骤可克服血红蛋白的混浊。
3.6缺氧存活实验
3.6.1实验步骤
各剂量组经口给予不同浓度受试样品，阴性对照组按等同容量灌胃给予溶剂，连续30天,于末次给样后1小时，各组按200～240mg/kgBW剂量腹腔注射亚硝酸钠（注射量为0.1ml/10g），立即计时，记录动物存活时间。
3.7统计方法
数据采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验。
方差齐，计算F值，F值F0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计。
对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
3.8结果判定
亚硝酸钠中毒缺氧实验：
缺氧损伤实验、缺氧存活实验结果均为阳性可判定实验结果阳性。
其中受试样品组MetHb含量在1h和2h任一时点的降低与阴性对照组比较，差异有统计学意义，判定缺氧损伤实验结果阳性。
受试样品组与对照组比较，存活时间延长，并具有统计学意义，则判定缺氧存活实验结果阳性。
4提高缺氧耐受力结果断定:
常压耐缺氧实验、常压缺氧模型实验和亚硝酸钠缺氧实验中的任二项阳性，可判定受试样品具有提高缺氧耐受力功能作用。
提高缺氧耐受力功能评价方法修订说明
一、承担单位
广东省疾病预防控制中心为主要承担单位。
任务来源于国家食品药品监督管理局保健食品化妆品监管司的委托，对《保健食品检验与评价技术规范（2003年版）》中“提高缺氧耐受力功能评价程序和检验方法”进行修订。
二、主要工作过程
国家食品药品监督管理局保健食品化妆品监管司于2009年4月召开了“保健食品功能评方法及有关程序修订”课题协作组工作会议，参会的有中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、广东省疾病预防控制中心、上海市疾病预防与控制中心、北京市疾病预防控制中心、四川大学华西公共卫生学院、中国中医研究院东直门医院和国家食品药品监督管理局保健食品审评中心的专家近15人，会上对“保健食品功能评价方法及有关程序修订”修订的原则和框架作了充分的讨论，又分别征求了相关专家对修订内容的意见。
为了做好本次检验方法的修订工作，广东省疾病预防控制中心成立了“提高缺氧耐受力功能评价和检验方法”修订的起草工作小组，经查阅国内外相关资料，参考国家食品药品监督管理局保健食品化妆品监管司召开的工作会议的精神，咨询有关专家和实验室同行的意见和建议，形成了本次任务的工作方案，总体上要提高检验方法的科学性、准确性和客观性，提高保健食品功能的技术标准；修订的方法要与当前国内外研究的理论基础相一致。
本次修订在去除“急性脑缺血性缺氧模型”的基础上，新增“常压缺氧”模型，并改良“亚硝酸钠中毒存活模型”，以反映保健食品对缺氧耐受力功能的辅助保护作用。
经过起草工作小组开展的大量条件探索和实验方法研究，对各种实验结果进行了比较和取舍，形成了修订初稿后，起草工作小组召开了多次专家研讨会，征求专家意见，对初稿进行了反复修改，形成征求意见稿。
方法验证工作由广东省疾病预防控制中心、湖南省疾病预防控制中心、湖北省疾病预防控制中心、福建省疾病预防控制中心分别进行验证试验。
在此基础上，征集、整理和归纳了相关意见。
国家食品药品监督管理局保健食品化妆品监管司于2010年8月再次召开了“保健食品功能评价方法及有关程序修订”课题协作组工作会议，参会的有中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、广东省疾病预防控制中心、上海市疾病预防与控制中心、北京市疾病预防控制中心、四川大学华西公共卫生学院、中国中医研究院西苑医院的专家近10人，会上针对验证过程中存在的技术问题及可操作性作了充分讨论并提出修改意见，起草工作小组根据会议精神对修订方案做了进一步完善，综合了方法验证单位的意见后形成了征求意见稿。
2011年7月22日国家食品药品监督管理局保健食品化妆品监管司在北京宣武门商务酒店召开了“保健食品功能评价方法及有关程序修订”定稿专家研讨会，参会的有中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、北京大学、广东省疾病预防控制中心、北京市疾病预防控制中心、上海市疾病预防控制中心、中国中药研究院、中国中医研究院西苑医院、北京医院、国家食品药品监督管理局保健食品审评中心的专家14人，会上对修订后的“提高缺氧耐受力功能评价和检验方法”的科学性、客观性和可操作性给予肯定，并提出修改意见，对征求意见稿做了进一步完善。
三、编制原则
1、总原则，提高保健食品“提高缺氧耐受力功能检验方法”的科学性、准确性和规范性，适应当前法规对加强保健食品监管的要求。
2、要符合当前缺氧损伤的基础理论，既考虑原规范合理的方法，又要提高保健食品功能检验的技术标准，选择保留、改良或新增加的指标要在国内外已经广泛应用并得到普遍的认可，可以反映保健食品的对缺氧损伤的辅助保护作用。
3、在撰写过程中，注意科学性、合理性、和适用性。
四、确定相关技术内容及新旧方法的对比
编号
原方法
现方法
修订理由
序号
内容
序号
内容
1
2
亚硝酸钠中毒存活实验
常压缺氧模型实验
增加常压缺氧模型
2
2.1
原理
在总大气压不变的情况下，降低空气中氧的百分含量，组织细胞不能从血液中获得充足的氧而进行正常的氧化代谢，影响动物的各项生理功能。
常压缺氧模型的机理
3
2.2
材料
2.2.1
常压缺氧仪、血球计数仪、酶标仪
4
2.3
实验动物
2.2.2
增加“建议使用雄性”
雄性实验动物对缺氧更敏感些
5
2.4
剂量分组
2.2.3
实验设三个剂量组、一个模型对照组和一个溶剂对照组，以人体推荐量的10倍为其中的一个剂量组，另设两个剂量组，受试样品给予时间为30天。
6
2.5
实验步骤
2.2.4
各剂量组经口连续给予不同浓度受试样品，对照组按同等容量灌胃给予溶剂，每次给予样品后，将各剂量组与模型对照组实验动物依次放入常压缺氧仪中，同时充入氮气与空气，调节氧百分含量达到10.0～10.5%，每日6h，每周6次。
末次缺氧后，采血检测红细胞数及血红蛋白含量，取脑进行MDA与TOAC的检测。
7
2.6
统计方法和结果判断
2.2.5
结果判定改为“在模型成立的前提下，剂量组与模型组比较，MDA与TOAC含量降低，并具有统计学意义，则判定该实验结果阳性。
8
3
急性脑缺血性缺氧实验
删除
灵敏度和特异度差
9
亚硝酸钠缺氧实验，包括亚硝酸钠缺氧存活实验（实验方法按亚硝酸钠中毒存活实验）和亚硝酸钠缺氧损伤实验。
涵盖中毒剂量和致死剂量的检验方法
10
3.1
原理修改内容包括，“亚硝酸钠使二价铁血红蛋白转变为三价铁血红蛋白，生成高铁血红蛋白（MetHb），造成组织细胞缺氧，随着亚硝酸钠剂量的增加，MetHb含量增加，导致组织缺氧直至死亡”。
完善亚硝酸钠所致缺氧损伤的机理
11
亚硝酸钠中毒存活实验
3.2
亚硝酸钠缺氧存活实验
与本项功能的更适合
12
实验动物
3.2.3
增加“推荐使用雄性小鼠”
雄性小鼠对缺氧更敏感
13
3.3
亚硝酸钠缺氧损伤实验
针对给予中毒剂量亚硝酸钠所致的缺氧损伤，增加该实验方法。
14
实验动物
3.3.2
增加“推荐使用雄性小鼠”
雄性小鼠对缺氧更敏感
15
实验步骤
3.3.4
各剂量组经口连续给予不同剂量受试物，对照组按同等容量灌胃给予溶剂，于末次给样后1h，各组按80～100mg/kgBW腹腔注射亚硝酸钠（注射量为0.1ml/kgBW），于1h、2h采血测MetHb含量。
16
统计方法及结果判定
3.3.5
受试样品组与对照组比较，MetHb含量降低，并具有统计学意义，则判定该实验结果阳性；亚硝酸钠缺氧存活实验与亚硝酸钠缺氧损伤实验结果全部阳性，可判定亚硝酸钠缺氧实验结果阳性。
3.7
结果判定
删除
新增加了检验项目
4
常压缺氧实验、常压缺氧模型实验、亚硝酸钠缺氧实验三项实验中任两项实验结果阳性，可判定该受试样品具有助于提高缺氧耐受力功能。
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