《分子生物学原理》.docx
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《分子生物学原理》
分子生物学原理（最终回）
Chapter1ProteinStructureandFunction
复习题
（1）
1.名词解释
（1）Peptides肽，由氨基酸脱水缩合形成的两性有机化合物，相对分子量小于6000
（2）Simpleproteins简单蛋白，仅由氨基酸组成，不含蛋白辅助因子等非氨基酸成份的蛋白为简单蛋白。
（3）Conjugatedproteins缀合蛋白，除了蛋白组分外还含有蛋白辅助因子等非氨基酸成份（如辅酶、辅基和金属离子等）的蛋白为缀合蛋白。
（4）Coenzyme辅酶，是一种蛋白辅助因子，为非氨基酸成份，通过非共价键与链相连，可以用透析、超滤的方法将其除去。
（5）Prostheticgroup辅基，是一种蛋白辅助因子，为非氨基酸成份，通过共价键与多肽链相连，不易与多肽链分离。
（6）Configuration构型，有机分子的空间排列，不同的排列彼此作为参照，具有双键和手性中心两个特征，它们之间的转化需要破坏共价键。
（7）Conformation构象，取代基团的空间排列，由于键的自由旋转，在空间能形成不同位置，它们的转化可以通过单键的旋转来完成，故不需要破坏共价键。
（8）Chiralcarbin手性碳原子，连接四个不同原子或基团的碳原子叫做手性碳原子。
（9）Enantiomers对映异构体，如两个分子互为镜像关系，则称这两个分子为对映异构体，对映异构体具有旋光性。
（10）Opticalisomers光学异构体，L-和D-构型的异构体具有相同的熔点、溶解度等物理性质和相同的化学性质，但旋光方向相反，故称之为光学异构体
（11）Cisandtransisomers正反异构体，取代基团在双键两侧的不同排列形成正反异构体。
（12）Ampholytes两性电解质，既可以作为质子供体又可以作为质子受体的电解质。
在偏中性的水溶液中，α-氨基酸的氨基（-NH3+）可以起质子供体的作用，而羧基（-COO-）起质子受体的作用，所以氨基酸是两性电解质
（13）Isoelectricpoint等电点，氨基酸的等电点。
当溶液的PH达到某一特定值的时候，氨基酸所带正电荷刚好与负电荷相等，氨基酸分子对外不显电性，此时溶液的PH值。
（14）Peptideplane在肽键中，由于共振现象，以致C-N之间具有部分双键的性质，不能自由旋转；而C=O之间具有部分单键的性质。
于是，形成肽键的4个原子与其左右相邻的2个Cα原子处于同一个平面，这两个Cα反式排列，该平面叫做肽平面。
（15）Dihedralangle二面角，φ绕Cα-N及ψ绕Cα-C旋转的角分别为肽平面的两个二面角，它决定了肽链的主链构象。
（16）Ramachandrandiagram拉氏构象图，Ramachandran根据蛋白质中非键合原子间的最小接触距离，确定了哪些成对二面角（φ、ψ）所规定的两个相邻肽单位的构象是允许的，那些是不允许的，并以φ为横坐标，以ψ为纵坐标，在坐标图上标出，该图即为拉氏构象图。
（17）Primarystructureofproteins蛋白的初级结构，氨基酸的排列顺序即为蛋白的初级结构。
（18）Secondarystructureofproteins蛋白的二级结构，它是指多肽链的局部构象，即局部骨架的折叠方式,蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链的主链骨架原子的相对空间位置，不涉及氨基酸侧链的构象。
（19）Tertiarystructureofproteins蛋白的三级结构，是指整条多肽链的构象，包括所有原子的空间排列,一条完整多肽链全部氨基酸的相对空间位置，三级结构的形成和稳定主要靠共价键和次级键来维持。
（20）Quaternarystructureofproteins蛋白的四级结构，它是指亚基间的相互作用，包括亚基数目、种类、空间位置及相互作用，但不包括亚基本身的构象，维持四级结构的是次级键。
（21）Coiledcoil卷曲螺旋，一种重要的模体，指两个或两个以上的α-helix靠疏水性相互作用相互缠绕形成的稳定超螺旋。
（22）β-strand,β-barrel&β-saddleβ折叠链：
多肽链骨架呈伸展状形成β折叠链；
平行排列的β折叠片层具有自发的右手扭曲倾向，以减少构象的能量。
由于存在自发扭曲和阻碍扭曲（氢键）两种力，如果平行的β折叠片段前后交错，则形成漏斗状的圆筒形（barrel）；如果β折叠片段矩形排列，就形成马鞍形（saddle）
（23）β-turnβ转角，球状蛋白质的多肽链上出现180°的回折即为β转角，由四个氨基酸组成，氢键存在于第一个CO和第四个NH之间。
一般为trans，但脯氨酸有6%的cis。
（24）Disulfidebonds二硫键是多肽链中（或肽链间）的两个Cys残基侧链之间形成的共价键，可以将多肽链的不同部分（或不同的多肽链）连接起来。
稳定蛋白质的三级结构。
（25）Electronegativityofelements电负性，为原子获得电子的能力，其数值越大，在形成化学键时对成键电子的吸引能力越强。
（26）Entropy熵，它指的是体系的混乱程度，熵值越大，体系越稳定。
（27）Motif模体，在蛋白质整条肽链中常会出现由数个二级结构肽段在空间上相互靠近，形成固定的局部结构，执行特定的生物功能，这些区域被称为模体，是结构域的亚单元，表现结构域的各种功能。
出现在一种或多种蛋白质中
（28）Domain结构域，是在二级结构或超二级结构的基础上形成三级结构的局部折叠区，在三维空间可以明显区分及相对独立，并具有特定的生物学功能。
2.22种天然氨基酸的名称、符号及其主要特征
根据氨基酸侧链的性质和在水中的可溶性，可将氨基酸分为三大类：
（1）亲水性氨基酸：
含有离子型的或极性的侧链。
碱性氨基酸：
中文名称
英文名称
缩写
符号
赖氨酸
Lysine
Lys
K
精氨酸
Arginine
Arg
R
组氨酸
Histidine
His
H
酸性氨基酸：
天门冬氨酸
Asparticacid
Asp
D
谷氨酸
Glutamicacid
Glu
E
极性氨基酸：
丝氨酸
Serine
Ser
S
苏氨酸
Threonine
Thr
T
天门冬酰胺
Asparagine
Asn
N
谷氨酰胺
Glutamiine
Gln
Q
（2）疏水性氨基酸：
含有脂肪族侧链，不溶或微溶于水。
中文名称
英文名称
缩写
符号
丙氨酸
Alanine
Ala
A
缬氨酸
Valine
Val
V
异亮氨酸
Isoleucine
Ile
I
亮氨酸
Leucine
Leu
L
蛋氨酸
Methionine
Met
M
苯丙氨酸
Phenylalanine
Phe
F
酪氨酸
Tyrosine
Tyr
Y
色氨酸
Tryptophan
Trp
W
（3）特殊氨基酸：
半胱氨酸：
Cys的侧链含有活泼的巯基（-SH），通过氧化可以和另一个Cys的侧链形成二硫键（S-S）。
甘氨酸：
Gly是最小的氨基酸，侧链只有一个氢原子。
脯氨酸：
Pro是唯一的亚氨基酸，它的α-碳原子上的氨基和侧链基团之间共价相连，形成吡咯环，造成Cα-N键不能旋转。
中文名称
英文名称
缩写
符号
半胱氨酸
Cysteine
Cys
C
甘氨酸
Glycine
Gly
G
脯氨酸
Proline
Pro
P
（4）第21和22种天然氨基酸：
硒代半胱氨酸
Selenocysteine
Se-Cys
吡咯赖氨酸
Pyrrolysine
Pyl
特征：
氨基酸是两性电解质；由于氨基酸侧链不同而导致其在亲水环境中溶解度不同，可分为亲水和疏水两类；部分氨基酸有紫外吸收峰如色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸；氨基酸能与茚三酮反映可测定氨基酸的含量；氨基酸之间可进行成肽反映形成肽单元。
α-NH2易于和酰化试剂反应，α-COOH性质类似于有机酸的羧基。
3.举例说明D构型氨基酸的功能？
D构型氨基酸参与弧菌消旋酶的形成，影响细菌细胞壁的肽聚糖的形成，所以D构型氨基酸的浓度影响着细菌细胞壁的稳定，从而影响细菌对外界环境的适应能力。
4.为什么Gly的酸性明显强于醋酸？
由于在Gly中，α-NH2静电排斥α-COOH上的H，使COOH中的H更容易解离，故其酸性较强。
5.天然氨基酸的特征性颜色反应和光吸收特征是什么？
光吸收特征：
1）含有苯环，测定时用280nm的吸光度值（Trp278nm，Tyr275nm，Phe257nm）2）其它氨基酸不含苯环，测定时用220nm的吸光度值，应用的是共轭双键的性质。
茚三酮反应：
茚三酮和α-氨基酸一起加热可以发生氧化还原反应，氨基酸脱去α-氨基和羧基，茚三酮被还原。
还原产物可以和脱下的氨基在结合一分子茚三酮形成蓝紫色化合物，但脯氨酸为黄色，在570nm可见光出现吸收峰，由于吸光度与氨基酸脱氨量有关，可以测定氨基酸含量。
氨基酸的α-氨基可以和FDNB、荧光胺、丹磺酰氯发生特征性反应，能够显现出不同的颜色，可以定性或定量。
6.Peptidebond的主要特点是什么？
①肽键中N的电子云向羰基O偏移；②C-O有~40%的单键性质C-N有~40%的双键性质，双键性质限制自由旋转；③每个残基都保留两个自由旋转的单键N-Cα和C-Cα。
7.为什么多肽链具有方向性？
多肽链是通过氨基酸的脱水缩合形成，由肽键相连接，由于氨基酸同时含有-NH2和-COOH，这样在多肽链的末端，一端必然有一个游离的-NH2，另一端必然有游离的-COOH，因此肽链就有了方向性。
8.α-helix和β-pleatedsheet的主要结构特征是什么？
1）①α-helix一般为右手螺旋，肽平面平行于螺旋的长轴；②肽链以螺旋状盘卷前进，每圈螺旋由3.6个氨基酸残基构成，螺距为0.54nm；③螺旋结构被规则排布的氢键所稳定，氢键排布的方式是：
肽键羰基O原子和C端方向的第4个残基酰胺H原子形成氢键。
由于所有的氢键供体的方向相同，所以α-helix具有极性。
这样构成的由一个氢键闭合的环，包含13个原子。
④氨基酸残基侧链从螺旋形成肽链骨架向外伸出，覆盖在α-helix的外表面。
由于骨架上极性基团均参与氢键的构成，不再影响亲疏水性，所以亲疏水性完全由残基侧链基团决定。
2）①每条β-折叠链片段比较短，几乎是完全伸展的。
侧链交替地分布在片层的上方和下方。
②在β-折叠结构中，相邻肽链主链上的C=O与N-H之间形成氢键，氢键与肽链的长轴近于垂直。
③相邻肽链的走向可以是平行和反平行两种。
在平行的β-折叠结构中，相邻肽链的走向相同，氢键不平行。
在反平行的β-折叠结构中，相邻肽链的走向相反，但氢键近于平行。
④β-折叠链上的每个肽平面基本上和相应的β折叠片层平面折叠，氨基酸残基侧链基团交替指向平面的上方和下方。
9.哪些氨基酸残基容易造成α-helix结构的不稳定（或终结）？
为什么？
Pro及Gly。
Pro的Cα原子位于侧链基团吡咯环（刚性环）中，导致Cα-N键不能旋转，导致α-helix在此“打结”或中断。
同时，Pro的氨酰基团缺少H原子，不能形成稳定的氢键。
对于Gly，由于其Cα不是手性C，并且由于周围H的存在具有过多的柔性，这样它就形成更多种异变的构象，使肽链骨架发生弯曲，不容易形成α-helix。
10.Collagen分子结构的主要特点是什么？
胶原蛋白（Collagen）由3条α链多肽组成，每条多肽链均为左手螺旋构型。
三条拧成一股，形成右手超螺旋结构，使其分子结构非常稳定，每圈约为30个氨基酸残基，螺距8.6nm。
胶原蛋白分子中甘氨酸的含量约为35%,在左手螺旋的单链分子中每三个氨基酸中就有一个甘氨酸，甘氨酸与其它两个氨基酸形成一个单位，反复出现形成了一条单链，三倍体的单链螺旋组成了四级结构为右手螺旋，在三条连中甘氨酸位于链之间的结合位点上，使三条单链紧密结合形成了四级结构，链分子中的Pro/Hyp使螺旋扭转。
11.第一个完成3D结构测定的蛋白质是什么？
何时、何人完成？
第一个完成3D结构测定的蛋白是抹香鲸肌红蛋白（Myoglobin），它是在1957年，由英国的MaxPerutz及JohnKendrew共同完成的。
12.维持蛋白质分子3D结构的力有哪些？
维持蛋白3D结构的主要有五种力，分别是氢键、离子键、范德华力及疏水作用力，二硫键
13.Hydrogenbond是如何形成的？
其本质如何？
电负性较大、半径较小的原子与H原子形成分子后，共用电子对强烈偏向电负性较大原子的一边，而H原子核外只有一个电子，其电子云向电负性较大的原子偏移，使得它几乎要呈质子状态。
这个半径很小、无内层电子的带部分正电荷的氢原子，使附近另一个分子中含有孤电子对并带部分负电荷的原子充分靠近它，从而产生静电吸引作用。
这个静电吸引作用力就是所谓氢键。
氢键的本质就是正负电荷的相互吸引。
特点:
方向性3个原子在空间位置接近一条直线180℃则产生氢键最强，如果有夹角则氢键减弱
饱和性一个供体的H只能被一个受体接受
14.Hydrophobicinteraction是如何形成的？
其本质如何？
由于疏水物不是电子极化性的，它们无法形成氢键，所以水会对疏水物产生排斥，当多个疏水性基团存在于水相，这些基团必然相互接近，只有这样才能破坏水分子的笼形结构，增加水分子的混乱度即熵增加。
所以疏水性相互作用是一个熵驱动的自发过程，其本质就是熵增加。
15.VanderWaalsinteractions是如何形成的？
其本质如何？
分子间作用力包括①取向力，产生于永久偶极②诱导力，非极性基团之间的诱导偶极③色散力，非极性基团之间，由于电子运动的不对称性，造成电荷密度产生波动，产生瞬间偶极，产生弱的吸引力。
范德华力指的是诱导偶极和瞬间偶极之间的相互作用。
本质是静电相互作用。
复习题
（2）
1.名词解释
（1）Hierarchicalfoldingmodel逐级折叠模型，是氨基酸序列折叠成复杂结构的一种模型，由二级结构折叠成超二级结构，然后形成完整的结构域，最后是整条多肽链的折叠，折叠成具有活性的天然构象。
（2）”Moltenglobule”foldingmodel“熔球折叠”模式，是蛋白质折叠到天然构象的另一种模式，是指伸展的多肽链先形成大量的二级结构单元，但它们之间还未形成稳定的二级结构，接着再通过次级键（主要是疏水键）使二级结构稳定，形成天然构象。
。
（3）Chaperones伴侣分子是一个新发现的蛋白质家族，广泛存在于细胞中，能够结合各种蛋白质分子，可以参与蛋白质的一般折叠过程。
两种类型：
分子伴侣和伴侣蛋白。
（4）Molecularchaperones分子伴侣，是指结合未折叠的蛋白质和正在合成的多肽，防止其变性，只是间接和部分起作用，如Hsp70
（5）Chaperonins伴侣蛋白，是含有三层由7个多聚体组成的桶状结构，能直接帮助多肽链正确地完全折叠的一类蛋白，直接促进蛋白折叠的一类蛋白。
（6）Priondisease朊病毒疾病，该病的致病因子是阮病毒蛋白质，是一种因蛋白质不能正确折叠使构象发生改变导致该病。
（7）Ubiquitin泛素，它是由76个氨基酸残基组成的高度保守的多肽链，通过C末端的Gly，泛素共价地结合于底物蛋白质的Lys残基，被其标记的蛋白质将被特异性地识别并迅速降解，这种标记作用不具有底物特异性，主要功能是与蛋白质结合后，使之降解，或参与DNA损伤修复、内吞、免疫应答等。
（8）Ubiquitination泛素化是对特异的靶蛋白进行泛素修饰的过程。
泛素化修饰涉及泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3的一系列反应：
首先在ATP供能的情况下，酶E1粘附在泛素分子尾部的Cys残基上激活泛素；接着，E1将激活的泛素分子转移到E2酶上；随后E2酶和一些种类不同的E3酶共同识别靶蛋白，对其进行泛素化修饰。
根据E3与靶蛋白的相对比例可以分为单泛素化修饰和多聚泛素化修饰
（9）Pupylation原核中的“泛素化”，即PUP蛋白与靶蛋白Lys残基侧链的连接，介导原核蛋白的降解。
（10）proteindenaturation蛋白变性，蛋白质在某些物理和化学因素（一般可通过加热、辐射、加压等物理因素，也可加入乙醇、酸、碱及变性剂等化学试剂）作用下其特定的空间构象被改变，即其三级结构的改变，从而导致其理化性质的改变和生物活性的丧失，这种现象称为蛋白质变性。
（11）Renaturation复性，如果除去变性因素，在适当条件下变性蛋白质可恢复其天然构象和生物活性，这种现象称为蛋白质的复性。
（12）3Ddomainswapping即三维结构结构域交换，在特定的单体之间交换特定的结构元件产生的聚合结构单元,是产生多聚化的重要模式，使相同亚基之间聚合。
例如人的朊蛋白，PrPSC+PrPC→2PrPSC
（13）Intrinsicallyunstructuredproteins（IUP）内在未折叠蛋白，在中性pH条件下，一种蛋白的伸展结构，表现出高度的可变性并缺乏二级结构单元，它包括几乎完全不折叠和局部不折叠蛋白两类
（14）Integralproteins内在蛋白，膜蛋白的一种，其疏水部分与膜磷脂疏水部分共价连接，两端具极性，蛋白贯穿膜内外，含有膜外部分和膜内部分。
大多可通过加入去污剂而释放出来。
（15）Peripheralproteins外在蛋白，膜蛋白的一种，不直接与膜疏水性双分子层相连接，通过氢键、离子键与脂分子或膜蛋白结合，周边膜蛋白，大多以共价键与膜结合，不含膜内部分，大多可通过改变离子强度、加入螯合剂、尿素或碳酸盐可从膜上释放出来。
（16）Sedimentationcoefficient沉降系数，在单位离心力场中粒子移动的速度，是以时间表示，跟颗粒大小与密度有关，在一定温度和介质中描述微粒在离心场中运动特征的常数，与微粒的密度、形状相关，与密度和质量成正比
（17）Differentialcentrifugation差速离心，是指低速与高速离心交替进行，使各种沉降系数不同的颗粒先后沉淀下来，达到分离的目的，将可溶性成分与不溶性成分区分开来。
（18）Rate-zonalcentrifugation速率区带离心，不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法，介质的最大密度要小于所有样品颗粒的密度。
先使惰性介质形成密度梯度，再加入样品，利用可溶性物质质量的差异，经过离心，将混合物分成质量不同的若干区带的分离方法
（19）Ionexchangechromatography离子交换色谱，是利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来分离溶液中带电离子的一种方法，凡在溶液中能够电离的物质通常都可以用离子交换色谱法进行分离，其原理是利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现，分离利用不同蛋白质组分在一定PH的缓冲液中所带的净电荷不同，与固定相（离子交换树脂）上的键合基团发生离子交换后，利用不同盐浓度或PH的缓冲液将不同组分从固定相上洗脱下来，达到分离目的的一种层析方法
（20）Gelfiltrationchromatography凝胶过滤层析，又称分子筛，主要是根据蛋白质的大小和形状及蛋白质的质量进行分离和纯化，条件温和，回收率高（大分子先出，小分子后出）。
利用树脂内部形成的网状结构，蛋白混合物中分子量小的蛋白颗粒进胶，后洗脱，分子量大的组分不进胶，而被先洗脱，是利用蛋白质分子量大小不同的性质进行分离的方法。
缺点是样品量受限，样品体积小于5%柱体积。
（21）Affinitychromatography亲和层析，利用某些分子间能特异性吸附和释放而建立的一种层析分离技术，主要用于抗原或抗体的纯化制备。
利用蛋白质生物学活性不同，使具有某种生物特性的蛋白与树脂上键合的相应基团结合，而其它蛋白不结合，最后用竞争性洗脱剂将该蛋白洗脱下来而达到分离的方法
（22）Specificactivity比活性，指每毫克总蛋白的酶活性单位。
酶的总活性/总蛋白量（units/mg），可用于酶纯度的衡量
（23）HPLC高效液相色谱，其原理是被测不同物质与固定相的相互作用不同，不同的物质按顺序离开色谱柱，通过检测器得到不同的峰信号，最后通过分析比对这些信号来判断待测物所含有的物质，具有分离速度快，灵敏度高，分辨率高等特点。
有两个主要特点：
（1）树脂颗粒很细，以增加有效交换面积，进而提高分离效率；
（2）由于树脂颗粒很小，流动相必须借助于高压泵才能获得正常流速。
（24）ReversePhaseHPLC反相高效液相色谱，这是一种固定相极性小于流动相极性的液相色谱，极性大的先流出。
与正向色谱相比，反相色谱的固定相极性＜流动相，固定性吸附了一层极性小的液膜，这样极性大的组分先被洗脱，而极性小的组分后被洗脱的一种HPLC
（25）FPLC快速蛋白液相色谱，专门用来分离蛋白质、多肽及多核苷酸的系统，其原理与经典的HPLC相似，使用了惰性材料，只是所有接头、阀门、管道系统和层析柱均采用惰性材料如：
钛和塑料，可确保工作状态下生物分子的活性不受影响
（26）Perfusionchromatography灌注色谱，使用了新的HPLC树脂，使样品与固定相作用加快，并且保持了较高的灵敏度，其原理与HPLC相同。
采用一种新型层析树脂的HPLC，该树脂具有穿透孔大，便于流动相将样品快速带入树脂内部的扩散孔，而扩散孔短小，在保证灵敏度不变的前提下，可大大提高流速降低层析时间。
2.1950s，著名的C.Anfinsen实验的内容和意义是什么？
RNaseA（含124个氨基酸，4个二硫键）在8M尿素及β巯基乙醇的作用下变性，不能再水解RNA，但当变性剂除去以后，RNase恢复了原有的构象，能够将RNA水解。
其意义是首次证明了蛋白质的一级结构与高级结构的关系，蛋白质活性（高级结构）由其一级结构决定。
3.举例说明Covalentmodificationofproteins的主要类型。
Ser、Thr及Tyr的磷酸化；Lys的甲基化；Lys的乙酰化；Cys的烷基化；Lys的泛素化；Ser及Thr的N-乙酰胺基葡萄糖化（N-acetylglucosamine）。
如P53蛋白，N末端的磷酸化修饰，C末端的乙酰化、泛素化及SUMO修饰；组蛋白N末端前20个氨基酸甲基化、磷酸化和乙酰化修饰；IgG的Fc端的糖基化修饰等等
4.说明Ubiquitin-mediatedproteolyticpathway的主要过程。
（1）泛素的活化：
泛素Gly端的羧基连接到泛素活化酶E1的巯基，这个步骤需要以ATP作为能量，最终形成一个泛素和E1之间的硫酯键。
（2）E1通过交酯化过程将活化后的泛素交给泛素结合酶E2。
（3）泛素连接酶E3将结合E2的泛素连接到目标蛋白上，当蛋白上已经存在泛素的时候，结合了E2的泛素可以直接连接在其上而不通过E3。
最终，被标记的蛋白质被蛋白酶分解为较小的多肽、氨基酸以及可以重复使用的泛素。
5.实验室常用的蛋白质变性剂有哪些？
其原理如何？
常用的变性剂有：
尿素、盐酸胍，这两种都是具有很强的竞争氢键能力，
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