亚洲栽培稻与非洲栽培稻种间杂种不育的遗传研究.docx
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亚洲栽培稻与非洲栽培稻种间杂种不育的遗传研究
分类号密级
UDC编号
学位论文
亚洲栽培稻与非洲栽培稻种间杂种不育的遗传研究
GeneticstudiesonhybridsterilitybetweenOryzasativaL.andO.glaberrimaSteud.
任光云
指导教师陶大云研究员云南省农业科学院昆明
申请学位级别硕士学科专业名称作物遗传育种
论文提交日期2006年6月论文答辩日期2006年6月
学位授予单位云南农业大学年月日
答辩委员会主席魏蓉城
评阅人 谭学林
师常俊
龚洵
云南农业大学
2006年6月
云南农业大学学位论文原创性声明
本人郑重声明：
呈交的学位论文“亚洲栽培稻与非洲栽培稻种间杂种不育的遗传研究”是本人在导师的指导下进行研究所取得的成果。
除文中已引用的内容外，本论文不含任何其它个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。
对本论文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在论文中作了明确的说明，并表示了谢意。
本声明的法律后果由本人承担。
学位论文作者签名：
日期：
2006年6月日
目录
摘要1
Abstract2
1.引言3
1.1非洲栽培稻，水稻改良中首选的基因库3
1.2栽培稻种间杂种不育的遗传机理4
1.3遗传标记5
1.4分子标记定位QTL的原理6
1.5作图群体的组成及遗传连锁图谱的构建8
1.6QTL定位、标记辅助选择9
1.7数量性状研究今后的发展10
1.8本研究的目的意义11
2.材料与方法13
2.1遗传分析材料14
2.2群体构建14
2.3田间表型性状的调查15
2.4基因型数据的收集16
2.5近等基因系群体标记杂合率的检测17
2.6用回交高世代群体对育性QTLs（基因）进行确认和定位17
3结果与分析19
3.1 回交过程中各个世代育性分离分析19
3.2BC6F1近等基因系群体育性位点检测20
3.3用回交高世代群体（BC7F1）对育性QTLs的分析26
3.3.1回交高世代群体BC7F1.育性的表现26
3.3.2用回交高世代群体BC7F1对育性QTLs（基因）的分析29
3.3.3BC7F1群体中定位的育性基因对育性作用力35
3.4回交高世代群体定位的新育性位点38
4讨论41
4.1 对已有位点的验证41
4.2 新育性位点的发掘41
4.3BC6F1与BC7F1结果偏差42
4.4选择回交在QTLs定位中的作用42
4.5实验技术讨论42
4.6BC7F1群体的下一步验证43
5结论44
参考文献45
致谢52
摘要
在发掘利用亚洲栽培稻（OryzasativaL.）近缘种有利基因的过程中，杂种不育及控制各种重要农艺性状有利QTLs位点的导入是当前研究的重点与难点。
本研究选用与亚洲栽培稻（O.sativa）具有相同AA基因组，且具有独立而平行进化关系的另一个栽培稻种——非洲栽培稻（O.glaberrima）为研究材料，以表现为数量性状遗传的种间杂种育性作为研究指标，在对栽培稻种间杂种育性进行分析研究、明确杂种不育的遗传基础的同时，以求建立一套更为简便有效的QTL检测定位方法。
本文选用59个非洲栽培稻品种作为供体,选用滇粳优1号作为受体和轮回亲本。
经反复选择、反复回交培育成135个BC6F1不育株、及21个由BC6F1衍生出的BC7F1分离群体作为研究材料，将杂种花粉育性分解为典败、圆败、染败、可育的同时用微卫星标记定位非洲栽培稻与亚洲栽培稻种间杂交组合中来自于非洲栽培稻的育性QTLs（基因），从纵向和横向角度分析了来自于非洲栽培稻的育性位点在不断选择回交中的分离及互作情况，同时比较了其他研究者对非洲栽培稻和亚洲栽培稻种间杂种育性位点的结果，在印证了前人研究结果的同时有了新的进展。
并对本研究所用的反复选择、反复回交、反复分子定位手段，将表现为数量性状遗传的育性位点分解为简单遗传的孟德尔遗传因子的方法进行了讨论。
本研究的主要成果如下：
（1）用225个SSR标记在BC6F1群体（59个供体形成的135个近等基因系），检测到14个区域可能与育性有关。
（2）将控制花粉育性（及小穗育性）的5个新的基因（QTLs），S33（t）,S34（t）,S35（t）,S36（t）,S37（t）别定位于第1，3，8,12四条染色体上。
（3）将控制育性的复杂数量性状位点通过反复回交、反复选择、反复分子定位分解成为可操作的单个孟德尔因子,对这些基因逐一进行研究。
关键词：
非洲栽培稻；亚洲栽培稻；种间杂交；育性；QTL定位
Abstract
GeneticstudiesonhybridsterilitybetweenOryzasativaL.andO.glaberrimaSteud.
RenGuangyun
HybridsterilityisthekeyconstraintforintrogresingusefulgenesfromtherelativestoOryzasativa.OryzasativaL.andO.glaberrimaSteud.usedinthisstudysharecommonAAgenomewith24chromosomes.Thehybridsterilityismainlygenicsterility.Butthenaturestillneedsfurtherinvestigation.
ThesterilityofinterspecifichybridcontrolledbyQTLsinpreliminarypopulationwasusedasthestudytargetandthegeneticsofhybridsterilityintheadvancedbackcrossprogeniesofO.sativa/O.glaberrimainterspecifichybridswasstudied.59accessionsofO.glaberrimaasdonors,andDanjingyou1（ajaponicacultivarfromYunnan）asrecurrentparenttoform135BC6F1NILsand21BC7F1segregationpopulations.Genotypingusing225SSRmolecularmarkersforBC6F1NILs,andQTLdetectionforsterilityweremade.AndQTLconfirmationandmappinginBC7F1weredone.Preliminaryprogresswassummarizedasfollow
（1）Graphicalmappingwith225SSRmarkersdetected14possibleregionsforsterilityin135BC6F1sterileindividualsfrom59donors.
（2）MoststerileregionswereconfirmedandmappedinBC7F1populationassingleMendelianfactor.Fivenewlociforpollenand/orspikeletsterilityonchromosomes1,3，8and12werefoundandmapped.
（3）ThisstudyclearlyindicatedthatmostinterspecifichybridsterilityQTLsfrompreliminarypopulationcouldbetreatedassingleMendelianfactorsviastrategyofrecurrentselection,recurrentbackcross,andrecurrentmolecularmapping.
Keyword:
Oryzaglaberrima;Oryzasativa;interspecifichybrid;sterility;QTLmapping.
1.引言
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，世界上有一半的人口，我国有近三分之二的人口以稻米为主食［1］。
每年约有15亿公顷的土地用于种植水稻（约占世界可耕种土地的11%）。
世界水稻生产仍然不能满足日益增长人口的需求。
高产、抗病、抗逆水稻品种的培育无疑是解决这个问题的关键所在。
但目前大多水稻栽培品种的种质大多呈单一化，无大的变异，在实现矮化育种和杂交种优势处用后，这使得产量平台难以打破[2-3]。
增加耕地面积和提高复种指数的潜力已越来越小，提高产量根本的出路在于通过遗传资源的有效利用提高单产和增强稳产性。
迎接这一挑战首先在于育种，而育种的突破很大程度上依赖于利用其野生近缘种的遗传多样性[4]。
1.1非洲栽培稻，水稻改良中首选的基因库
所有农作物都是人类从野生植物驯化而来的，这一过程不可避免地降低了栽培作物的遗传变异[5]。
而现代高强度的科学育种使本已狭窄的作物基因库变得更单一，遗传变异的缩小有可能带来另一个更为尖锐的问题——育种家遗传改良进度的缩小，育种家育种群体的遗传变异越小，发现新的有利基因及其组合的可能性也越小[6]。
目前，一方面各国花了大量的人力物力收集保存栽培稻及其近缘种质资源[7]，仅国际水稻研究所（IRRI）保存的AA基因组野生稻就有1447份，占野生稻保存总数的76.6%[8]，而非洲栽培稻又有2983份[9]，我国仅普通野生稻（O.rufipogon）就保存有5571份[10]。
另一方面是育种家可利用的资源十分有限、育成品种的遗传基础十分狭窄[11]，与近缘种存在的丰富变异及科研生产的需求相比，发掘利用的近缘种有利基因是十分有限的。
目前对收集保存最多、与亚洲栽培稻又具有相同AA基因组的7个近缘种有利新基因发掘利用十分有限，见报道的有野败细胞质不育基因[12]、普通野生稻草丛矮缩病抗性基因[13]、长雄野生稻抗白叶枯病基因[14]、普通野生稻高产基因等[15－16]。
育种家也作过大量的研究，但困难重重。
首先是7个近缘种与亚洲栽培稻杂种后代经常出现不育，增加了利用的难度，也造成QTLs分析的偏差[17]，程度不同的生殖隔离使近缘种的育种利用十分困难[18－19]；其次是近缘种主要农艺性状表现较差，以表现型选择亲本时多被育种家淘汰，加之有利基因与不利基因的紧密连锁，育种家较难利用[5]；第三是这7个种与亚洲栽培稻的系统分类关系大多不十分清楚，也限制了有利基因的发掘利用。
因此要从亚洲栽培稻近缘种中引入优良基因必须考虑以上限制因素。
在同具有AA基因组的8个种中用于生产稻谷的栽培稻种仅有两个，除起源于亚洲而在全世界广泛栽培的亚洲栽培稻（O.sativaL.）外，另一个是起源于西非而仅在非洲少量种植（现在约占西非稻作面积的20%）的非洲栽培稻（O.glaberrimaSteud.）。
两个栽培种的起源是独立而平行的，并分别具有其野生祖先种，但又具有相同的AA染色体组[20－23]。
尽管非洲栽培稻有低产、秆软易倒、易落粒等缺点[12],但非洲栽培稻作为栽培种经过长时间的人为选择驯化，聚集了很多适合人类栽培而非近缘野生种可以相比的优良特性。
另外非洲栽培稻对非洲黄斑驳病毒病[24]、稻瘟病[25]、线虫[26]、绿叶蝉[13]的抗性及对酸性土、铁毒、干旱的耐性和旺盛的营养生长势等是很值得开发利用的有利性状[27-29]，而且来自非洲栽培稻对产量性状的有利基因或QTLs也可用于培育高产的亚洲栽培稻新品种[12,29]。
非洲栽培稻及其野生祖先种O.barthii、O.longistaminata与亚洲栽培稻也无直接的起源演化关系[20,22,30]，加之长期的生殖隔离，与亚洲栽培稻间少有基因交流。
这就提示我们通过亚洲栽培稻与非洲栽培稻间的杂交可望获得较丰富的遗传变异。
由此可见，非洲栽培稻应是亚洲栽培稻远缘杂交育种的首选物种[31]。
1.2栽培稻种间杂种不育的遗传机理
1.2.1生殖隔离是种间杂交育种中普遍存在的也是最大的障碍
隔离的种类很多,首先可以分为地理隔离和生殖隔离。
生殖隔离又可以分为以下两大类：
如果发生在受精以前，就叫做受精前的生殖隔离，如果发生在受精以后,就叫受精后的生殖隔离。
受精前的生殖隔离包括生态隔离、季节隔离、行为隔离、机械隔离、配子隔离等。
受精后的生殖隔离包括杂种不活、杂种不育、杂种衰败等。
杂种不活是指不同种生物间交配、受精后，形成的杂种胚胎不能正常发育，或杂种后代出生后，能够生活一段时间，但在生育年龄以前就会死去。
杂种不育是指交配后能够产生正常、成熟的杂种后代，但杂种后代却不能生育。
造成杂种不育的原因很多，有的是性腺发育不全，有的则是因为生殖细胞不能进行减数分裂等。
杂种衰败是指形成的杂种F1可育，但其后代不育或生活力下降[32]。
1.2.2杂种不育在杂交育种中的普遍性
杂种不育是指杂交种的的第1代植株或者是第2代、第3代植株虽然生长正常，但是由于亲本种的基因组之间或者基因间不协凋或者一个亲本的核基因组与另一个亲本的细胞质之间不协调而不能生殖的现象。
其主要表现有杂种植株的雌雄蕊异常、杂种植株的雌雄配子发育不正常、杂种的雌雄配子不能融合。
不仅在属、种之间的杂交存在生殖障碍，种内的杂交甚至亚种内的杂交也存在杂种不育的情况。
水稻籼、粳间的杂交不育已有大量的研究[33－34]。
相对亚洲栽培稻与非洲栽培稻杂交F1完全不育的情况，籼粳交F1仅为部分不育，却也报道了大量的育性位点及标记偏分离区域[34]。
另外种内杂交不育也出现了大量的报道，近来进化研究的热点渐渐集中在种内的生殖障碍机制是如何形成的，且具有生殖隔离的品种如何共存于同一群体中这一问题上[35]。
配子消除子最早报道于西红柿，是由等位基因与作而导致配子发育中止[36]。
花粉灭杀子和卵子灭杀子作用于孢子发育的时期在亚洲栽培稻种内籼、粳间杂交和亚洲栽培稻与非洲栽培稻种间杂交中都有报道[37]。
1.2.3亚洲栽培稻与非洲栽培稻种间生殖隔离的研究进展
不可交配性[38－39]及花时不遇[40]在一定程度上造成的亚洲栽培稻与非洲栽培稻种间生殖隔离已有部分报道，但大量的栽培稻种间杂交研究工作表明，两个栽培稻种间杂交可得到正常的F1种子，F1减数分离及染色体配对正常，但表现为完全雄性不育[41]，因此杂种的高度不育是这两个栽培种间最明显的生殖障碍[20－21,30,38－39]，若能有效克服种间杂种生殖隔离，将为非洲栽培稻有利基因的利用开启了大门，亦有利于研究两个种的起源、演化关系和分类地位。
栽培稻种间杂种不育的遗传机制比较复杂，除细胞质导致的不育外[42－43]，由非洲栽培稻引入亚洲栽培稻的不育基因，已报道的核基因，有位于第6染色体的配子消除子（Gameteeliminator）S1,与糯性基因Wax之间的交换值为2.4-3.4%[44－48]，以及一系列的花粉灭杀基因（Pollenkiller）S3（11染色体）[49]、S18（10染色体）[50－51]、S19（3染色体）[52]、S20（7染色体）、S21（7染色体）[53]、S29（t）[54]等。
Heuer（2003）[55]等通过“广亲和品种”对非洲栽培稻进行分析得出，两个栽培稻间的育性障碍并不仅是由几个单基因或寡基因控制的，而是还存在其它育性位点，甚至较籼粳交间的位点还多。
Tao等（2003）通过实验分析也得出结论，栽培稻种间杂交育性表现为数量性状位点控制的复杂遗传模式。
数量性状表现为连续变异,受环境的影响较大,不能依照质量性状的处理方法将单个基因的效应区分开来,因此目前要想单独依靠传统育种方法和技术在现有基础上有大的突破,难度越来越大。
近年来，数量遗传学和现代生物技术的发展为作物育种赋予了新的活力,借助DNA分子标记和QTL作图,复杂的数量性状可剖分为若干离散的孟德尔因子所决定的组分,进而确定其在染色体上的位置及其与其它基因的关系[56]。
1.3遗传标记
分子标记的进展已经使得数量性状位点（QTL）的作图和分析成为可能[57]。
作为生物技术的一个重要的组成部分，分子标记在基因组学、遗传学和作物育种学中扮演越来越重要的角色。
作为常用的手段和方法，全基因组作图为研究影响植物生长和发育的遗传信息系统提供了独特的机遇。
从技术上讲，基因组作图包括了诸如基因图谱（分子连锁图）的构建、基因定位、QTLs分析、物理图谱等全基因组或特殊基因组区段的图谱。
分子标记最主要的优点是：
（1）表现中性，在分子标记位点的等位基因能导致生物个体基因型的显著变化但又不随个体生长发育的变化而变化。
（2）多态性，分子标记位点比形态标记位点有较高的等位基因的变异。
（3）丰富性，分子标记比形态标记和蛋白质标记有更多的可利用标记。
（4）共显性，许多分子标记等位基因表现为共显性。
（5）无上位性，分子标记位点正常的不会表现为上位性[58]。
第一类分子标记是限制性片段长度多态性（RFLP），这种标记从用来构建人类的遗传图谱[56]开始，到现在己作为了一种普通的遗传分析方法。
从那时起，开发了大约20种不同类型的分子标记技术并被用于遗传图谱的构建和基因的定位。
这些分子标记能够分为两类：
一是基于DNA杂交的如RFLP、FISH标记。
另一类是基于PCR反应的如RAPD、SSR、STS。
AFLP标记则是综合了上述二者而发展的一种技术。
另外在RFLP的分析中，最有应用前景的新方法是融合了AFLP和微卫星分析[59]。
基于在许多物种上应用的显著进展，简单序列重复（SSR），或者称为微卫星的技术已经成为继RFLP之后的第二代分子标记[60]。
微卫星是简单的以相同的2－4核苷酸序列为单元的、前后衔接的、两端具有保守核苷酸序列的一段DNA片段，因为它们的共显性、高水平的等位基因的多样性、容易和经济地用PCR进行检测的特点而被看作是有价值的遗传标记[61]。
越来越多的SSR标记已经被开发出来并被 应用于稻属几个种的遗传图谱的构建[62－65]。
1.4分子标记定位QTL的原理
1991年，第一次把分子标记用于水稻的白叶枯病和稻瘟抗性基因的标记[66]。
后来利用分子标记已经定位了许多病虫害的抗性及一些控制农艺性状的基因[67－68],这些基因包括了稻瘟病、白叶枯病、稻缨蚊、细条病、黄斑驳病毒病、耐水淹、温敏雄性不育、光敏感雄性不育、野败不育和香味等基因。
育种家在进行作物改良时通常采用带有所需性状的亲本进行杂交，在后代的分离群体中进行选择，之后用反复自交的方法固定所选性状，由此获得较亲本优越的品种，从而达到了作物改良的目的。
对于那些由效应较大的单基因控制的性状来说，传统的育种方法是可行的。
然而大多数农艺及产量性状由多基因或数量性状位点控制，因此育种家们不得不面对由多个位点控制的复杂数量性状的改良工作。
由于数量性状表型呈连续型变异，很难将其表现型进行划分，且控制数量性状的基因受环境影响比较大[69]，因此对数量性状的研究一直是作物改良中的一个难点。
传统作物改良方法在解决数量性状问题时受到了挑战，基于DNA水平上的遗传多态性的分子标记由此受到关注。
QTL定位实质上就是分析分子标记与控制目标性状的基因之间的连锁关系。
早在1923年，Sax就试图分析数量性状多基因与形态标记之间的连锁关系，但由于形态标记数量有限而未能进行系统的研究。
自从RFLP用于人类基因组研究后，分子标记技术迅速发展，数量性状的研究进入了新的QTL时代，先后提出了多种QTL定位方法。
这些方法可分为2大类[70]，一类是基于性状的分析方法（Trait-basedanalysis，即TBA法），利用分离群体的两极端表型个体，分析标记与QTL的连锁关系，检验标记基因型在两极端类型内的分离比是否偏离孟德尔规律。
另一类是基于标记的分析方法（Marker-basedanalysis，即MBA法），指如果某标记与QTL连锁，并且在一定程度上共分离，则不同标记基因型的表型值存在差异，分析这种差异，即可推测标记与QTL的连锁关系。
MBA方法通常有3类，即单标记法、性状—标记回归法和性状—QTL回归法。
性状—QTL回归法又包括区间作图法、复合区间作图法，以及基于混合线性模型的复合区间作图法。
尽管QTL定位方法很多，但其遗传原理却是相同的，即当标记与性状的某个QTL连锁，不同标记基因型个体的表型值将存在显著差异，QTL分析就是以这些连锁发生为基础而进行的[70]。
1.4.1方差分析法（analysisofvariance,ANOVA）
这是以传统的单因素方差分析检验被研究数量性状在标记基因型间的差异显著性。
这种方法直观而简便，其统计基础也是稳健的。
主要问题在于检测到的QTL通常不会正好在标记所在位点上，这就导致对该QTL的位置和效应的估计偏差。
这种方法适合于严重偏分离而无法获得连锁图谱的群体，或遗传结构非常复杂、不能用区间或复合区间作图的群体[71]。
1.4.2区间作图法（intervalmapping,IM）
此方法最早是由Lander&Botstein于1989[72]年提出来的。
它利用染色体上1个QTL两端各一个标记，建立个体数量性状测量值对双侧标记基因型指示变量的线形回归关系，以分离检验统计量中重组率和QTL效应。
IM法已广泛应用于人类遗传研究，并被认为是构建QTL图谱的标准统计方法。
但该方法定位的QTL区间往往过宽，当同一性状在同一染色体上有两个或两个以上QTLs时，常常会发生重叠或标错QTL的位置[73]。
1.4.3复合区间作图法（compositeintervalmapping,CIM）
这是Zeng于1994年在区间作图法基础上发展起来的新的作图方法。
该方法对某一特定标记区间进行检测，同时把与其它QTL连锁的标记也考虑在模型中以控制背景遗传效应（BackgroundControls）。
该方法保留了区间作图的优点，在较大程度上控制了遗传背景和遗传效应，提高了作图的精度和效率。
但此方法不能分析上位性和QTL与环境互作等复杂的遗传学问题，在定位与环境有较大互作的性状时容易出现偏差。
一方面它可能减少剩余方差，提高检测能力；另一方面它又可能降低测验统计量的显著水平，减少功效[74]。
1.4.4混合线性模型方法（mixedmodelapproaches,MMA）
1998年，朱军等提出用随机效应的预测方法获得基因型效应及基因型Χ环境互作效应的预测值，然后再用区间作图法或复合区间作图法分别进行遗传主效应及基因型X环境互作效应的QTL定位分析，并给出了发育性状的条件QTL定位分析方法。
与复合区间作图方法相比，用混合线性模型方法可避免所选择标记对QTL效应分析的影响，还能分析QTL与环境的互作效应。
基于混合线性模型的复合区间作图方法，可
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