质粒提取原理和方法.docx

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质粒提取原理和方法

质粒DNA提取的原理及方法

碱裂解法质粒DNA提取原理

质粒DNA提取主要包括以下几个方面：

如何将细胞裂解释放质粒DNA，如何将质粒DNA和基因组DNA分离开来，如何去除RNA污染，如何去除蛋白质和其它杂质。

质粒提取方法中，最常用的方法是碱裂解法，它具有得率高，适用面广，快速，纯度高等特点。

其原理是：

强碱性条件下，质粒DNA和基因组DNA同时从细胞中释放出来，并发生变性。

在pH中性，并有高盐浓度存在的条件下，质粒DNA会迅速发生复性，仍为可溶性状态，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，在去垢剂SDS作用下，染色体DNA与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，通过离心去除沉淀后，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA，用异丙醇或乙醇沉淀可将之纯化出来。

BIOMIGA公司质粒DNA纯化系列试剂盒，采用碱裂解法质粒提取原理，在高盐环境下，采用硅胶膜特异性的吸附质粒DNA，而蛋白质不被吸附，最后用低盐洗脱液将DNA从膜上洗脱下来，方法简单，快速，质量好，收获量高。

影响质粒提取的因素

影响质粒提取的因素有很多种，如质粒拷贝数，宿主菌株的种类，细菌的培养时间、培养基种类、培养条件等等。

质粒拷贝数

质粒DNA最终收获量取决于质粒的拷贝数和质粒的大小。

BIOMIGA公司质粒DNA提取系列试剂盒，操作步骤适用于高拷贝数质粒的纯化，对于低拷贝质粒纯化提取，应加大起始菌液量的体积，并且相应地增加各种缓冲液的用量。

下表给出一些常用质粒载体的拷贝数：

质粒种类

复制起点

拷贝数

1mL菌液质粒DNA收获量（μg）

pSC101

pSC101

5

pMB1

300-400

6-7

pBluescriptR

ColE1

300-500

6-8

pUC

MutedpMB1

500-700

8-12

宿主菌株

宿主菌株的种类将会影响质粒的收获量。

含内源核酸酶的宿主菌株，如JM101,JM110,HB101,TG1以及它们的衍生菌株，通常因为内源核酸酶的存在，或者在提取过程中释放出来的核酸酶的作用下，将会显着影响最终收获量，或者纯化到的质粒容易降解，推荐客户将质粒转化至不含内源核酸酶的宿主菌株中，如Top10,DH5a进行质粒纯化。

如果从含内源核酸酶的宿主菌株中纯化质粒DNA，请用试剂盒附送的核酸酶去除溶液，去除核酸酶的污染。

或选用HP系列试剂盒进行质粒的纯化。

下表给出一些常用的宿主菌株种类：

EndA-StrainsofE.Coli

DH5α

DH1

DH21

JM106

JM109

SK2267

SRB

XLO

TOP10

DH10B

JM103

JM107

SK1590

MM294

Stbl2

XL1-Blue

BJ5182

DH20

JM105

JM108

SK1592

Select96

Stbl4

XL10-Gold

EndA+StrainsofE.Coli

C600

JM110

RR1

ABLEC

CJ236

KW251

P2392

BL21（DE3）

HB101

TG1

TB1

ABLEK

DH12S

LE392

PR700

BL21（DE3）pLysS

JM101

JM83

TKB1

HMS174

ES1301

M1061

Q358

BMH71-18

AllNMstrains

AllYstrains

菌液培养

BIOMIGA公司质粒DNA提取系列试剂盒，标准操作适用于在LB培养基中培养12~16小时，OD600在~的菌液质粒DNA的提取。

如果使用丰富培养基，如TB，2xYT培养基，请保证OD600不超过。

菌液过量，将会影响最终的收获量和纯度。

培养方式

如果用于质粒小提，请从固体培养基平板上挑取新鲜单菌落，接种到加入筛选抗生素的培养基中，震荡培养12~16小时。

如果用于中提、大提或超大提，请按照以下方式制备菌液：

挑取单克隆，接种到1~5mL培养基中，进行初摇，然后按照1:

1000的比例进行放大培养，培养瓶中培养基的体积最好不要超过培养瓶的1/4体积。

抗生素浓度的选择

对含有抗性的质粒载体，在进行筛选或培养时应加入相应的抗生素。

各种抗生素的工作浓度请参照下表：

抗生素

溶解性

保存条件

严紧型质粒

松弛型质粒

氨苄青霉素

50mg/mL（溶于水）

-20℃

20μg/mL

60μg/mL

羧苄青霉素

50mg/mL溶于水

-20℃

20μg/mL

60μg/mL

氯霉素

34mg/mL溶于无水乙醇

-20℃

25μg/mL

170μg/mL

卡那霉素

10mg/mL溶于水

-20℃

10μg/mL

50μg/mL

链霉素

10mg/mL溶于水

-20℃

10μg/mL

50μg/mL

四环素

5mg/mL溶于无水乙醇

-20℃

10μg/mL

50μg/mL

质粒质量鉴定

纯化到的质粒DNA一般可以通过以下三种方式进行质量鉴定。

琼脂糖凝胶电泳检测

理想条件下，经碱裂解法纯化到的质粒DNA，应该只出现超螺旋一条带。

但在质粒提取过程中机械力，强碱溶液的作用等原因，纯化到的质粒常常会出现三条带，甚至有时候会出现四条带（变性超螺旋），不管是哪种形式的超螺旋，经单酶切后，呈现一条带，则说明提取结果正常，没有基因组污染。

酶切鉴定

纯化到的质粒，进行进一步的酶切操作，鉴定质粒的大小。

紫外分光光度计检测

纯化到的质粒，稀释一定的倍数，通过测定OD280，OD260，OD230，计算收获量和纯度。

OD260/OD280在~之间，说明质粒纯度较好。

如果洗脱时用去离子水洗脱，测光吸收时，pH值和离子浓度会影响光吸收值，比值会偏低，但并不表示纯度低。