关于DAD秘籍.docx

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关于DAD秘籍

关于“DAD秘籍”    

二极管阵列检测器目前已在高效液相色谱分析中大量使用，一般认为是液相色谱最有发展、最好的检测器。

随着DAD检测器的普及，我们很多客户反馈在使用DAD的过程中有些许疑惑，于是小桂版的DAD秘籍应运而生，帮助用户无忧修炼:

） 

要进入正题了，好激动 =￣ω￣=

1明表象

四张图分清紫外检测器（UVD）和二极管阵列检测器（DAD）

     外观差不多：

  原理有不同:

一句话概括：

紫外检测器先分光，取得单色光再通过流通池，用光电二极管检测，只能获得特定波长的信号；

二极管阵列检测器复色光先通过流通池，再分光，整个光谱由二极管阵列检测，同时获得一段光谱范围内信号。

    功能有差异：

DAD谱图更丰富：

DAD是大势所趋

   一般情况下，二极管阵列检测器可以完全替代紫外检测器。

同时因为DAD可以获取更多的数据信息，用于辅助定性和光谱检索，因此DAD的使用会越来越普遍。

2知用法

    DAD再牛，也要会使用。

相对紫外检测器，DAD的设置和参数优化会更多一些，对使用者的要求也高一些。

不过不用怕，只要掌握了下面的秘籍，你也可以轻松玩转DAD。

    有硬件就要有软件，DAD全部由工作站来控制。

下面就以RIGOLUltraChrom 和安捷伦Chemstation为例，看看工作站方法设置。

（实验方法是药典、标准等既定方法规定的，按照方法中的要求设定方法。

） 

1.下面来看看 RIGOL Ultrachrom工作站方法设置:

 这个方法，用紫外检测器得跑三遍，但用DAD可以一次搞定，如何设置，看下图：

2.再来看看 安捷伦Chemstation工作站方法设置：

【插播】DAD 方法中参数说明：

【一般情况下】

样品波长：

按照方法要求选择检测波长，可以参考下文中的详细说明。

样品带宽：

主要影响峰高和基线噪音，因此优化带宽可以获得最佳信噪比；样品带宽选择的最直接依据是其吸收光谱中峰的峰宽，详见后面的解释。

4nm是比较通用的样品带宽。

参比波长：

选择合适的参比波长可以减小梯度洗脱过程中的基线漂移，甚至可以通过优化参比波长对共流出峰（没分开的峰）做分别检测。

一般选择在靠近样品信号的无吸收或低吸收区域，请参考下文详细说明。

参比带宽：

是参比波长取值的波长范围，影响参比波长设置的实际效果。

参比带宽至少要与样品波长的带宽相等，许多情况下选择100nm作为缺省值，如果在不想用参比波长的情况下，也可以直接将带宽设置为0（或去掉参比波长前面的勾，如Agilent仪器）。

波长范围：

是工作站采集3D光谱数据的波长范围。

一般按照方法要求，没有要求则需要包含所有被测物质的检测波长，但是较宽的波长范围采集会占用更多的磁盘空间。

步进:

 一般选择1nm，步进的选择对谱带数据点数有影响。

采样率/峰宽：

采样率和峰宽是同一目的的两种不同实现方式，其目的都是为了真实的采集到一个色谱峰。

一般选择10Hz。

采样率高能更真实的还原峰型，但会带来更大的基线噪音。

反之过低的采样率会导致峰变形，但基线噪声更小。

选择合适的采样率以获得最佳的信噪比。

曝光时间：

这是RIGOLL-3520DAD的一项高级参数设置，一般选择20ms

滤波设置:

 这是RIGOLL-3520DAD的一项高级参数设置，快/正常/慢/无，一般选择正常

要弄明白一般为什么这样设置，请您接着看每个参数的意义~

3懂原理

1.  样品和参比波长及带宽

简单说：

你看到的色谱图上的最终吸光度值是这么来的：

吸光度=以样品波长为中心在样品带宽范围内的所有波长吸光度平均值-以参比波长为中心在参比带宽范围内的所有波长吸光度平均值

这个吸光度是实时计算的，你看到的色谱图中的每一个点，都是这个公式计算来的。

（当然如果关闭了参比波长，就没有后半截了）

晕了吧？

打个比方，检测器方法中的信号A设置为样品254.0/4、参比360.0/100，即从252到256nm波长范围内的平均吸光度减去从310到410nm波长范围内的平均吸光度。

有什么用？

想一想，我们在走梯度，流动相的组成时时变化，导致基线漂移，大家应该经常遇到。

为啥会这样？

主要因为流动相变化时：

（1）流动相组成变化导致背景吸收变化（尤其是检测波长比较短的时候，如203nm）；

（2）流动相组成变化导致折光系数改变（这个是流通池里面光折射的物理的影响）。

现在回顾下上面的公式，其实：

吸光度=（样品吸收+背景吸收）-（参比吸收+背景吸收）

如果我们把参比波长选在一个样品没吸收的地方，则：

吸光度=（样品吸收+背景吸收）-（0+背景吸收）

换句话说，背景变化被扣掉了所以基线不飘了！

就像下面这样：

（此图片来源于Agilent用户手册）

所以，小伙伴们，用DAD时，正确选择参比波长，是纠正基线漂移的法宝。

还有，一般参比带宽都选的那么宽，为啥？

因为，带宽越宽，被平均的数据点越多，偶然性变化带来的影响越低，背景扣除越准确稳定。

100nm是比较常用的参比带宽。

但参比带宽范围内注意不要有吸收，否则会降低峰高，搞不好出来一堆倒峰。

样品带宽为啥多数是4nm？

样品带宽决定了样品信号平均的波长范围，显然带宽越宽，平均的越多，基线越稳定。

但如果太宽了，峰的高度和光谱的分辨率都会受影响，后面小编会通过专题讲这是为啥，敬请期待！

这里只要记住，带宽宽，基线噪声小，峰高降低；带宽窄，基线噪声大，峰高受影响小。

如下图：

一般4nm就可以了~

（此图片来源于Agilent用户手册） 

2. 步进

就是采集光谱时，离多远采集一个数据点。

步子大了，得到的光谱图清晰度不够；步子小了，会产生大量的数据迅速填满你的磁盘。

而光谱图的清晰度，又会影响峰纯度分析时的准确性，所以选择什么样的步进，还要看看以后的用途。

3．采样率/峰宽：

采样率和峰宽是同一目的的两种不同实现方式，其目的都是为了真实的采集到一个色谱峰。

一般选择10Hz，采样率高能更真实的还原峰型，但会带来更大的基线噪音。

反之过低的采样率会导致峰变形，但基线噪声更小。

选择合适的采样率以获得最佳的信噪比。

来张图就明白了~

4.曝光时间

曝光时间属于RIGOLL-3520DAD高级选项，曝光时间与采样率有负相关，同时也跟曝光次数有关。

一般选择20ms就可以满足要求了，不需要用户做过多设置。

5. 滤波

滤波属于RIGOLL-3520DAD高级选项，滤波是针对采集后的基线做了微小的处理。

滤波目前有四种速度，分别是快、正常、慢和无。

滤波速度越慢滤波相对效果会好一些，但是平常使用选择正常就可以了。

4懂数据

 PDA视图分析

按照正确的设置方法，待测物质分析完毕，则需要使用PDA视图：

3D谱图可以比较直观地查看 信号-时间-波长 三维视图，通过调整等高图中横轴（波长轴）即样品的检测波长，纵轴（时间轴）即保留时间，可以得到合适的色谱图和光谱图，通过峰纯度可以确定检测峰是否含有其它物质。

确切地说，每种一定浓度范围内的具有紫外吸收的物质都会有其独特的光谱图，通过比较对照品与供试品谱图目标峰的保留时间范围内的光谱图，如不相同则不含待测物质。

5解难题

DAD常见问题分析:

1.浓度太高超量程平头了

2.浓度太低噪声已经掩盖了部分峰形

这两种情况的处理方法：

适当地增减样品的浓度，保证光谱图在合适的浓度范围内显示。

同时也需要考虑到流动相的温度、成分或PH值的变化。

以下是一种或多种因素可造成吸光度光谱的形状差异：

1. 检测器噪声（流动相温度的变化）

2. 高浓度样品引起测光误差（应将化合物的最大吸光度控制在1AU以下）

3. 流动相PH值或成分改变（如下图所示）

3.色谱图出现倒峰的问题

这种情况的处理方法：

 在3D谱图里观察最大吸收波长出现倒峰，可能是因为你选的参比波长不合适 。