萌发小麦淀粉酶酶学性质的研究.docx
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萌发小麦淀粉酶酶学性质的研究
萌发小麦淀粉酶酶学性质的研究
Enzymaticpropertiesofthediastasefromgerminantwheat
东北农业大学生命科学学院
摘要：
本文主要以萌发小麦为原材料，制作出麦芽糖标准曲线，再提取出淀粉酶粗酶液，研究温度、pH、激活剂及抑制剂对淀粉酶的活性的影响，测定萌发小麦种子不同位置α淀粉酶和总酶活力。
用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位质量样品一定时间生成的麦芽糖的量表示酶活力。
淀粉酶将淀粉水解，通过碘遇淀粉变蓝的性质及变色现象，可以判定反应速度以及最适温度、pH，同时激活剂可以增强酶活性和抑制剂可以抑制酶活性。
由实验可知低温抑制酶活性，高温使酶失活，40℃是小麦淀粉酶的最适温度；酶的催化活性受pH极为显著，酶在最适PH值时，表现活性最高，高于或低于最适pH值时，活性逐渐较低。
对于淀粉酶，酸性失活、碱性抑制，最适pH=5.6；氯离子是小麦淀粉酶的激活剂，铜离子是小麦淀粉酶的抑制剂。
关键词：
酶活性淀粉酶温度pH值激活剂抑制剂
生物体内的新陈代谢是一切生命活动的基础。
新陈代谢是由许多复杂而有规律的化学反应组成，酶是生物体系中的催化剂，生物体内的各种化学反应包括物质转化和能量转化，都是在特定的酶催化下反应的，由于自然界中生物长期进化和组织功能分化的结果，酶在机体中受到严格的调控，使错综复杂的代谢过程有序进行。
可以说，没有酶的参与，生命活动即告终止[1]。
酶是一种具有催化活性的蛋白质，由氨基酸通过肽链连接而成,只有在适当的温度、pH和离子强度下才具有生物活性,有些酶还需要辅酶或者辅因子[2]。
酶有两种功能:
其一，催化各种生化反应,是生物催化剂；其二，调节和控制代谢的速度、方向和途径，是新陈代谢的调节元件。
酶对细胞代谢的调节主要有两种方式:
一是通过激活或抑制以改变细胞内已有酶分子的催化活性；另一种是通过影响酶分子的合成和降解，以改变酶分子的含量。
这种酶水平的调节机制是代谢的最关键的调节[3]。
现代酶学的研究主要包括酶学理论、酶工程和酶应用3部分[4]。
它们是现代生物技术的重要组成部分，应用范围包括医药，食品，化学工业，诊断分析和生物传感器，涉及的品种不少，如淀粉酶，其市场需求生产规模和产值均很乐观，并已产生巨大经济效益[5]。
许多微生物包括细菌、真菌和酵母都能生产淀粉酶，这些廉价的淀粉酶来源，已广泛应用于食品、医药、饲料和环保等生产实践中[6]。
而且随着新技术的发展，对酶物理化学特性及催化分子机理的了解，诱发酶学及酶工程的迅速崛起，成为生物工程的支柱，与基因工程、蛋白质工程、发酵代谢工程的细胞工程构成了不可分割的相互交叉的整体工程[7]。
所以酶学的深入研究在探讨生命现象的本质上至关重要的。
测定淀粉酶活性的方法有许多，如在医学上测定淀粉酶活性的方法有：
简易快速纸片测定法[8]；苏木杰氏快速计时法[9]；单一稳定液体试剂直接测定法[10]等。
而且池永焕，黄菱红等探究了温度对淀粉酶活性的影响[11]；沈文英,胡洪国,潘雅娟研究了温度和PH值对南美白对虾（Penaeusvannmei）消化酶活性的影响[12]；司红起,马传喜,董召荣,吴大鹏,高俊进行了小麦多酚氧化酶抑制和激活效应的研究[13]。
本实验仅限于酶学研究的最基本的理论和实验技能。
通过此次实验研究，让我们进一步加深对淀粉酶的认识和学习，同时培养我们设计实验的基本思路，学会科学的实验组合，提出合理的实验方案,为以后研究其他种类的酶提供了研究方法和实验依据,也为我们以后更多的设计型实验作好铺垫。
1.材料与方法
1.1材料：
小麦（Triticumaestivum）（由东北农业大学生命科学学院生化教研室提供）
1.2方法
1.2.1麦芽糖标准曲线的制作
取6支干净的具塞刻度试管，分别编号1、2、3、4、5、6。
依次分别加入麦芽糖标准液0mL、0.2mL、0.6mL、1.0mL、1.4mL、1.8mL，蒸馏水2.0mL、1.8mL、1.4mL、1.0mL、0.6mL、0.2mL，3,5-二硝基水杨酸各2.0mL。
（麦芽糖含量依次为0mg、0.2mg、0.6mg、1.0mg、1.4mg、1.8mg）药品加好后摇匀，置于水浴中煮沸5min，取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20mL，以1号管作空白调零点在540nm波长下比色测定光密度，以麦芽糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。
1.2.2淀粉酶粗酶液的提取
称取1g萌发的小麦种子置于研钵中，加入少量石英砂和2mL蒸馏水研磨匀浆，将匀浆倒入刻度试管中定容至25mL，提取液在室温下静置提取15~20min每隔数分钟搅动一次，使其充分提取，然后在4000rp/min转速下离心10min，将上清液倒入一个干净试管中，即为淀粉酶粗酶液.
1.2.3温度对淀粉酶的活性的影响
准备8支试管分别编号A、a、B、b、C、c、D、d。
在A、B、C、D中分别加入pH=5.6的缓冲液1mL,然后分别加入2.5mL淀粉溶液。
在a、b、c、d中分别加淀粉酶提取液1mL。
将A、a放在4℃的环境下预保温10min；将B、b放在室温的环境下预保温10min；将C、c放在40℃的环境下预保温10min；将D、d放在沸水浴的环境下预保温10min。
然后将A倒入到a中，将B倒入到b中，将C倒入到c中，将D倒入到d中。
将a、b、c、d分别放在4℃、室温、40℃、沸水浴10min。
最后在各试管中加入碘液各三滴，并记录观察到的颜色。
1.2.4pH对淀粉酶的活性的影响
准备三支试管分别编号Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，在试管Ⅰ中加入PH为3.0的缓冲液2ml。
同理在试管Ⅱ中加入pH为5.6、试管Ⅲ中PH为8.0的缓冲液2mL。
然后再各加入淀粉溶液2.5mL，淀粉酶提取液1mL。
摇匀,40℃水浴10min。
最后各加碘液3滴，将并记录观察到的颜色。
1.2.5激活剂与抑制剂对淀粉酶的活性的影响
准备三支试管分别编号Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，首先各加缓冲液（pH5.6）2mL。
然后在Ⅰ中加NaCl溶液1mL,Ⅱ中加CuSO4溶液1mL,Ⅲ中加水1mL。
在三个试管中各加2.5mL淀粉溶液及1mL淀粉提取液，摇匀,40℃水浴10min。
最后各加碘液3滴，并记录观察到的颜色。
1.2.6α-淀粉酶活力的测定
分别称取2g萌发的小麦种子根、芽、麦粒，置于研钵中，加入少量石英砂和2ml蒸馏水研磨匀浆，将匀浆倒入离心管，提取液在室温下静置提取15~20min每隔数分钟搅动一次，使其充分提取，然后在4000rp/min转速下离心10min，将上清液倒入25mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度摇匀，即为淀粉酶原液。
（用于α-淀粉酶活力的测定）
准备4支干净的试管。
分别编号为0、1、2、3。
分别向1、2、3、号管中加入淀粉酶原液1mL，然后将各试管和淀粉溶液置于70℃水浴中15min，取出后冷却，再将各试管和淀粉溶液置于40℃水浴中保温10min，然后分别在1、2、3号管中加入pH=5.6的柠檬酸铵缓冲液1mL，向1管中加入氢氧化钠4mL,分别向1、2、3号管中加入淀粉溶液2.0mL，0号管内加入蒸馏水2mL作为空白组，在40℃水浴中进行准确保温5min;最后在2、3号管中加入氢氧化钠各4mL（终止酶促反应）。
将各试管摇匀，分别取1mL,放入25mL刻度试管中，再加入2mLDNS试剂混匀，置于沸水浴中煮沸5min,取出冷却，用蒸馏水稀释至25mL混匀，在分光光度计为540nm处进行比色，测定光密度值，记录测定结果。
按照以上步骤分别测定小麦芽和跟试验过后的光密度值，记录测定结果。
1.2.7淀粉酶总活力的测定
分别称取2g萌发的小麦种子根、芽、种子，置于研钵中，加入少量石英砂和2mL蒸馏水研磨匀浆，将匀浆倒入离心管，提取液在室温下静置提取15~20min每隔数分钟搅动一次，使其充分提取，然后在4000rp/min转速下离心10min，将上清液倒入25mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度摇匀，即为淀粉酶原液。
（用于α-淀粉酶活力的测定）吸取上述淀粉酶原液1mL，放入2mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶稀释液。
（用于淀粉酶总活力的测定）
准备4支干净的试管。
分别编号为0、1、2、3。
分别向1、2、3、号管中加入淀粉酶稀释液1mL，然后将各试管和淀粉溶液置于40℃水浴中保温10min，分别在1、2、3号管中加入pH=5.6的柠檬酸铵缓冲液1mL，向1管中加入氢氧化钠4mL,分别向1、2、3号管中加入淀粉溶液2.0mL，0号管内加入蒸馏水2mL作为空白组，在40℃水浴中进行准确保温5min;最后在2、3号管中加入氢氧化钠各4mL（终止酶促反应）。
将各试管摇匀，分别取1mL,放入25mL刻度试管中，再加入2mLDNS试剂混匀，置于沸水浴中煮沸5min,取出冷却，用蒸馏水稀释至25mL混匀，在分光光度计为540nm处进行比色，测定光密度值，记录测定结果。
按照以上步骤分别测定小麦芽和跟试验过后的光密度值，记录测定结果。
[14]
2.结果
2.1麦芽糖标准曲线的制作
麦芽糖含量/mg
0.0
0.6
1.0
1.4
1.8
光密度
0.000
0.071
0.119
0.185
0.233
2.2温度对淀粉酶的活性的影响
图1
从右到左依次为4℃、室温、40℃、沸水
1．4℃：
酶的活性几乎完全被抑制，淀粉未被水解，加入碘液后呈红棕色
2．室温：
酶的活性受到一定的抑制，淀粉被部分水解，加入碘液后呈褐色
3．40℃：
酶的活性达到相对最大，淀粉完全被水解，加入碘液后浅黄色
4．沸水浴：
酶因高温完全失活，淀粉未被水解，加入碘液后呈蓝色
由此可以看出低温抑制酶活性，高温使酶失活，40℃是小麦淀粉酶的最适温度。
2.3pH对淀粉酶的活性的影响
图2
从左到右依次为pH=3.0、5.6、8.0
1.PH=3.0：
淀粉酶完全失活，淀粉未被水解，加入碘液后呈红棕色
2.PH=5.6：
淀粉酶活性达到相对最大，淀粉被完全水解，加入碘液后呈浅黄色
3.PH=8.0：
酶活性受抑制，淀粉被少量水解，加入过量碘液后呈褐色
由此可以看出酶的催化活性受pH极为显著，酶在最适PH值时，表现活性最高，高于或低于最适pH值时，活性逐渐较低。
对于淀粉酶，酸性失活、碱性抑制，最适pH=5.6。
2.4激活剂与抑制剂对淀粉酶的活性的影响
图3
从右到左依次为1、2、3、4
1.加NaCl的溶液：
淀粉酶活性增加，使淀粉完全水解，加入碘液后呈灰色。
2.加CuSO4的溶液：
淀粉酶活性降低，淀粉被部分水解，加入碘液后呈深蓝色。
3.加Na2SO4的溶液：
淀粉酶活性不变，使淀粉水解，加入碘液后呈无色。
4.空白对照组：
加入碘液后几乎呈无色。
由此可以看出氯离子是小麦淀粉酶的激活剂，铜离子是小麦淀粉酶的抑制剂。
2.5α-淀粉酶活力的测定
（1）小麦种子的芽：
OD（0）=0.000OD
（1）=0.058OD
（2）=0.080OD（3）=0.069
麦芽糖含量/mg依次为0.453、0.625、0.539
根据公式：
α-淀粉酶活性（麦芽糖/g鲜重/min）=
得小麦种子芽α-淀粉酶活性=2.578mg.g-1（鲜重）.min-1
（2）小麦种子的麦粒OD（0）=0.000OD
（1）=0.009OD
（2）=0.044OD（3）=0.062
麦芽糖含量/mg依次为0.070、0.344、0.484
根据公式：
α-淀粉酶活性（麦芽糖/g鲜重/min）=
得小麦种子的麦粒α-淀粉酶活性=6.875mg.g-1（鲜重）.min-1
（3）小麦种子的根OD（0）=0.000OD
（1）=0.015OD
（2）=0.032OD（3）=0.036
麦芽糖含量/mg依次为0.117、0.250、0.281
根据公式：
α-淀粉酶活性（麦芽糖/g鲜重/min）=
得小麦种子的根α-淀粉酶活性=2.969mg.g-1（鲜重）.min-1
A—α淀粉酶水解生成麦芽糖毫克数
A’—α淀粉酶对照管
C—比色时所用的毫升数
t—5min
2.6淀粉酶总活力的测定
（1）小麦种子的芽OD（0）=0.000OD
（1）=0.010OD
（2）=0.030OD（3）=0.021
麦芽糖含量/mg依次为0.078、0.234、0.164
根据公式：
总淀粉酶活性（麦芽糖/g鲜重/min）=
得小麦种子芽总淀粉酶活性=30.273mg.g-1（鲜重）.min-1
（2）小麦种子的麦粒OD（0）=0.000OD
（1）=0.006OD
（2）=0.099OD（3）=0.076
麦芽糖含量/mg依次为0.047、0.773、0.594
根据公式：
总淀粉酶活性（麦芽糖/g鲜重/min）=
得小麦种子的麦粒总淀粉酶活性=159.180mg.g-1（鲜重）.min-1
（3）小麦种子的根OD（0）=0.000OD
（1）=0.020OD
（2）=0.040OD（3）=0.039
麦芽糖含量/mg依次为0.156、0.313、0.305
根据公式：
总淀粉酶活性（麦芽糖/g鲜重/min）=
得小麦种子的根总淀粉酶活性=38.086mg.g-1（鲜重）.min-1
B—（α+β）淀粉酶共同水解生成麦芽糖毫克数
B’—（α+β）淀粉酶对照管
C—比色时所用的毫升数
t—5min
3.讨论
研究结果表明，pH=5.6，T=40℃的条件下，萌发小麦种子的根、芽、麦粒中淀粉酶总活性分别为38.086mg.g-1（鲜重）.min-1、159.180mg.g-1（鲜重）.min-1、30.273mg.g-1（鲜重）.min-1，而α-淀粉酶的活性分别为2.969mg.g-1（鲜重）.min-1、6.875mg.g-1（鲜重）.min-1、2.578mg.g-1（鲜重）.min-1；40℃左右时，酶的活性最高，室温下活性较高，0℃时淀粉酶活性明显下降，100℃时淀粉酶几乎已失活；pH为5.6时，酶的活性最大，pH=3.6时和pH=8.0时淀粉酶活性降至最低；Cl-使酶的活性增强，Cu2+使酶活性减弱。
然而，想要得出40℃是否是淀粉酶的最适温度，还要通过进一步的实验来探究。
事实上，酶最适温度不是一个恒定的数值，它受底物的种类、浓度、缓冲溶液成分及反应条件等影响，最适温度也不是酶的特征性物理常数。
酶作用时间长短影响最适温度值。
酶在短时间内能耐受较高温度;当反应时间延长时,最适温度向低温方向移动例如，反应时间延长，最适温度将降低。
同样,想得出pH=5.6是否是淀粉酶的最适PH，还要通过进一步的实验来验证。
由于加入NaSO4与加入蒸馏水的试管中反应淀粉酶活性相近，Na+和SO42-的激活或抑制作用有待进一步验证，也可能二者对淀粉酶的活性无影响。
如今酶活力的测定的方法有很多，主要有化学法、光学法、量气法、酶偶联法。
比如测定酶活性的凝胶扩散法和组织印渍法[15],该法建立了改良凝胶扩散法和组织印渍法检测α-淀粉酶活性的方法,此法的实验条件容易控制,重复性好。
组织印渍法在玉米种子吸水约5h后即可检测到α-淀粉酶活性;再如2-氯-4-硝基苯-α-半乳糖-麦芽糖苷作底物直接测定α-淀粉酶法,该法用新底物2－氯－4－硝基苯－α－半乳糖－麦芽糖苷（Gal－G2－α－CNP）直接测定α－淀粉酶，不需要辅助酶，延滞时间短（＜15s），线性范围宽（可达2200U／L），试剂稳定性好，不使用KSCN、NaN3等激活剂，不受内源性葡萄糖苷酶的干扰，与EPS法对比相关良好[16]。
这里用的是化学法，方法简单快速，不需大型仪器，几乎所有酶反应都可根据产物和底物在化学性质上的差别设计相应的检定方法等优点而被广泛使用[17]。
目前，国内外对小麦发芽过程中酶活力变化规律的研究比较多。
已有研究表明,实验的材料制备步骤也会对酶活性产生影响，以及其他外界环境也会对酶活性产生影响。
如电场处理可使酶的活性发生改变[18],并提出酶活发生变化的机制可能是电场处理导致酶的静电性质和构象发生改变[19]。
因此，对环境影响淀粉酶活性的研究还远远没有结束，应该继续对物理、化学因素影响酶活性的效果和激励做进一步的研究。
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