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膜蛋白结晶手册CN
膜蛋白结晶（用于X射线结构研究）的一般实验方案
蛋白结晶学被用来产生原子分辨率的蛋白分子结构。
这些结构可以提供关于蛋白的生物功能、代谢以及跟底物或者效应物（DNA、RNA、辅助因子或其他小分子、离子和其他蛋白质）间的相互作用的信息。
这一技术可以应用于膜蛋白。
但首先需异源表达或者从天然产物中纯化来获得膜蛋白。
必须要用温和的去垢剂从脂膜中提取出膜蛋白并且纯化到稳定均一的浓度才能结晶。
蛋白晶体通过X射线衍射产生目标蛋白原子分辨率的结构。
下文中我们介绍一种一般的实验方案用来产生衍射水平的蛋白晶体。
蛋白结晶的过程是十分易变的，获得衍射水平的晶体可能需要几周到几月的时间，有些情况下可能需要几年。
引言
概述
50年前X射线结晶学首先应用于解析肌红蛋白的结构，从那时起该技术便用来产生蛋白的原子模型向科学家提供它们的结构和功能信息。
然而，直到1985年光合反应中心结构的确定才标志着人们实现了从天然产物中提取的整合膜蛋白在原子水平的结构解析。
又过了十几年，异源表达的K离子通道KcsA3得到了结晶和结构解析。
获得膜蛋白结构的困难主要来自于如何产生结晶一般需要的毫克级纯的单分散性的膜蛋白。
此外，结晶过程中必须保证蛋白在离散折叠中和寡聚体状态下的稳定。
绝大多数情况下，我们发现纯、均一和稳定的蛋白溶液成功结晶的可能性最大。
从实验上看，一条有用的蛋白溶液标准是纯度>98%、均一度>95%和稳定度>95%，这种溶液未浓缩时可以在4℃下贮存2周，浓缩到结晶浓度后可以在4℃下贮存1周。
通常，一个有利的结晶筛选起始点是含有2mg蛋白的符合上述标准的溶液，即200ul10mg∙ml-1的蛋白溶液。
本文介绍的实验方案就是为了满足这些结晶标准。
本方案首先异源表达目标蛋白，然后进行膜分离、溶解、纯化、合适结晶条件的初步确定以及改进来增加晶体的体积和质量。
膜蛋白结晶的实验方案通常局限于特定的目标蛋白，尽管可能写得很详细，但并没有审视实验方案的演进，也没有解释表达、溶解、纯化或者结晶的条件是如何得来的。
相反，有些综述对膜蛋白结晶的过程作了出色的概览，但通常无法为结晶工作者提供实用的指导。
我们的实验方案则意在提供足够的细节来指导实验。
同时，我们想通过识别蛋白结晶道路上可能的障碍并突出克服这些障碍的优化变量让我们的实验方案能够适用于不同的蛋白体系。
应用和局限
我们的实验方案着重于大肠杆菌异源表达的膜蛋白的结晶。
然而，细菌表达系统可能不适合用来表达膜蛋白，因其不能提供生产功能蛋白所需的折叠机制、翻译后修饰或者特异的脂质环境。
其他的表达系统，尤其用来生产真核细胞膜蛋白的表达系统，尽管一般比E.coli系统更贵且更难操作，但更易于满足上述所需的条件。
Pichiapastoris酵母、Saccharomycescerevisiae酵母和Sf9昆虫细胞都已被用来生产X射线晶体结构分析用的膜蛋白。
另外，能够悬浮培养的人胚胎肾细胞（HEK293SGnTI-）具有很大的潜力来表达真核细胞膜蛋白。
不管使用何种表达系统，纯化和结晶的原则都是同样适用的。
因此，本文介绍的实验方案适用于除了E.coli以外的表达系统。
其他表达系统得到的膜片断应该分离出来并且实验方案应该开始于方框1中给出的去垢剂的筛选流程。
功能膜蛋白的表达和纯化对实验和结晶都是非常重要的。
本实验方案产生的纯化的膜蛋白可以使用电子显微镜和NMR等方法来分析结构。
此外，很多人都把纯化的膜蛋白重组入蛋白脂质体或者二维脂双层系统来进行生化和功能的研究。
这些分析结果弥补了结晶的不足并给膜蛋白在隔离系统中的研究提供了机会。
或者，膜片断本身可以用来进行结合分析。
最后，目标蛋白的寡聚体状态、体积、形状和折叠信息可以通过分析超离心法、小角X射线散射法、SEC法和CD法等生物物理学方法来获得。
实验设计
一般设计条例获得高分辨率膜蛋白晶体的途径（图1）其实是一个反复的过程。
过程中每一步得到的信息都是用来提高下一步蛋白溶液的纯度、稳定性和均一性，也为晶体生长条件的优化提供了指导。
下面介绍的实验方案已被我们的结晶组成功应用并获得了几种膜蛋白的结晶。
为了让实验流程更加易懂，我们在某些部分添加了额外的标注来突出需要优化的关键变量。
某些情况下还提供了其他的实验方法。
关于这些方法详尽的讨论请参阅各种优秀的膜蛋白综述。
设计和克隆结构基因IMAC是蛋白纯化有效的初始步骤，因此克隆结构基因时一般带有可剪切的N端或C端poly-his标签。
如果蛋白带有信号序列，应避免N端标签;因其可能会干扰蛋白的定位或者在信号序列加工的过程中被剪切掉。
pETE.coli表达载体具有T7RNA聚合酶启动子并可被IPTG诱导，适用于构建表达基因。
或者使用pBADE.coli表达载体，它的诱导物是ARA，已被成功应用于产生X射线分辨率的膜蛋白。
这些质粒可以编码N端或C端可剪切凝血酶的6xhis标签。
有证据显示添加N端整合蛋白可以增加异源膜蛋白的表达量。
比如麦芽糖结合蛋白、GST、PelB前导序列和Mistic。
表达系统E.coli是结构生物学家用来异源表达蛋白质进行X射线分析的传统方法。
该方法价格低、易操作并且能够从几十升的培养基上获得毫克级的目标蛋白。
而且发表的一些结构表明E.coli不仅可以用来产生原核细胞的膜蛋白也可用来产生真核细胞的膜蛋白。
Miroux和Walker选择了一种能够过量表达膜蛋白的菌株来表达膜蛋白。
我们实验室就是主要使用该菌株来表达膜蛋白。
另外，E.coli能够生长在各种影响蛋白异源表达质量和数量的温度和培养基条件下。
比如培养温度的降低或者培养基的改变能够使表达产物从错误折叠的聚合物（包涵体）变成正确折叠并插入生物膜。
膜溶液的制备按照惯例，我们在制备蛋白溶液时会首先分离E.coli的膜片断，尽管这并不是绝对必要的，但我们强烈推荐。
理想情况下，离心后细胞已经裂解并且膜组分分离开来。
离心不仅能够富集膜蛋白，还能使膜跟某些降解目标蛋白的可溶蛋白分离。
因为目标蛋白在膜颗粒中，所以不会随可溶组分分离掉，而可溶组分则在上清中被丢弃。
溶解为了纯化和结晶，必需用去垢剂把膜蛋白从脂膜中提取出来。
大多数的表达系统都是从分离的膜组分中来提取目标蛋白。
然而，对于HEK293S细胞，膜蛋白可以用去垢剂直接从完整细胞中提取。
无论从分离的膜组分还是从完整细胞中提取，目标都是产生水溶性的蛋白-去垢剂-脂质复合物（PDLC）（图2a）。
特定蛋白最佳去垢剂的选择是一个经验性的过程。
许多不同种类的去垢剂已被用于膜蛋白的结晶，尽管其中的一些如麦芽糖苷和葡萄糖苷比另一些更常用。
大多数去垢剂都有多个长度不同的CH链，可以对PDLC的大小和稳定性进行微调。
特定去垢剂溶解膜蛋白的能力可以通过比较离心前溶解膜组分中目标蛋白的量和离心后上清中目标蛋白的量来评估。
不溶于去垢剂的物质会在离心时颗粒化，上清中的物质是去垢剂溶解的蛋白，可被用来纯化、鉴定和结晶。
因此，对离心前后的上清样品进行WB可以说明上清中保留（或溶解）了多少蛋白。
如果大多数的目标蛋白是能够溶于去垢剂的，那么离心前后WB目标条带的信号强度应该相同（图2c）。
理想的去垢剂不仅可以提取出所有的目标蛋白，而且还能维持其天然折叠构象以及形成纯化和结晶过程中保持稳定的PDC。
不完全的提取方法也是可以接受的，只要被溶解的蛋白在纯化和结晶过程中能够保持稳定。
溶解所需的去垢剂浓度部分依赖于特定去垢剂的临界微团浓度（CMC），即去垢剂单体开始自我聚集形成微团。
通常使用远高于CMC的浓度保证去垢剂有足够的量能够饱和和破坏脂双层并形成脂质-去垢剂微团来提取目标膜蛋白。
去垢剂的浓度还依赖于所研究的蛋白系统。
理想的去垢剂浓度一般都是基于实验经验的。
我们在“试剂准备”部分列出了常用去垢剂的建议浓度。
没有必要在整个结晶实验过程中使用同一种去垢剂。
用于溶解的去垢剂不一定就是用于纯化和结晶的去垢剂。
可用长链去垢剂提取目标蛋白，而在亲和纯化的第一步时可以换用短链的去垢剂。
因为长链的有助于提取到更多的蛋白，而短链的则有助于形成更加紧密的PDC进而促进结晶。
此外，能够形成多种去垢剂和/或脂质组成的微团也可能是有利的。
有的蛋白甚至存在于这种微团中。
更多深入的关于去垢剂的讨论请参考其他文献。
固定化金属亲和层析IMAC是用于初始纯化步骤中的一种有效、相对便宜的方法。
在获得膜蛋白晶体的过程中，难免要多次用到IMAC。
第一步纯化后应轻微调整一下咪唑洗脱的次数以及咪唑的浓度，以提高产量和纯度。
每一组分都应使用WB来监测以保证目标蛋白结合在金属亲和树脂上并且没有被永久洗脱掉。
目标膜蛋白的初始纯化过程中，IMAC纯化到的蛋白虽然纯度和产量都比较低，仍应该进行剪切和分子筛。
尽管存在杂蛋白的污染或有限的蛋白量，仍可能从这些步骤中得到有价值的信息。
亲和标签的剪切通过蛋白水解剪切膜蛋白的亲和标签时有一些额外的注意事项。
首先，目标蛋白周围的去垢剂微团可能阻碍蛋白酶接近剪切位点。
其次，某些去垢剂的存在可能会抑制蛋白酶的活性。
对于前者，可以把标签放到蛋白的另一端或者在剪切位点和目标蛋白间加入一段连接序列。
对于后者，可以把推荐的蛋白酶量加大到5-10倍。
或者，可以向载体中引入一个不受去垢剂影响的剪切位点。
分子排阻层析蛋白经过前两个步骤后，SEC可以对其作进一步的纯化。
我们实验室结晶的膜蛋白都经过了SEC纯化（表1）。
SEC还是评价目标蛋白均一度、稳定度和纯度的强大工具。
层析的保留时间和形状提供了有关PDC寡聚体状态和分散度的信息（图3）。
理想的情况是高斯峰比较陡，保留时间对应于正确的寡聚体质量。
虽然符合这一标准的蛋白并不一定是均一的，但它仍然是一个极好的指标。
寡聚体状态可以通过比较目标蛋白-去垢剂复合物的保留时间和标准分子质量样品的保留时间来推断。
还需要注意一些实验细节，比如层析柱的标准样品都是一些可溶的蛋白质或者小分子，而膜蛋白则与去垢剂构成复合物因此可能增大了流体动力学半径，故得到的分子质量可能比预测的要高。
最后要注意的是层析柱的基质不要选择惰性的。
PDC可能会跟基质相互作用，从而改变蛋白的保留时间。
相互作用的可能是基于静电作用或者疏水作用，跟基质作用的可能是PDC的蛋白成分或者去垢剂成分。
虽然盐的存在有助于减少基质与PDC的相互作用，拥有多种不同基质组成的层析柱对于克服这些困难颇有帮助。
离子交换层析IEC基于蛋白分子在特定pH下的带电状态达到分离纯化效果。
跟SEC相似，IEC进一步纯化经过IMAC和剪切后的蛋白质。
天然三级结构或四级结构稳定的目标蛋白其平均带电状态是单一的，因此IEC理想的洗脱峰应该是单一的一个高斯峰。
IEC可被用作IMAC和SEC之后的最终纯化步骤;或者它也可以取代SEC作为纯化的第二和第三步。
如果选择了后者，仍然需要向SEC柱中注射一定量的蛋白来进一步评估蛋白的质量。
IEC也可用于浓缩蛋白样品。
大量低浓度的蛋白溶液可以载入IEC柱然后洗脱得到单一的更浓的组分。
此外，该步可以交换去垢剂，目标蛋白固定在树脂上的时候，可以用含有其他去垢剂的缓冲液来进行大量洗脱。
浓缩和透析为了获得成功结晶所需的超饱和溶液，需要浓缩蛋白溶液;这要在纯化之后进行。
浓缩后蛋白的稳定度应该用分析分析SEC法来监测。
浓缩纯的PDC溶液时最需注意的是浓缩过程中，足够大的自由去垢剂微团会跟PDC一起保留下来。
这些自由微团的积累会增加结晶试验中相分离的量，进而抑制晶体形成。
对浓缩蛋白的透析可以使缓冲液含有最少量的去垢剂以保证目标蛋白的溶解状态同时除去结晶条件多余的去垢剂。
透析并不是膜蛋白结晶绝对必要的步骤。
但是，考虑到蛋白浓缩过程中去垢剂微团积累的可能性，结晶前对蛋白进行透析来确定去垢剂的浓度还是比较有利的。
值得注意的是不同去垢剂通过透析达到平衡的速率是各不相同的。
具有极低CMC的去垢剂较具有较高CMC的去垢剂难透析。
结晶试验中的相分离纯化和结晶缓冲液中去垢剂的存在可能会给结晶带来困难。
去垢剂微团从拥有足够高沉淀剂浓度的水溶液中分离的趋势会在悬滴中形成一个富含去垢剂的分离相。
这种所谓的相分离现象会抑制晶体的形成或者导致试验结果的变异。
这种变异会阻碍对结晶条件的优化和重复。
应该努力把相分离降到最少。
有一些步骤可能会有多余的去垢剂积累在蛋白样品中。
首先在SEC这一步。
纯化缓冲液中的自由去垢剂微团会洗脱出一个单一的峰，尽管可能并不完全的均一。
如果去垢剂微团的峰跟目标PDC的峰交叠，那么蛋白样品中会富含去垢剂进而导致更严重的相分离。
很难确定有没有出现这种交叠峰，因为大多数去垢剂在蛋白的特征吸收波长处没有吸收。
浓缩蛋白时也会发生自由去垢剂的积累。
不管用何种浓缩方法（离心过滤设备或搅动超滤池），都有多种分子质量的截止值可供选用。
为了避免去垢剂微团的浓缩，应选用能够保留目标蛋白最大的截止值。
离心过滤过程中经常用移液枪轻轻吹打溶液也可以减少自由微团的积累。
稀疏矩阵筛选（SMC）如果有关目标蛋白或其相近蛋白的信息不足，可以采用悬滴蒸汽扩散技术，96孔板，每孔200-300nl。
初筛的目标是为了找到一种合适的缓冲液条件以使PDC产生晶体。
SMC是基于之前成功结晶的各种条件来筛选的。
使用机器来分配微量悬滴可以省去很多人力劳动并且对蛋白量的需求也有所降低。
除SMC外，其他更加系统的关于pH、沉淀剂类型和浓度的筛选方法也可能用到。
我们用到了许多商用的筛选方法：
MemStart,MemSys,MemGold,CP-Custom-IVandtheClassics,PEGs,PEGsII,MbClassandMbClassIISuites.MemStartandMemSys各包含48种条件，可以合并为一个96种条件的筛选方法。
MemStart是一种SMC，而MemSys是一种系统研究pH、盐浓度/类型、沉淀剂浓度/类型的方法。
MemGold是一种96孔筛选法，它基于之前成功结晶X射线分辨率α螺旋的膜蛋白的各种条件。
除Classics外的筛选方法都非常偏好PEG沉淀剂，PEG是目前膜蛋白结晶中最成功的沉淀剂。
关于pH、盐和沉淀剂对结晶的影响的文献几乎随处可见。
格栅筛选（GS）尽管可以从几百纳升的悬滴中得到X射线分辨率的晶体，但我们发现多数情况下还是有必要把初始点晶成功点换成微升级的悬滴。
为了重复SMC得到的成功点，有必要进行广泛格栅筛选，以优化pH、沉淀剂浓度和盐浓度。
这是因为悬滴的大小会影响混合、蒸发扩散和结晶的动力学常数。
初始点晶成功点再现后，应该缩小pH、沉淀剂浓度和盐浓度的梯度来进行GS（图4b）。
设计筛选的广度是为了检验初始成功点周围的各个点，增加微升级成功点的再现率。
图4意在说明GS这一概念。
实际的优化梯度和广度可由结晶人员酌情定之。
该步的目的是改进点晶液的条件（状态），尽量降低成核作用并增加晶体的体积和质量。
广泛GS得到的信息应用来指导筛选的重点变量。
对降低成核作用并增加晶体的体积和质量有较大影响的变量应试验不同的值来筛选;而影响较小的变量应该作为常量或者从点晶液中除去。
向点晶液中引入跟蛋白缓冲液浓度相近的去垢剂或甘油有助于悬滴中蛋白的稳定和点晶液条件的改进，虽然这并不总是必要的。
比如，点晶液中若含有40mM的OG及由OG提取的同样浓度的PDC将利于减少悬滴的非晶形沉降。
添加剂当单独使用GS无法产生X射线分辨率的晶体时，添加剂筛选法可助于提高衍射极限。
为了保留样品，我们一般在纳升水平上进行添加剂筛选法，使用机器分配溶液。
以下来自HamptonResearch的筛选法都是96孔的：
theAdditiveScreen,DetergentScreenandSilverBulletsscreen。
某些情况下向点晶液中加入特定脂质能够提高衍射极限。
一旦发现了合适的添加剂，要用微升水平上的GS来优化点晶液的条件。
选择一种冷冻保护剂如果要在冷冻条件下收集数据，选择一种合适的冷冻保护剂是必要的。
某些情况下，悬滴本身可能含有足够浓度的沉淀剂（如PEG400）或添加剂（如甘油），这些物质就可作为冷冻保护剂。
其他情况下有关冷冻保护剂的选择和评估具体请参阅别的文献。
提高晶体品质要获得X射线水平的晶体可能需结过多步的优化。
除了本实验方案和图6中介绍的步骤外，我们经常对晶体进行处理来提高衍射分辨率。
还可以通过有限酶解、用抗体共结晶、截短目标基因或者使用物种同源蛋白来提高晶体质量和分辨率。
只有当本文介绍的实验方案无效时我们才会使用这些方法。
值得注意的是，除了悬滴蒸汽扩散法外还有很多结晶技术可以用来筛选或者优化结晶条件。
脂质立方相法、坐滴蒸汽扩散法和油性条件下结晶法（如微批量结晶法）都已成功获得了用于结构解析的膜蛋白晶体。
毛细管反向扩散法和微液体芯片法也得到了关注。
材料
试剂
仪器设备
试剂配制
仪器设置
实验流程
用E.coli表达目标蛋白用时2-3天
1|用包含目标基因的载体转化E.coliOverExpressC43（DE3）（电穿孔或热击）。
向LB琼脂板中加入合适抗生素，涂板转化细胞。
37℃过夜。
2|挑取单一菌落接入适当体积的LB摇瓶中。
置于培养箱或摇床中过夜，37℃，225rpm。
3|将前一步10-30ml的LB接入一升的LB中，并加入合适的抗生素。
4|置于摇床上培养，37℃，175-225rpm，直到600nm的OD值达到0.4-0.6.
5|加入最终浓度为1mM的IPTG诱导目标蛋白的表达。
继续培养3-5小时。
6|把菌液吸入离心管，离心收集菌体，4℃，5000g，15min。
7|弃上清，用洗涤缓冲液重悬沉淀，每升菌液得到的沉淀用50ml的缓冲液。
8|离心收集菌体，4℃，5000g，15min。
离心前称取离心管的重量。
9|弃上清。
记录沉淀的重量。
备注该步得到的菌体可以冷冻储存在-80℃，但我们建议继续下一步。
因为冻存可能会降低蛋白品质，并且不同蛋白的冻存条件也是基于实验经验的。
膜溶液的制备用时4小时
10|如果菌体不是冻存的，继续下一步。
如果是，则要在冰上熔化。
关键步骤该部分所有步骤都应在冰上或4℃的环境下进行，所有缓冲液应维持在4℃。
11|重悬熔化的菌体，每克菌体用5ml细胞裂解缓冲液。
4℃下用磁力搅拌棒重悬均匀。
12|重悬液通过EmulsiFlex-C5orC3microfluidizer3-5次，压力为10000-15000psi。
设备应置于4℃水浴箱中，循环冷却。
取10ul裂解液储存在4℃，以用于SDS-PAGE分析。
13|离心，4℃，15000g，30min，沉淀未裂解的细胞和细胞残骸。
14|把上清移入干净、冰上预冷的超离管中，注意不要搅动沉淀。
取10ul上清4℃储存以作SDS-PAGE。
15|为了沉淀膜组分，离心上步得到的上清，4℃，200000g，2h，去上清。
离心前称管重，离心后除去上清记录沉淀的重量。
16|每克膜组分沉淀加入1ml膜重悬缓冲液。
使用画笔有助于膜组分的重悬。
磁力搅拌有助于使悬浮液均匀。
如何选用适当的去垢剂溶解膜蛋白请参考方框1。
备注重悬的膜组分可以储存在-80℃，也可马上进行溶解。
溶解用时4-24h
17|冰上熔化冻存的膜沉淀。
关键步骤该部分所有步骤都应在冰上或4℃的环境下进行，所有缓冲液应维持在4℃。
18|用方框1中确定的溶解缓冲液重悬膜沉淀至适当浓度。
使用画笔有助于膜组分的重悬。
磁力搅拌有助于使悬浮液均匀。
19|转移溶解液到一个干净预冷的烧杯中，置于冷冻室中4℃下磁力搅拌12-18h。
取10ul用于SDS-PAGE。
溶解需要的时间可能远比给出的少，如果使用适当的去垢剂溶解时间可减少到1小时。
20|转移溶解液到一个干净预冷的超离管中，离心沉淀未被溶解的物质，4℃，200000g，2h。
21|小心把上清移入干净预冷的50ml的Falcon管中，取10ul上清存于4℃以作SDS-PAGE。
镍柱亲和纯化用时3-4h
22|按厂商说明准备适当量的Ni-NTA琼脂糖树脂。
该部分所有步骤都应在4℃下进行，所有缓冲液4℃预冷。
在280nm处监测洗脱剂。
23|把第20步得到的上清载入平衡好的Ni柱上。
收集并保存流出液。
取10ul4℃保存以用于SDS-PAGE。
流出液应该不会含有目标蛋白，但应使用Coomassie胶和WB确认。
24|使用无镍缓冲液洗涤Ni柱直到280nm处的信号回到基线附近。
25|用10mM咪唑洗涤Ni柱直到280nm处的信号回到基线附近。
取10ul洗脱液4℃储存以作SDS-PAGE。
26|选做：
使用无镍缓冲液洗涤Ni柱直到280nm处的信号回到基线附近。
27|用25mM咪唑洗涤Ni柱直到280nm处的信号回到基线附近。
取10ul洗脱液4℃储存以作SDS-PAGE。
28|选做：
使用无镍缓冲液洗涤Ni柱直到280nm处的信号回到基线附近。
29|用40mM咪唑洗涤Ni柱直到280nm处的信号回到基线附近。
取10ul洗脱液4℃储存以作SDS-PAGE。
30|选做：
使用无镍缓冲液洗涤Ni柱直到280nm处的信号回到基线附近。
31|降低洗涤速率以尽量减少目标蛋白的洗出。
32|用300mM咪唑洗涤Ni柱，收集色谱图峰值处对应的流出液。
取10ul洗脱液4℃储存以作SDS-PAGE。
咪唑的去除用时30min
33|按厂商说明平衡Econo-Pac10DG一次性色谱柱。
该步比较耗时，可以在亲和层析时开始。
34|向Econo-Pac10DG柱中加入3ml第32步得到的洗脱液。
35|用4ml分子筛缓冲液洗脱蛋白。
取10ul洗脱液4℃储存以作SDS-PAGE。
36|作吸收光谱，用280nm处的吸收值确定蛋白产量。
亲和标签的剪切用时12-20h
37|向每mg蛋白中加入4个单位的凝血酶。
38|4℃水浴12-18小时或过夜。
剪接可能不需过夜，最少时间可通过跑胶确定。
39|水浴结束时，取10ul样品4℃储存以作SDS-PAGE。
40|按厂商说明平衡适量的benzamidinesepharose6Bresin
41|将剪切后的溶液通过benzamidinesepharose6Bresin以去除蛋白酶。
取10ul样品4℃储存以作SDS-PAGE。
42|跑两块平行胶，SDS-PAGE4-20%（wt/vol）Tris-Glycine。
加入第12、14、19、21、23、25、27、29、32、35、39和41步收集的样品。
一块用于Coomassie染色，一块用于WB。
分子排阻层析用时2-8h
43|按厂商说明平衡胶柱。
44|离心稀释的样品（~250mg∙ml-1），4℃，>10000g，10min。
取上清。
关键步骤离心不充分的样品可能会残留聚集或沉淀的蛋白，注入色谱柱后导致堵塞，增大反压。
45|向凝胶过滤柱中注入大约150-200ug的稀释样品，监测280nm处的OD值，收集洗脱液，每管0.5-1ml。
46|跑胶确定哪个峰包含目标蛋白。
47|注入剩下的样品并监测，收集。
可能需要分多次注射。
每次注入尽可能大量的样品，同时保证目标蛋白峰不跟杂蛋白峰交叠。
48|把包含目标蛋白的洗脱液合并在一起，其中的大部分将进行第49步来结晶。
一部分将按方框2来鉴定。
结晶样品的制备用时1d
49|将第48步得到的样品浓缩至10mg∙ml-1，可以使用eitheranAmicontangential-flowspinfilteroranAmiconstirredcellconcentrator。
关键步骤对于旋转过滤，浓缩过程中应多次轻轻吹打样品以减少自由去垢剂微团的积累。
50|留出200ul蛋白样品用SEC鉴定（方框2）。
51|将余下的样品移入合适透析装置中，将透析袋放入含有1LSE缓冲液的烧杯中，磁力轻轻搅拌，4℃，24h。
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