《不同条件下碳氧血红蛋白浓度HbCO与死亡原因的研究》工作总结报告.docx

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《不同条件下碳氧血红蛋白浓度HbCO与死亡原因的研究》工作总结报告

《不同条件下碳氧血红蛋白浓度（HbCO）与死亡原因的研究》

工作总结报告

一、课题来源

“不同条件下碳氧血红蛋白浓度（HbCO）与死亡原因的研究”是2013年北京市公安局司法鉴定中心（公安部法庭毒物分析重点实验室）申报的公安部重点研究计划项目。

在申报后按照公安部要求召开了此项目的专家论证会，专家们对课题的研究方案及可行性分析达成了一致意见，同意该课题的立项申报，并给予了40万元的科研经费支持。

二、课题研究的目的和意义

一氧化碳是含碳物质不完全燃烧产生的一种无色、无臭、无刺激性有毒气体，易扩散，易溶于氨水。

一氧化碳在空气中含量极微，若环境中一氧化碳浓度超过0.05%即可引起人、畜中毒。

一氧化碳中毒以意外事故多见，常见原因有日常生活中毒，采矿、冶金、化学工业产生一氧化碳引起中毒等。

近些年，随着互联网的兴起，信息资源获取的便捷化，使用一氧化碳自杀或他杀的案例也时有发生。

一氧化碳经呼吸道侵入体内，透过肺泡气-血屏障弥散入血。

进入血液的一氧化碳约90%与血红蛋白中的二价铁结合，生成碳氧血红蛋白（HbCO），使血红蛋白失去携氧能力；约10%与肌红蛋白、细胞色素等含铁蛋白结合；以物理状态溶于血中的不到1%。

一氧化碳的毒理作用表现为竞争性地替代氧合血红蛋白，同时阻碍氧合血红蛋白中氧的解离和组织内二氧化碳的输出，最终导致组织缺氧和二氧化碳潴留，产生中毒症状，因此，长期以来HbCO作为判断一氧化碳中毒的主要指标。

HbCO含量越高，机体缺氧越明显，中毒症状越严重；另外，最近有研究发现，一氧化碳可以与氧竞争细胞色素氧化酶造成细胞内窒息，该途径可能为一氧化碳中毒的另一重要机制。

一氧化碳中毒死亡是法医学实践中十分常见的死亡之一，以我国北方冬季最为常见。

国外统计资料表明，在中毒的自杀、他杀及意外死亡的案件中，一氧化碳作为单项毒物居多,甚至占据首位。

怀疑一氧化碳中毒死亡案件的现场勘验、尸体检验以及心血HbCO浓度的检测对于认定死因十分重要，其中尤以心血HbCO浓度至关重要。

传统认为，一氧化碳中毒死者典型的尸体表现为尸斑呈樱桃红色，皮肤黏膜及浆膜可见斑点状出血，脑、心、肺、肾等器官内血管扩张淤血，血管壁通透性增加，有较多浆液渗出，组织水肿、伴广泛灶性出血，实质细胞发生变性等；一氧化碳中毒死者心血中HbCO饱和度应达到50%以上，多为60%-80%，重症冠心病、严重慢性肺疾患或脑动脉硬化者对一氧化碳耐受力低，甚至HbCO饱和度在20%左右时也可引起中毒症状，甚至死亡；同时，在现场发现一氧化碳来源，才可认定为一氧化碳中毒死亡。

然而，在法医学实践中时有遇到特征性尸体中毒征象不明显，血液中HbCO饱和度远低于致死饱和度，甚至在20%以下，这些案件给一氧化碳中毒死亡的判定带来一定困难。

对于非典型性一氧化碳中毒死亡案件（HbCO浓度低）国内外均无深入研究，一线法医除了结合现场“不同条件”（如温度、密闭空间、腐败程度等参数）进行推断外，仅能凭借“个案”和经验，得出一氧化碳中毒死亡的判定；而这些参数并没有系统、可靠的动物实验数据支持，推断依据往往是缺乏客观性的证据，存在隐患。

因此，本课题建立了不同浓度下一氧化碳中毒死亡动物模型，观察一氧化碳中毒后动物行为学特征，研究不同浓度下一氧化碳中毒死亡心血HbCO饱和度的变化规律，观察动物中毒死亡后心血在开放保存、闭合保存及尸体暴露等情况下随着存放时间时间延长，HbCO饱和度的变化规律。

为今后法医实战工作中遇到的一氧化碳中毒死亡案件，特别是非典型一氧化碳中毒案件提供科学依据，提高办案效能。

三、课题研究的主要内容

本课题的主要研究内容是基于一线法医工作者对非典型性一氧化碳中毒死亡案件判定缺乏系统、可靠的动物实验数据支持，缺乏证据的客观性，存在隐患；同时，人类HbCO测定值数据来源不同、版本不同、偏差较大等现状，通过研究不同CO浓度下中毒存活时间、HbCO浓度的变化规律，建立实验动物数据库。

为进一步探索人不同一氧化碳浓度中毒后HbCO浓度的变化规律提供了研究基础，也为法医学实践中一氧化碳中毒死亡案件，尤其非典型性一氧化碳中毒死亡案件提供了科学依据。

1.建立不同条件下HbCO浓度随时间等参数的变化实验动物数据库。

2.研究动物一氧化碳中毒死亡后心血HbCO饱和度随存放方式、存放时间不同的变化规律。

3.通过回顾性研究和科研期间实际命案跟踪实验，提出参照性的模拟人类数据库，由此奠定该数据库基础，并通过实战不断完善和充实该数据库，最终应用于公安侦查实战。

四、课题研究过程

1.染毒装置的制备

染毒装制为长100cm、宽80cm、高60cm密闭透明塑料染毒箱。

染毒箱内放置气压计，检测气压，使其维持在大气压水平。

染毒过程中使用一氧化碳及氧气浓度快速检测管检测箱内一氧化碳与氧气浓度，使用时可根据浓度检测结果通过导管间断通入一氧化碳和氧气，使得一氧化碳浓度保持相对恒定，氧气含量保持在20%-21%。

箱内中间有放置分隔网，其上放置大鼠，箱底预先放置碱石灰，用以吸收实验过程中大鼠呼出的二氧化碳，防止装置内二氧化碳过高，引起窒息。

2.建立不同CO浓度下SD大鼠中毒死亡的模型

2.1.实验动物及分组

清洁级健康成年SD大鼠160只，雌雄各半，体重300±50g，由重庆医科大学实验动物中心提供。

随机分为4组，每组40只，雌雄各半，分笼喂养，自由饮水，按CO浓度的分为A组（1000ppm，0.09%）、B组（3000ppm，0.26%）、C组（5000ppm，0.43%）及D组（持续通入CO）。

具体各组的实验方法如下:

A组：

注入99.8%C0气体432ml，大鼠在箱内静式吸入含CO空气，其间用CO快速检测管测定箱内CO浓度,根据检测结果间断补充CO和氧气，使CO浓度维持恒定。

B组：

注入99.8%C0气体1296ml，大鼠在箱内静式吸入含CO空气，其间用CO快速检测管测定箱内CO浓度，根据检测结果间断补充CO和氧气，使CO浓度维持恒定。

C组：

注入99.8%C0气体2160ml，大鼠在箱内静式吸入含CO空气，其间用CO快速检测管测定箱内CO浓度,根据检测结果间断补充CO和氧气，使CO浓度维持恒定。

D组：

持续注入99.8%C0气体至SD大鼠死亡。

2.2.标本的收集及处理

用组织剪打开胸腔，直视下用无菌注射器抽取右心室心血5ml左右（分为立即检测组，密封保存1d组，密封保存3d组，开口保存1d组，开口保存3d组；每管约1ml），置于肝素钠真空抗凝管。

取出脑、心脏、肺脏、肾脏、脾脏等组织后置于10%中性福尔马林溶液中固定1周后，石蜡包埋，制成5.0μm厚的切片进行病理组织学观察。

2.3.分光光度法检测各组心血COHb饱和度

参照司法部颁布的《血液中碳氧血红蛋白饱和度的测定分光光度法》（SF/ZJD0107010-2011）标准文件测定心血中碳氧血红蛋白饱和度。

2.4.统计学处理

所得数据均采用SPSS21.0统计软件进行统计学处理。

计量资料用均数±标准差（

±s）表示，组间差异采用单因素方差分析，组间多重比较采用Tukey法，p≤0.05为差异有统计学意义。

2.5.结果

2.5.1.SD大鼠行为学观察

染毒开始，A组、B组及C组大鼠表现活跃、好动，出现聚集现象，继而出现烦躁，逐渐分散，而后出现安静、四肢无力（以双后肢为甚），站立不稳，反应迟钝，声音刺激后可缓慢爬行，个别大鼠出现短时不同程度的抽搐，呼吸变浅变快，继而出现张口呼吸，呼吸变深变慢，最后大部分大鼠在出现较长时间抽搐后死亡，个别大鼠死亡时较安静；D组大鼠染毒开始后迅速出现四肢无力（以双后肢为甚），站立不稳，反应迟钝，而后出现短时间呼吸浅快，并立即出现长时间全身抽搐，尾巴竖起，角弓反张等，最后死亡。

2.5.2.不同CO浓度条件下SD大鼠CO中毒的存活时间

随着CO浓度的增加，SD大鼠CO中毒的存活时间D组（存活时间为3.1±0.9min）较C组、B组、A组（7.4±2.4min，33.8±8.2min，90.0±32.9min）降低（图1）。

经统计学分析，D组存活时间与C组、B组、A组比较有显著性差异

（F=220.3；P=0.000，P=0.000，P=0.000），C组与B组、A组比较有显著性差异（F=220.3；P=0.000，P=0.000），B组与、A组比较有显著性差异（F=220.3；P=0.000）。

A.CO浓度为0.09%组；B.CO浓度为0.26%组；C.CO浓度为0.43%组；D.持续通入CO组

图1CO浓度的增加对SD大鼠存活时间的影响

2.5.3分光光度法检测不同CO浓度条件下SD大鼠CO中毒死亡心血HbCO饱和度

分光光度法检测各组SD大鼠CO中毒死亡心血HbCO饱和度，结果显示随着CO浓度的增加，D组HbCO饱和度（HbCO饱和度为83.7±3.8%）较C组、B组、A组（77.2±2.2%，64.9±6.0%，61.9±11.4%）增高（图2）。

经统计学分析，D组心血HbCO饱和度与C组、B组、A组比较有显著性差异（F=80.834；P=0.000，P=0.000，P=0.000），C组心血COHb饱和度与B组、A组比较有显著性差异（F=80.834；P=0.000，P=0.000）。

A组大鼠心血HbCO饱和度为61.9±11.4%（图3），其中3个雌性大鼠心血COHb浓度明显低于其它大鼠心血HbCO饱和度，饱和度分别为：

26.3%，29.1%，30.4%（箭头所示）；其余各组大鼠心血COHb饱和度均高于50%。

A.CO浓度为0.09%组；B.CO浓度为0.26%组；C.CO浓度为0.43%组；D.持续通入致死组

图2CO浓度的增加对心血HbCO饱和度的影响

A.CO浓度为0.09%组

图3A组SD大鼠心血HbCO饱和度（%）

2.6.不同CO浓度下SD大鼠中毒死亡的分析

研究发现，CO中毒后SD大鼠迅速失去行为能力，尤以肌肉发达的双下肢为甚，表现为四肢瘫软、反应迟钝，不仅一定程度上解释了实际案件中死者中毒后无法主动脱离现场的现象，而且提示CO中毒对四肢（尤其双下肢）骨骼肌存在严重的损害作用。

本试验结果显示，随着CO浓度的升高，SD大鼠存活的时间逐渐下降，若无法脱离CO来源，其可在1-3min内丧失行为能力，3-5min内死亡。

本研究发现，随着CO浓度的升高，SD大鼠心血HbCO饱和度逐渐升高，且低浓度（0.09%）CO条件下心血HbCO饱和度与高浓度（0.43%，持续通入）有显著差异。

本试验结果显示，在低浓度（0.09%）CO条件下有3例中毒死亡心血样本HbCO饱和度显著低于致死饱和度，而在高浓度（0.26%，0.43%，持续通入）CO条件下未发现心血HbCO饱和度低于致死饱和度的现象，这不仅提示在CO浓度较低，接触时间较长的情况下，可出现死者心血HbCO饱和度较低的现象，也印证了在个别案例报道中发现死者血液中HbCO检验结果显著低于致死浓度，而现场勘验及尸体检验支持CO中毒死亡的情况。

3.不同CO浓度中毒死亡后心血HbCO饱和度随存放方式、存放时间的变化规律

3.1.不同CO浓度中毒死亡后心血密封保存HbCO饱和度随存放时间的变化规律

分光光度法检测各组SD大鼠CO中毒死亡心血密封保存时HbCO饱和度的变化规律，结果显示随着时间的延长，A组密封保存3d组（HbCO饱和度为61.1±11.7%）较密封保存1d组（61.3±11.2%）、即刻检测组（61.9±11.4%）无明显变化（图4）；B组密封保存3d组（65.2±6.7%）较密封保存1d组（64.7±6.2%）、即刻检测组（64.9±6.0%）无明显变化（图5）；C组密封保存3d组（76.8±6.0%）较密封保存1d组（77.5±5.2%）、即刻检测组（77.2±2.2%）无明显变化（图6）；D组密封保存3d组（84.0±4.4%）较密封保存1d组（84.2±5.4%）、即刻检测组（83.7±3.8%）无明显变化（图7）。

经统计学分析，各组心血密封保存时COHb饱和度随着时间的延长，均无显著性差异。

图4A组SD大鼠心血密封保存HbCO饱和度（%）随时间变化规律

图5B组SD大鼠心血密封保存HbCO饱和度（%）随时间变化规律

图6C组SD大鼠心血密封保存HbCO饱和度（%）随时间变化规律

图7D组SD大鼠心血密封保存HbCO饱和度（%）随时间变化规律

3.2.不同CO浓度中毒死亡后心血开口保存HbCO饱和度随存放时间变化规律

分光光度法检测各组SD大鼠CO中毒死亡心血开口保存时HbCO饱和度的变化规律，结果显示随着时间的延长，A组中开口保存3d组（HbCO饱和度为53.7±11.5%）较开口保存1d组（60.6±12.0%）、即刻检测组（61.9±11.4%）明显下降（图8）；B组中开口保存3d组（52.6±7.8%）较密封保存1d组（63.2±6.2%）、即刻检测组（64.9±6.0%）明显下降（图9）；C组中开口保存3d组（66.8±7.2%）较密封保存1d组（74.5±4.2%）、即刻检测组（77.2±2.2%）明显下降（图10）；D组开口保存3d组（72.9±4.3%）较密封保存1d组（81.1±5.1%）、即刻检测组（83.7±3.8%）明显下降（图11）。

经统计学分析，A组中开口保存3d组与开口保存1d组、即刻检测组比较有显著性差异（F=5.7；P=0.026，P=0.006）；开口保存1d组、即刻检测组比较无明显统计学差异。

B组中开口保存3d组与开口保存1d组、即刻检测组比较有显著性差异（F=38.9；P=0.000，P=0.000）；开口保存1d组、即刻检测组比较无明显统计学差异。

C组中开口保存3d组与开口保存1d组、即刻检测组比较有显著性差异（F=37.1；P=0.000，P=0.000）；开口保存1d组、即刻检测组比较无明显统计学差异。

D组中开口保存3d组与开口保存1d组、即刻检测组比较有显著性差异（F=63.8；P=0.000，P=0.000）；开口保存1d组与即刻检测组比较有显著性差异（F=63.8；P=0.032）。

图8A组SD大鼠心血开口保存HbCO饱和度（%）随时间变化规律

图9B组SD大鼠心血开口保存HbCO饱和度（%）随时间变化规律

图10C组SD大鼠心血开口保存HbCO饱和度（%）随时间变化规律

图11D组SD大鼠心血开口保存HbCO饱和度（%）随时间变化规律

3.3.心血HbCO饱和度随存放方式、存放时间变化规律结果的分析

研究发现，不同CO浓度SD大鼠中毒死亡后心血密封保存时在相对一段时间（3天以内）HbCO饱和度无明显变化，开口保存时HbCO饱和度在3天时存在显著降低，不仅提示对怀疑CO中毒死亡的案件心血等检材应密封保存、尽早检测，同时也提示在相对一定时间内（3天以内）对密封保存心血HbCO的检测可作为判断是否存在CO中毒的客观证据。

4.SD大鼠CO中毒死亡后尸体暴露室外，心血HbCO饱和度随时间变化规律的研究

4.1.实验动物

清洁级健康成年SD大鼠40只，雌雄各半，体重300±50g，分笼喂养，自由饮水。

按照上述方法，建立CO浓度为0.26%（3000ppm）的SD大鼠CO中毒死亡模型。

4.2.标本的收集及分组

用组织剪打开胸腔，直视下用无菌注射器抽取右心室心血1ml左右置于肝素钠真空抗凝管，为即刻检测组；然后缝合胸腔，使尸体暴露于室外，分别于1d、3d后再次右心室心血各1ml，分别置于肝素钠真空抗凝管，为暴露1d组及暴露3d组。

4.3.分光光度法检测各组心血HbCO饱和度

参照司法部颁布的《血液中碳氧血红蛋白饱和度的测定分光光度法》（SF/ZJD0107010-2011）标准文件测定心血中碳氧血红蛋白饱和度。

4.4.统计学处理

所得数据均采用SPSS21.0统计软件进行统计学处理。

计量资料用均数±标准差（

±s）表示，组间差异采用单因素方差分析，组间多重比较采用Tukey法，p≤0.05为差异有统计学意义。

4.5.结果

分光光度法检测SD大鼠CO中毒死亡后，随尸体暴露时间心血HbCO饱和度的变化规律，结果显示随着时间的延长，暴露3d组（HbCO饱和度为52.8±7.2%）较暴露1d组（62.6±5.3%）、即刻检测组（65.5±4.8%）明显下降（图12）。

经统计学分析，暴露3d组与暴露1d组、即刻检测组比较有显著性差异（F=50.9；P=0.000，P=0.000）；暴露1d组与即刻检测组比较无明显统计学差异。

图12SD大鼠心血HbCO饱和度（%）随暴露时间变化规律

4.6.CO中毒死亡后尸体暴露室外，心血HbCO饱和度随时间变化结果的分析

研究发现，SD大鼠CO中毒死亡后，若尸体暴露于室外，在相对较短的时间内（3d以内）其心血HbCO饱和度逐渐降低，其中1d以内心血HbCO饱和度与死后即刻检测比较无显著变化，3d后心血HbCO饱和度显著降低，不仅提示对怀疑CO中毒死亡，同时尸体暴露于室外的案件应尽早提取心血等检材，同时，对长时间（3d及以上）尸体暴露于室外的案件，尽管其心血HbCO饱和度低于致死浓度也应警惕CO中毒死亡的可能性。

5.SD大鼠自焚（爆燃）后心血HbCO饱和度的法医学研究

5.1.SD大鼠自焚（爆燃）模型的建立

将SD大鼠置于铁桶中后，取50ml汽油喷洒于SD大鼠全身；于铁桶中点燃，燃烧2-3min，观察大鼠无生命反应（呼吸、运动）后，将木板盖于铁桶上方，使其耗尽桶内氧气后，火焰熄灭后取出SD大鼠。

5.2.尸体检验及标本的收集

用组织剪打开胸腔，直视下用无菌注射器抽取右心室心血5ml左右，置于肝素钠真空抗凝管；用组织剪取出双肺及支气管，进一步检验。

5.3.标本的检测

参照司法部颁布的《血液中碳氧血红蛋白饱和度的测定分光光度法》（SF/ZJD0107010-2011）标准文件测定心血中碳氧血红蛋白饱和度。

5.4.结果

5.4.1.尸体检验发现

SD大鼠四肢屈曲，呈拳斗姿势；鼻腔内有少量碳末；全身皮肤有不同程度热烧伤。

解剖见：

声门紧闭，肺膜表面大量片状出血；气管、食道及胃内未见碳末。

5.4.2.数据统计和分析，研究自焚（爆燃）死亡后心血HbCO饱和度变化规律

分光光度法检测SD大鼠自焚（爆燃）死亡后心血HbCO饱和度，并进一步统计学分析，结果显示，SD大鼠自焚（爆燃）死亡后心血HbCO饱和度较低，未发现心血HbCO饱和度超过致死饱和度（见图26）情况。

图13SD大鼠爆燃后心血HbCO饱和度（%）数据图

5.5.结果及分析

研究发现，SD大鼠自焚死亡后心血HbCO饱和度较低，主要为30%以下，未发现超过致死饱和度的情况；这可能是由于点燃助燃剂瞬间产生的大量热气，并进入呼吸道，引起声门快速闭合，阻止空气进一步的进入；同时，也符合汽油露天充分燃烧，不会产生过多CO的自焚现场情况。

5、解决的技术问题

一线法医工作者对非典型性CO中毒死亡案件判定缺乏系统、可靠的动物实验数据支持，缺乏证据的客观性，存在隐患；同时，人类HbCO测定值数据来源不同、版本不同、偏差较大等现状；通过研究不同CO浓度下中毒死亡时间、HbCO浓度的变化规律，建立实验动物数据库。

为进一步探索人不同CO浓度中毒后HbCO浓度的变化规律提供了研究基础，也为法医学实践中CO中毒死亡案件，尤其非典型性CO中毒死亡案件提供了科学依据。

本研究拟解决的关键技术问题有：

1.建立不同条件下HbCO浓度随时间等参数的变化实验动物数据库。

2.研究动物CO中毒死亡后心血HbCO饱和度随存放方式、存放时间不同的变化规律。

3.通过回顾性研究和科研期间实际命案跟踪实验，提出参照性的模拟人类数据库，由此奠定该数据库基础，并通过实战不断完善和充实该数据库，最终应用于公安侦查实战。

六、完成的主要技术指标

研究的主要技术指标包括：

1.建立以一氧化碳浓度、时间等为参数的实验动物HbCO浓度数据库。

2.建立上述参数的模拟人类一氧化碳中毒相关数据库。

3.对死亡的实验动物进行病理组织学检验，统计分析结果。

七、取得的研究成果及达到的水平

本课题对SD大鼠不同CO浓度下存活时间、心血HbCO饱和度进行了检测；对SD大鼠CO中毒死亡后心血HbCO饱和度随存放方式、存放时间不同的变化规律等进行了研究。

建立了SD大鼠不同CO浓度下中毒死亡的发现不同CO浓度条件下SD大鼠死亡时间、HbCO饱和度存在显著差异，建立了SD大鼠不同CO浓度条件下存活时间、HbCO饱和度数据库；数据统计学分析，提出上述参数的模拟人类一氧化碳中毒相关数据库；对死亡的实验动物进行了详细病理组织学检验；首次发现了长时间接触低浓度的CO可在心血HbCO饱和度较低的情况下导致死亡的现象；发现了SD大鼠中毒死亡后心血开放保存、闭合保存及尸体暴露等情况下随着存放时间时间延长，HbCO饱和度的变化规律。

本课题同时建立了SD大鼠自焚（爆燃）模型，检测其自焚（爆燃）后心血HbCO饱和度，并作出了科学的统计分析，发现SD大鼠自焚（爆燃）死亡后心血HbCO饱和度较低，未发现超过致死饱和度的情况，提示对案情、现场复杂，同时心血HbCO饱和度较高的案件应警惕现场燃烧不完全产生CO中毒死亡的可能性，谨慎作出烧死的死因认定。

以上研究结果为对法医实战工作中遇到的一氧化碳中毒死亡案件，特别是非典型一氧化碳中毒案件具有指导意义，提高办案效能。

经文献查新，课题所获的研究成果达到国内领先，与国际研究水平相当。

目前本课题完成中文论著2篇，英文论著1篇在整理中。

八、需要说明的情况

由于经验不足，课题开始时间较晚，在对不同CO浓度中毒死亡后心血存放时间、存放方式不同心血HbCO饱和度变化规律的研究中，未进行3d以后HbCO饱和度的变化的实验。

本课题研究发现，在长时间接触低浓度（0.09%）的CO可在心血HbCO饱和度较低的情况下导致死亡的现象，实验中发现在心血HbCO饱和度较低情况下死亡的大鼠均为雌性大鼠，因此，我们猜测CO中毒死亡时心血HbCO饱和度可能存在性别的差异，本课题组将对此进行深入研究。