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westernblot参考资料
Westernblot基础知识
一、原理
与Southern或Northern杂交方法类似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
二、分类
根据凝胶电泳的类型，WB可分为：
*还原（变性）WB：
最常用的一类，使用SDS-PAGE电泳。
主要是来检测蛋白质的特性、存在与否、蛋白质的同源性以及估计蛋白质的分子量等
*非还原（非变性）WB：
主要用来分析蛋白质的结构、保持蛋白的活性的。
一般不使用SDS、DTT等变性剂。
western显色的方法主要有以下几种：
i.放射自显影
ii.底物化学发光ECL
iii.底物荧光ECF
iv.底物DAB呈色
现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：
反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
三、主要试剂
1、29%（w/v）丙烯酰胺和1%（w/v）N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液
丙稀酰胺
29g
N，N’-亚甲叉双丙稀酰胺
1g
温热（以利于溶解双丙稀酰胺）的去离子水
至100ml终体积
储于棕色瓶，4℃避光保存。
严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。
使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。
如有沉淀，可以过滤。
2、十二烷基硫酸钠SDS溶液10%（w/v）
SDS
0.1g
去离子水
1ml
室温保存。
3、分离胶缓冲液1.5mmol/LTris-HCL（pH8.8）
Trisbase
18.15g
1mol/LHCL
48ml
SW
至100ml终体积
过滤后4℃保存。
4、浓缩胶缓冲液0.5mmol/LTris-HCL（pH6.8）
Trisbase
6.05g
SW
40ml
用约48ml1mol/LHCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。
过滤后4℃保存。
这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用Tris.CL。
5、TEMED原溶液
N，N，N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。
PH太低时，聚合反应受到抑制。
10%（w/v）过硫酸胺溶液。
提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。
去离子水配制数ml，临用前配制.
6、SDS-PAGE加样缓冲液pH6.80.5mol/LTris缓冲液8ml，
甘油
6.4ml
10%SDS
12.8ml
巯基乙醇
3.2ml
0.05%溴酚蓝
1.6ml
H2O32ml混匀备用。
按1:
1或1:
2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。
7、Tris-甘氨酸电泳缓冲液
Tris
30.3g
甘氨酸
188g
SDS
10g
SW
至1000ml
得0.25mol/LTris-1.92mol/L甘氨酸电极缓冲液。
临用前稀释10倍。
8、转移缓冲液
甘氨酸
2.9g
Tris碱
5.8g
SDS
0.37g
甲醇
200ml
SW
至总量1L
9、丽春红染液储存液
丽春红S
2g
三氯乙酸
30g
磺基水杨酸
30g
SW
至100ml
加水用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S使用液。
使用后应予以废弃。
10、脱脂奶粉5%（w/v）。
11、NaN30.02%叠氮钠（有毒，戴手套操作），溶于磷酸缓冲盐溶液（PBS）。
12、Tris缓冲盐溶液（TBS）:
20mmol/LTris/HCL（pH7.5），500mmol/LnaCl。
13、Tween20（15）鼠抗人-MMP-9（16）鼠抗人-TIMP-1。
14、过氧化物酶标记的第二抗体。
15、NBT（溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml）。
16、BCIP（溶于100%二甲基甲酰胺，50mg/ml）。
17、100mmol/LTris-HCL（pH9.5）。
18、100mmol/LNaCl。
19、50mmol/LTris-HCL（pH7.5），5mmol/LEDTA。
四、实验流程
第1步：
组织或细胞蛋白提取
蛋白提取的质量直接决定着WB结果的好坏，因此，根据标本类型和检测类型选择合适的蛋白制备方法是至关重要的！
收集106细胞，加入150μlSDS裂解液，冰上超声5次，定量。
第2步：
电泳、转膜
电泳和转膜是保证成功进行WB后续检测的前提条件。
根据不同的检测目的和待测蛋白的特性，选择合适的膜类型。
常用的转移膜类型有：
PVDF膜、硝酸纤维素膜（NC膜）和尼龙膜，其中PVDF和NC膜的使用频率最高。
在电泳和转移过程中，正确使用蛋白质分子量Marker，是检测电泳效果和确定待测靶蛋白分子量大小和正确与否的保证！
SDS-PSGE电泳：
1.准备各溶液。
小烧杯两个，5ml枪头6个，吸水纸，罐胶电泳设备。
2.准备罐胶槽。
将玻璃板擦干净，放入短架子内，薄板靠门，两玻璃板及架子的底缘须在同一平面（否则漏胶）；将湿润的垫片垫于长架子上并铺上密封膜；将短架子装在长架子上（短架子底缘须与垫片紧密接触，否则漏胶）。
3.准备配胶。
将各溶液（ddH2O，单体，Tris-HCl，SDS，TEMED，APS）依次摆好，5ml枪头插于长罐胶槽，调好取TEMED、APS的枪。
4.配分离胶。
在一小烧杯上装半杯ddH2O；另一小烧杯依次加上述各液（加TEMED、APS时要迅速），快速摇匀。
注：
胶浓度由需要检测的蛋白大小决定。
5.罐胶。
从玻璃板中间注入胶液，注胶速度均匀，不要产生气泡。
罐胶后用ddH2O压胶。
6.等待时：
将Tris-HCl换成pH6.8。
换取Tris-HCl及罐胶用的枪头。
调好各移液器。
7.30分钟后。
倒掉压胶水，用滤纸吸干残留水，注意不要触及胶面。
8.配集成胶。
参见步骤4。
9.罐胶。
参见步骤5，灌满为止，不要有气泡。
10.插梳。
梳柱下面不要有气泡。
11.等待时。
A：
配电泳缓冲液。
B：
将样本煮沸5分钟。
C：
水中冷却，短暂离心后依加样序排放好。
D：
等胶近凝时，将玻璃板装在电泳架子上，罐内槽液于槽中，检查是否密封。
E：
将上槽架子按于槽中。
12.30分钟后。
罐上槽液超过短玻璃板，拔梳（注意力道适中，不能太快）。
放置上样架子。
13.上样30μl。
枪头先伸入至快接近胶面时开始降将上样液缓缓打出，使样品液从胶面往上涨，枪头随液面上涨而上提。
可以不把最后一滴样品打出，但是每个样品都须同样处理。
14.加外槽液。
15.电泳。
转膜：
1.准备。
分别准备泡膜和转膜用的试剂和用具，在电泳槽中倒好转膜液
2.揭胶。
电泳结束后，将电泳槽移至水池中，倒掉电泳液，将内槽提起放在水池边，取出两边玻璃板。
用纯水冲干净玻璃板，小心揭开短板，去掉集成胶，小心将胶转入转膜液在中。
3.转膜。
将夹子打开，黑色在底，依次放置海绵、滤纸、胶、膜、滤纸、海绵，关好夹子（均在液面下进行，注意气泡）快速放入架子中。
在电泳槽中放冰袋。
4.电泳。
蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至硝酸纤维素膜（湿式转膜）
1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结束后，小心取出带有凝胶的玻板，用割胶刀沿下边缘小心撬开短板，按样品的多少切下合适大小的凝胶。
浸泡在转膜缓冲液中5分钟左右，以平衡离子强度。
视情况决定是否切角标记。
2）电用结束前，应泡好3M滤纸2-6张均可（普通滤纸也可）和1张硝酸纤维素滤膜。
3）戴上手套按如下顺序安装转移装置：
a.平放底部电极（阴极），放一张海绵垫片。
b.在海绵垫片上放置1-3张用转移缓冲液浸泡过的滤纸，逐张叠放，对齐，然后用一玻璃棒作滚筒以挤出所有气泡，必要时可滴加转膜液润湿。
c.取出浸在转膜液中的凝胶平放于滤纸上。
排除所有气泡。
d.把硝酸纤维素滤膜放在聚丙烯酰胺凝胶上，在硝酸纤维素滤膜与聚丙烯酰胺凝胶之间不留有气泡。
e.把最后1-3张滤纸放在硝酸纤维素滤膜上方，同样须确保不留气泡。
其实，用玻棒给点压力很容易排除气泡。
f.放上另一张或几张海绵垫片，盖上阳极板，夹紧。
保证对凝胶有一定的压力。
4）连接电源。
电转过程中，尽量给个低温环境，我放在冰水里转膜，也用内置的冰盒。
5）断开电源，拆卸转移装置，逐一掀去各层。
将凝胶转移至盛有考马斯亮蓝染液的托盘中，进行染色，可检查蛋白质转移是否完全。
要观察膜上蛋白的情况可在丽春红中染色3-10分钟，然后蒸馏水冲洗
6）切去滤膜的左下角，以标记，如有预染MARKER也可不标。
7）杂交与显色：
①封闭②一抗孵育：
分别与相应的抗体及内参照抗体孵育③漂洗：
室温下以TBST液在平缓摇动条件下漂洗3次以上，每次各10min。
④与二抗孵育：
与辣根过化物酶标记的二抗孵育⑤漂洗：
室温下以TBST液在平缓摇动条件下漂洗4次以上，每次各10min。
⑥ECL显像⑦显影定影完毕
第3步：
加入一抗孵育
一抗的选择成功与否，是整个WB实验成功的关键：
选择一抗有以下几个注意点：
1、选择适合检测标本种属的一抗（说明书有验证）
2、选择适用于WB实验方法的一抗（说明书有验证）
3、选择单克隆抗体或者经过亲和纯化的多克隆抗体
一抗的保存和使用：
1、根据说明书的要求条件进行抗体的保存；一般需要将抗体分装后放入-20度保存，绝对避免反复冻融。
2、抗体的工作液最好现配现用，在4度保存最好不要超过2周
3、由于实验室条件和检测方法等的差异，说明书推荐的稀释比例只作参考，需要在说明书推荐的浓度周边进行多个浓度梯度的实验检测，然后选择信噪比最好的抗体浓度进行实验。
1.转膜等待时准备封闭液（即Non-fatmilk5%inTBST）。
2.转膜完毕后，将膜放入封闭液中，轻摇孵育1小时。
3.孵一抗。
将封闭好的膜在转移到一抗盒子中，室温孵育两小时或4℃过夜，
4.洗涤将孵育好一抗的膜在TBST洗涤3次，每次5分钟。
5.孵二抗。
将洗好的膜放在二抗中室温孵育两小时。
6.洗涤。
将孵育好二抗的膜在TBST洗涤3次，每次5分钟。
7.ECL化学发光和曝光显影。
实验常见的问题指南
1.参考书推荐
A.对初学者看什么资料比较好？
解答：
《抗体技术实验指南》和Antibodies（alaboratorymanual，wrotebyEdHarlow，davidlane）两本书不错。
2.针对样品的常见问题
B.做线粒体膜UCP2蛋白的WesternBlot，提取线粒体后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120μg，换了个santacloz的一抗仍不行。
是什么原因？
蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗？
解答：
怀疑是样品问题，可能是：
1，样品不能反复冻融；2，样品未加蛋白酶抑制剂。
同时，建议检查WesternBlot过程，提高一抗浓度。
对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加PMSF就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。
C.细胞水平要做WesternBlot，多少细胞提的蛋白够WesternBlot？
解答：
一般地5*106就足够了。
D.同一样品能同时提RNA又提蛋白吗，这样对WesternBlot有无影响?
解答：
能，没有问题，我们做过。
E.同一蛋白样品能同时进行两种因子的WesternBlot检测吗？
解答：
当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。
F.如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么？
解答：
如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂就要温和得多，这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。
G.我的样品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什么办法可以解决？
解答：
你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用减少电流延长时间，多加5－10％甲醇。
H.想分离的蛋白是分子量260kd的，SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适？
积层胶的浓度又该用多少？
这么大分子量的蛋白容易作WesternBlot吗？
解答：
260kd的蛋白不好做，分离胶用6％，StackingGel3.5％。
I.如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量？
如果需要加大上样量使原来弱的条带能看清楚。
解答：
可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。
一般地，超载30％是不会有问题的。
如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试1.5mm的comb。
J.蛋白变性后可以存放多久？
解答：
－80℃，一两年没有问题。
最关键两条：
不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉（也是被酶水解了）。
K.我所测定的蛋白分子量是105KD，按理说分离胶应当采用7.5%，但我所查资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11％的配方，不知为何？
解答：
上述您提到的两种凝胶均可以使用，因为105ＫＤ的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内，但需注意条带位置。
L.接下来我准备采用DAB显色技术，二抗是生物素化的多克隆抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用5％的脱脂奶粉呢？
好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成，是吗？
解答：
不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替应该好一点．
M.一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？
解答：
WesternBlot一般上样30－100微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和抚育时间都有关系，也与显色时间长短有关。
开始摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了。
要拿到好的结果，如果抗体好的话比较容易，抗体不好的话就需要反复地试了，当然有的不适合WesternBlot的怎样做也不行。
所以拿到好的结果不容易。
N.做组织样品的western的时候，处理样品有什么诀窍吗？
还有，您用过大牛血清做封闭剂吗？
浓度如何？
效果是不是比BSA好一点？
解答：
必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提（超速离心）。
还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入ＰＭＳＦ和蛋白酶抑制剂cocktail），封闭剂一般5%脱脂奶粉较常用。
如果一抗为多克隆抗体，使用ＢＳＡ也是不错的选择。
O.您是否可以介绍一下大分子量蛋白200KD，在做western要注意什么呢？
解答：
做200kd蛋白的WesternBlot时要注意，分离胶最好选择>7%的；剥胶时要小心；转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）。
P.有什么方法可以提高上样量？
解答：
可以浓缩样品；增大上样体积来增大上样量。
Q.我要检测的目的蛋白是分子量大概为42kd的膜蛋白，膜蛋白提取可不可以不用到超速离心机，有没有直接用低温高速离心机就可以的提到膜蛋白的方法，42kd的蛋白分子量算不算大？
解答：
如是需要提取膜蛋白，（而不是只需要提取膜蛋白），可以用Ripabuffer提取膜蛋白和胞浆蛋白，用这个做WesternBlot就可以了。
如果是非要只提取膜蛋白就要用到超速离心机。
42kd不算大，也不算小，所以，可以按照一般的转移方法实施。
R.蛋白的上样量有没有什么具体的要求？
解答：
上样量要根据实验的要求来定，如果要求是定量和半定量的WesternBlot则上样量要均等，如果只是要定性，则没有太大的关系，尽量多上就行了，但是不要超过0.3μg/mm2。
S.一抗，二抗的比例是否重要？
解答：
比较重要，调整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特异的本底。
3.抗体
T.做细胞信号传导，要做磷酸化某因子WesternBlot，其二抗有何要求？
解答：
对二抗无要求，要看你实验条件来选择，一般推荐用HRP标记的二抗。
U.同一公司的另外抗体用这个稀释度做出来效果很好，所以没做预试，怕费时间，用什么样的稀释度比较好呢？
我用的ELL+plus试剂盒显色。
转膜过夜，一抗孵育也是过夜的，若封闭也过夜的话就要四天才看的到结果了。
解答：
不同抗体，即使是同一公司的抗体，其最佳的抗体稀释度也是不一样的，需要你实验摸索。
我觉得转膜过夜好像没有必要吧，转膜的目的也就是将蛋白转到膜上就行啦，何必浪费时间呢。
至于具体的转膜时间，还要看你的目的蛋白分子量的大小；转膜的设备，是半干式，还是湿式。
一抗当然可以过夜，如果你想所短WesternBlot时间的话，可以增高一抗的孵育温度，我们实验室一般37度，两小时就足够了；你可以参照抗体说明书。
至于一抗和二抗得稀释度，你可以一抗1：
1500；二抗1：
20000试试。
另外建议你洗膜时，多洗几次，最好是在封闭；一抗和二抗后至少是5x5min，跑一张好膜不容易，多尽点心吧，这样不会浪费你的时间，只会节省你的时间！
V.免疫组化和WesternBlot可以用同一种抗体吗？
解答：
免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。
如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。
一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。
（限于单抗）
W.WesternBlot中抗体的重复应用问题
解答：
抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2－3次。
稀释后应在2－3天内使用，4度保存，避免反复冻融。
4.滤纸、胶和膜的问题
X.NC膜\PVDF膜\尼龙膜怎样鉴别？
解答：
尼龙膜是较理想的核酸固相支持物，有多种类型；硝酸纤维素膜是目前应用最广的一种固相支持物，价格最便宜；PVDF膜介于二者之间。
就结合能力而言：
尼龙膜结合DNA和RNA能力可达480－600μg/cm2，可结合短至10bp的核酸片段；硝酸纤维素膜结合DNA和RNA能力可达80－100μg/cm2，对于200bp的核酸片段结合能力不强；PVDF膜结合DNA和RNA能力可达125－300μg/cm2。
就温度适应性而言：
尼龙膜经烘烤或紫外线照射后，核酸中的部分嘧啶碱基可与膜上的正电荷结合；硝酸纤维素膜依靠疏水性相互作用结合DNA，结合不牢固；PVDF膜结合牢固，耐高温，特别适合于蛋白印迹。
就韧性而言：
尼龙膜较强；硝酸纤维素膜较脆，易破碎；PVDF膜较强。
就重复性而言：
尼龙膜可反复用于分子杂交，杂交后，探针分子可经碱变性被洗脱下来；硝酸纤维素膜不能重复使用；PVDF膜可以重复使用。
Y.在做WesternBlot时，PVDF膜用甲醇浸泡的目的？
解答：
PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。
Z.检测磷酸化的JNK和非磷酸化的JNK可以在同一张膜上吗？
解答：
可以。
AA.转膜后经丽春红染色的条带，为什么大蛋白分子的一端（即点样空的一侧）的转膜好象不是很好，为什么？
解答：
这是正常的，大分子的蛋白转移的慢，你延长转移时间和电流，大分子一端就会好的多，但是小分子的就有可能会变淡。
BB.我想问您裂解细胞用三去污裂解法，还是用上样缓冲液？
解答：
用上样缓冲液，这样有几个好处，可以提取总蛋白，同时又可以让磷酸化酶失活。
CC.采用tanksystem有什么讲究？
解答：
建议低电压，长时间，（一般tankSystem用衡压好点），如28V14－16hrs。
DD.做HSPWESTEN定量，同样的抗体免疫组化能做出，而WESTEN却不能？
解答：
这多半是抗体的问题，要看抗体的说明，是否能做WesternBlot和IHC。
EE.膜一般要如何处理？
解答：
一般用甲醇泡泡就可以了。
FF.如果是6×8转印膜，要加多少一抗？
解答：
一抗的稀释度是有说明的，根据你的一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育体积一般最少为3－5ml。
GG.上下槽缓冲液有何要求，怎样才能达到最佳效果。
解答：
无要求。
HH.跑电泳的时候配的胶总是“缩”是什么原因呢？
是有的成分不对吗？
解答：
没什么问题，就是你胶里的水分被蒸发了。
过夜时拿保鲜膜包起来，在里面加点水保持湿度就可以了。
如果过夜，胶里的水分被蒸发，采用保鲜膜包上也可以；也可能母液（30%聚丙酰胺）有问题，你可以重新配制一份观察；能够替换的试剂，尽量换一下，选用好的试剂，避免找问题麻烦。
脱色液中甲醇的含量太高也会造成胶缩。
II.膜、滤纸、胶大小有何讲究？
解答：
如果是用的是半干转，顺序为：
阴极－》滤纸－》胶－》膜－》滤纸。
滤纸的长宽分别比胶小1－2mm，而膜的长宽分别比胶大1－2mm。
绝对禁忌：
上下两层滤纸因为过大而相互接触，这样会短路，电流不会通过胶和滤纸。
JJ.蛋白质的分子量跨度很大，如要分离小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好吗？
解答：
这么广的分布不好转移，一般建议：
21kd和66kd可以一起转，12％SDS-PAge，湿转36V，3－5hrs就可以了，可以根据你实验室的经验调节；170kd用7%SDS－page，48V10hrs－16hrs。
KK.不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上，转移效率低怎么样解决？
解答：
可以考虑：
转移缓冲液中加入20%甲醇（是指终浓度）（优化的转移缓冲液，可以参考《蛋白质技术手册》），因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使用小孔径的NC膜（0.2微米）；使用戊二醛交联；低浓度胶，如低至6％。
太大时还可以考虑用琼脂糖胶；提高转移电压／电流；增加转移时间。
LL.如何选择最合适的蛋白杂交膜？
解答：
蛋白质印迹杂交是分子生物学实验中极为常用的一门技术。
选择质量上层、合乎要求、方便适用的杂交膜是决定这项实验成败的重要环节。
根据杂交方案、被转移生物大分子的特性以及分子大小等等因素，我们要量体裁衣，从杂交膜的材质、孔径和规格上都要做出合理的选择。
硝酸纤维素膜：
硝酸纤维素膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物。
在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与硝酸纤维素膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，虽然这其中的机制还不是十分清楚，但由于硝酸纤维素膜的这个特性，而且易于封闭非特异性结合，从而得到了广泛的应用。
在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。
根据被转移的
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