流式细胞仪检测外周血树突状细胞.docx

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流式细胞仪检测外周血树突状细胞

分析CD123+（抗IL-3受体链）和CD11c+树突状细胞亚群

概述

树突状细胞（DC）的主要功能是吸收抗原，进行加工，并向T淋巴细胞呈递。

其它抗原呈递细胞也有此功能，如B淋巴细胞和单核细胞。

但是，与其它细胞不同的是，DC细胞具有诱导初发免疫反应的独特功能，例如，可以活化处女T细胞（NaiveTcell）。

DC细胞存在于外周淋巴组织中，已在血液和非淋巴器官中发现了不同类型的DC细胞，并被认为是淋巴组织中细胞的前体。

由于血液和组织中DC细胞含量少，且缺乏特异的DC标记物，所以DC细胞的研究非常困难。

因此，关于DC细胞的了解主要来自于通过密度梯度离心、培养、和/或阴性选择富集后的DC细胞的研究。

这些过程利用了DC细胞的密度和黏附特征，和在一定细胞因子条件下的选择性生长，或缺乏淋巴细胞、单核细胞和粒细胞的系列标记物的表达。

但是，这些方法中DC细胞的产率和纯度较低，且费时费力。

而且，这些操作可以影响细胞的功能，并且无法做DC细胞含量的定量分析。

最近的报告发现在活化DC细胞和血液或淋巴细胞分离培养的DC细胞表面CD83和CMRF-44高表达。

CD83和CMRF-44可以作为DC细胞的活化标志物，但在体内或未处理的细胞上没有特征性表达，或表达水平很低。

在对新鲜分离的DC细胞的研究中，发现IL-3R在淋巴器官的DC细胞上有特异表达。

从人类外周淋巴组织中分离的单个核细胞中主要是此类DC细胞。

IL-3R（CD123）抗体可以用来进行免疫磁珠分选，从外周淋巴组织制备的单个核细胞样本中，将CD123+DC细胞进行200倍富集。

CD123抗体还可以用来做免疫组化分析，特异识别滤泡外T细胞富集区的CD123+DC。

在外周血中也有CD123+DC细胞，与以前所说的CD11c-DC细胞和CD33dimCD14-CD16-DC细胞是同一类细胞。

由于缺乏DC特异性标记物，目前仍然不清楚DC是否是自成一系的一类细胞。

DC细胞既可以由成熟的外周血单核细胞生成，也可以由未分离的CD34+干祖细胞经GM-CSF和TNF-培养得到。

使用CD123抗体，发现有一群CD34+DC样幼稚细胞。

这群细胞与CD34+干祖细胞的区别是可以发育成Langerhan细胞样DC。

因此，根据CD123强染，可以识别出一类人类DC细胞，它是不同组织间DC细胞的连接桥梁。

在外周淋巴组织中还发现另一个DC亚群，与CD123+DC不同的是，其表型为CD11c+HLA-DR+LINdim/-。

与CD123+DC相反，这群DC细胞位于生发中心。

在血中也含有CD11c+HLA-DR+LINdim/-DC细胞，与CD33brightCD14dimCD16-DC细胞是同一类细胞。

由此可见，DC系统由多种细胞类型构成，发育途径不一。

但是，目前对这些细胞的功能和可能的特殊性、在生理或病理条件下如何受调控等方面仍缺乏了解。

CD123+DC和CD11c+DC细胞具有不同的表型，在淋巴器官中的位置也不同，提示它们可能有不同的功能。

近年来的研究主要集中在使用DC细胞进行抗肿瘤和抗感染治疗方面。

不同报道证实，这有可能抑制肿瘤生长。

使用这些新的DC标记物建立起来的检测系统，可以帮助对新鲜外周血新鲜中的两类不同的DC细胞进行定量检测，同时可以加以分离。

实验方法采用三色或四色流式细胞仪分析，检测速度快，样本用量少，可以用来辅助研究在病理和生理条件下，DC在免疫调控中作用。

检测原理和用具

检测原理：

本实验目的是从外周血中检测两种类型的DC细胞：

CD123+DC（Anti-IL-3R+）和CD11c+DC。

CD11c和CD123并不是DC特异的标志物。

两类细胞均HLA-DR高表达，单核细胞、淋巴细胞和NK细胞的系列标记物弱表达。

因此使用单一荧光标记的LINcocktail（LIN1）抗体将DC细胞区分出来。

LIN1抗体包括CD3、CD14、CD16、CD19、CD20和CD56。

另外，本实验还可以区分嗜碱粒细胞。

嗜碱粒细胞的表型是：

LIN1-CD123+HLA-DR-。

使用HLA-DR可以区分嗜碱粒细胞和CD123+DC细胞。

细胞来源：

样本使用EDTA、ACD或肝素钠抗凝全血，或分离的外周血单个核细胞（PBMC）。

样本采集后24小时内检测。

试剂：

1.检测DC细胞用的BDIS荧光标记的单克隆抗体。

四色分析：

LIN1FITC：

货号340546，含有CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56

CD123PE（Anti-IL-3R）：

货号340545

Anti-HLA-DRPerCP：

货号347364

CD11cAPC：

货号340544

MouseIgG1PE：

货号349043

MouseIgG2aAPC：

货号340473

三色分析：

LIN1FITC：

货号340546，含有CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56

CD123PE（Anti-IL-3R）：

货号340545

CD11cPE：

货号347637

Anti-HLA-DRPerCP：

货号347364

MouseIgG1PE：

货号349043

MouseIgG2aPE：

货号349053

2.FACSLysingSolution（10X）：

FACS溶血素，货号349202，用去离子水1：

10稀释

3.洗液：

PBS缓冲液

4.1XPBS配制的1%多聚甲醛

设备用具：

1.EDTA、ACD或肝素钠真空采血管

2.1275mmFALCON试管

3.振荡混匀器

4.FACS流式细胞仪

5.离心机

6.微量加样器

全血样本荧光抗体染色步骤：

1.按照下表在各管中加入适量抗体；

FITC

PerCP

APC

4-Color四色分析

Tube1

Tube2

LIN120uL

CD1235u（全血）

10uL（PBMC）

MouseIgG1

Anti-HLA-DR10uL

CD11c5uL

MouseIgG2a

3-Color三色分析

Tube1

Tube2

Tube3

Tube4

LIN120uL

CD1235uL（全血）

10uL（PBMC）

MouseIgG1

CD11c5uL

MouseIgG2a

Anti-HLA-DR10uL

2.每管加入100uL全血，振荡混匀，室温暗处反应15分钟；

3.加入2mLFACS溶血剂，振荡混匀，室温暗处放置10分钟；

4.300xg离心5分钟，弃上清；

5.振荡混匀，加入1mL洗液；

6.300xg离心5分钟，弃上清；

7.振荡混匀，加入300uL1%多聚甲醛；

8.2-8C暗处保存，24小时内上机分析

PBMC样本荧光抗体染色步骤：

1.按照上表在各管中加入适量抗体；

2.每管加入50uL全血，振荡混匀，暗处冰浴反应25分钟；

3.轻轻混匀，加入1mL洗液；

4.300xg离心5分钟，弃上清；

5.轻轻混匀，加入300uL1%多聚甲醛；

6.2-8C暗处保存，24小时内上机分析

数据获取：

1.使用CaliBRITE微球，做FACSComp，调整PMT电压和荧光补偿，检查仪器灵敏度；

2.上样：

使用CELLQuest软件，获取50,000个细胞，用FSC设阈值，排除碎片干扰；

3.使用CELLQuest软件分析结果

数据分析：

1.区分细胞和碎片：

使用FSC/SSC点图，画R1，排除碎片和死细胞；

2.找到LIN1弱阳性和阴性群体：

使用Anti-HLA-DR/LIN1点图（G1=R1），画R2，圈定LIN1弱阳性和阴性细胞；

3.区分外周血DC和嗜碱粒细胞：

在四色分析中，管1区分DC细胞和嗜碱粒细胞，管2是同型对照。

在三色分析中，管1和管3区分DC细胞和嗜碱粒细胞，管2和管4是同型对照。

使用同型对照区分非特异染色

在GateList中定义G3=R1ANDR2。

使用Anti-HLA-DR/CD123点图和Anti-HLA-DR/CD11c点图（G3=R1ANDR2），图中只显示LIN1弱阳性和阴性细胞。

画R3，圈定嗜碱粒细胞（Anti-HLA-DR-/CD123+）；画R4，圈定CD123+DC细胞（Anti-HLA-DR+/CD123+）；画R5，圈定CD11c+细胞（Anti-HLA-DR+/CD11c+）；

4.在GateList中定义各门：

G4（嗜碱粒细胞）=R1ANDR2ANDR3，G5（CD123+DC）=R1ANDR2ANDR4，G6（CD11c+DC）=R1ANDR2ANDR5，G7=R1ANDR2AND（R3ORR4ORR5）；

5.确认细胞群的准确性：

下图显示了四色分析全血样本时的CD123+DC、CD11c+DC和嗜碱粒细胞各群的位置。

6.分析各群细胞的百分含量：

点击Anti-HLA-DR/LIN1（G1=R1）点图，做统计，得到各群细胞所占比例

∙CD123+DC%R1ANDR2ANDR4

∙CD11c+DC%R1ANDR2ANDR5

∙嗜碱粒细胞%R1ANDR2ANDR3

在三色分析时，由两个点图分别得到统计结果。

CD11c+DC%由CD11cPE点图得到，CD123+DC%和嗜碱粒细胞%由CD123PE点图得到。

分析结果：

在外周血中，DC含量很低，因此，在流式细胞分析中，需要获取50,000个细胞。

下表总结了各细胞亚群的表型特征。

Parameter

CD123+DC

CD11c+DC

Basophils

LIN1

-/+

Anti-HLA-DR

+++

CD123

+++

CD11c

+++

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