复方甘草酸苷中有关物质的测定.docx

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复方甘草酸苷中有关物质的测定

复方甘草酸苷中有关物质的测定

【摘要】目的建立同时测定复方甘草酸苷片中3个主成分有关物质的反相高效液相色谱法，以控制其质量。

方法采用C18色谱柱，以mol·L-1醋酸钠溶液-乙腈forsimultaneousdeterminationofrelatedsubstancesofthreemajorcomponentsincompoundglycyrrhizin　C18columnwasusedwiththemobilephaseof　mol·ml-1NaACsolution-acetonitrile（59∶41）andthedetectionwavelengthwasat251nmand360nm.ResultsResolutionanddetectablesensitivityofeachconstituentinsamplessatisfiedthedetectiondemandofrelatedsubstance.TheLODofglycyrrhizin,glycine,DL-methioninewere　ng，ngand　ng,respectively.ConclusionThemethodissensitive，accurate，simpleandspecific.Itcanbeusedasareliablemethodforthequalitycontrolofcompoundglycyrrhizintablet.

Keywords：

Compoundglycyrrhizintablets;Glycyrrhizin;Glycine;DL-methionine;Relatedsubstance;RP-HPLC

复方甘草酸苷片是由甘草酸单铵盐，甘氨酸，DL-蛋氨酸组成的复方制剂，于1948年在日本上市，现主要用于治疗慢性肝病，改善肝功能异常，亦可用于治疗过敏性反应、斑秃、系统性红斑狼疮及传染性非典型肺炎等，疗效确切，已于临床应用多年［1，2］。

从传统中药材甘草中可提取得到甘草酸，再经成盐可制备得甘草酸单铵盐，长期以来被广泛应用于医药，食品和化妆品等领域，对其临床以及其它用途的安全性检验已获得FDA的认可［3］，但国家标准中规定甘草酸单铵盐的含量为%［4］，说明甘草酸单铵盐原料药的有关物质含量高。

为保证本制剂批间质量的一致性和安全性，进行有关物质考察实验。

1仪器与试药

日本岛津SCL-20AVP型高效液相色谱仪，SPD-M20二极管阵列检测器，LC-solution岛津色谱工作站；THZ-82型恒温水浴振荡器（上海常思工贸有限公司）；BP211D精密天平。

乙腈为色谱纯，2,4-二硝基氟苯，冰醋酸，无水醋酸钠，碳酸氢钠，氢氧化钠均为分析纯。

水为双蒸水。

甘草酸单铵（中国药品生物制品检定所，批号11073-200513）；甘氨酸（中国药品生物制品检定所，批号），DL-蛋氨酸（Sigma公司，批号0580123，含量＞99%）。

复方甘草酸苷片（新疆特丰药业股份有限公司，批号20070513，20070514，20070515）。

复方甘草酸苷片（商品名：

美能；日本米诺发源制药株式会社生产，批号06130）。

2方法与结果

　色谱条件［5］ShimadzuVD-ODSC18色谱柱（250mm×mm,5μm），流动相为mol·L-1醋酸钠溶液-乙腈；流速1ml·min-1；柱温35℃；检测波长λ甘草酸=251nm，λ氨基酸=360nm；进样量20μl。

以空白辅料溶液、对照品溶液和供试品溶液分别进样测定。

甘草酸单铵盐的保留时间为min，色谱见图1；甘氨酸、DL-蛋氨酸及衍生剂DNFB的保留时间分别为，和min，色谱图见图2。

理论塔板数分别以甘草酸单铵，甘氨酸，DL-蛋氨酸峰计均大于3000，各主成分与杂质峰分离度均大于。

a-空白样品b-甘草酸单铵对照品c-供试品1.甘草酸单铵盐

图1甘草酸单铵盐的HPLC图

　专属性考察

　空白溶剂实验取用流动相制成的空白溶液，照下述“有关物质检查法”进样，结果色谱图上无色谱峰。

　甘草酸单铵盐的破坏实验取甘草酸单铵对照品5mg置10ml容量瓶，50%甲醇溶解定容，分别取此溶液1ml至5ml容量瓶，然后分别加入1mol·L-1的HCl溶液，1mol·L-1的NaOH溶液和30%H2O2溶液各ml，80℃水浴加热30min，调pH至中性，50%甲醇稀释至刻度，即得甘草酸单铵盐的酸、碱、强氧化破坏样品；取甘草酸单铵盐适量，置130℃烘箱h，用50%甲醇溶解定容制得高温破坏样品。

分别取各破坏样品进行测定。

结果见图3。

　甘氨酸、DL-蛋氨酸的破坏试验分别取甘氨酸、DL-蛋氨酸对照品6mg置10ml容量瓶，蒸馏水溶解定容，作为储备液。

分别取1ml储备液至10ml容量瓶，然后分别加入1mol·L-1的HCl溶液，1mol·L-1的NaOH溶液和30%H2O2溶液各1ml，80℃水浴加热30min，调pH至中性，依条件衍生处理后［5］，即得甘氨酸、DL-蛋氨酸对照品的酸、碱、强氧化破坏样品；分别取甘氨酸、DL-蛋氨酸对照品适量，置130℃烘箱h，蒸馏水溶解后，进行衍生后，制得高温破坏样品。

分别取各破坏样品进行测定。

结果见图4。

由图可见，本色谱条件可将甘草酸单铵、甘氨酸、DL-蛋氨酸各破坏条件下的降解产物与主成分峰能够完全分离，分离符合药典要求，不影响主药的含量测定。

　线性关系

　甘草酸单铵盐线性关系实验精密称取甘草酸单铵对照品适量，以50%甲醇配制成浓度为，，，，，，506μg·ml-1的系列标准溶液，分别取20μl进样测定，以浓度对峰面积回归，得回归方程：

Y=15311X-5888，r=，线性范围～506μg·ml-1。

　甘氨酸，DL-蛋氨酸线性关系实验分别精密称取甘氨酸，DL-蛋氨酸对照品适量，分别配制成约600μg·ml-1溶液，取此液适量衍生后［5］，配成甘氨酸浓度为，，，，μg·ml-1的对照品溶液，DL-蛋氨酸浓度为，，，，，，μg·ml-1的对照品溶液，进样测定，以浓度对峰面积回归，得回归方程。

甘氨酸：

Y=132572X-4，r=8，线性范围为～μg·ml-1；DL-蛋氨酸：

Y=71699X-84781，r=7，线性范围为～μg·ml-1。

　　　灵敏度实验在“”色谱条件下，信噪比S/N=3时，甘草酸单铵盐、甘氨酸、DL-蛋氨酸的检测限分别为，，ng；而信噪比S/N=10时，甘草酸单铵盐、甘氨酸、DL-蛋氨酸的定量限分别为，，ng。

　精密度与重复性实验取甘草酸单铵盐、甘氨酸、DL-蛋氨酸对照品的高、中、低溶液各平行3份于1日内和连续5日内分别测定，日内精密度（n=5）分别为：

%，%，%；日间精密度（n=5）分别为%，%，%。

甘草酸单铵、甘氨酸、DL-蛋氨酸连续进样5次，计算峰面积的RSD值分别为%，%，%。

　回收率实验精密称取已知含量的产品，分别加入一定量的甘草酸单铵盐、甘氨酸、DL-蛋氨酸对照品，配制成高、中、低3种浓度，按对照品溶液测定项下处理，进行测定，计算平均回收率分别为：

甘草酸单铵盐为%，RSD为%；甘氨酸%，RSD为%；DL-蛋氨酸为%，RSD为%。

　PDA的测定在各专属性试验中，采用PDA检测器检测了主成分峰的纯度，纯度均大于%。

实验结果证明，本法测定甘草酸单铵盐、甘氨酸、DL-蛋氨酸有关物质专属性良好。

　有关物质测定

　甘草酸单铵盐有关物质测定精密称取复方甘草酸苷片粉末适量，加50%甲醇制成每毫升中约含甘草酸200μg的溶液，滤过，取续滤液作为供试品溶液；精密量取供试品溶液适量，用50%甲醇稀释制成每毫升中含甘草酸2μg的溶液，作为对照溶液。

取对照溶液20μl注入液相色谱仪，调整检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程10%，再精密量取供试品溶液与对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。

　甘氨酸，DL-蛋氨酸有关物质测定精密称取复方甘草酸苷片粉末适量，加水制成每毫升中约含甘氨酸，DL-蛋氨酸600μg的溶液，即得储备液。

精密量取储备液2ml置10ml容量瓶中，加入mol·L-1NaHCO32ml和2%DNFB溶液ml，置60℃水浴中暗处加热60min进行衍生化后，冷却，以KH2PO4缓冲液定容，即得每毫升中约含甘氨酸，DL-蛋氨酸60μg的供试品溶液。

精密量取供试品溶液适量，用KH2PO4缓冲液稀释制成每毫升中含甘氨酸，DL-蛋氨酸μg的溶液，作为对照溶液。

取对照溶液20μl注入液相色谱仪，调整检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程10%，再精密量取供试品溶液与对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。

　有关物质的测定结果参照2005版《中国药典》，采用主成分自身对照法。

供试品溶液色谱图上如有杂质峰，则各杂质峰面积的总和与对照溶液主成分峰的面积进行比较。

分别测定原料药，3批复方甘草酸苷片的0月和加速试验6个月样品，以及市售产品美能中3个主成分的有关物质测定结果，见表1。

表1有关物质测定结果

结果表明，3批复方甘草酸苷片的0月和加速试验6个月样品中甘氨酸，DL-蛋氨酸的有关物质含量与原料药相比，变化均小于1%，色谱图中所有杂质峰面积均小于对照溶液主峰面积，已低于定量限，因此可忽略不计。

该制剂的有关物质主要为甘草酸单铵盐原料药中带入，3批复方甘草酸苷片的0月和加速试验6个月样品中甘草酸单铵盐与原料药相比，未知物的种类和数量无明显增加，说明制剂过程中和加速试验6个月放置过程中药物间、药物与辅料间未产生明显的未知物；与市售产品美能对比，3批样品中三组分的杂质种类和数量无显着增加。

以上结果说明该制剂的质量可靠。

鉴于甘草酸单铵盐原料药纯度低，因此，应将制剂中的有关物质与原料药进行比较，参照文献［6］和本研究结果，各有关物质峰面积之和（扣除辅料峰，溶剂峰和原料药有关物质峰外）应不大于对照品溶液主峰面积的2倍。

3讨论

新药的纯度检查是保证安全有效的重要指标之一，所涉及的有关物质检查早已为国际上“人用药品注册技术规范协调会（ICH）”所关注，在国内也逐渐引起新药研发者的重视［7，8］。

甘草酸单铵盐原料药有关物质含量高，在复方甘草酸苷注射剂和甘草酸二铵产品的药学研究中就存在确定甘草酸类制剂主要杂质的结构、获取其安全性数据有相当难度等问题［9，10］。

本制剂为复方制剂，含有3个主药组分和6种辅料，因此需考察制剂过程中和有效期的放置过程中，药物间、药物与辅料间是否有相互作用，是否产生新的有关物质。

进口市售产品美能片的质量标准中对甘草酸单铵盐、甘氨酸、DL-蛋氨酸的含量测定分别采用HPLC法、薄层色谱法和反滴定法，无有关物质检查项［11］；甘草酸单铵盐的国家药品标准〔WS-10001-（HD-1269）2002〕［4］中规定含量不得少于%，无有关物质检查项；注射用复方甘草酸单铵中采用HPLC法只测定了甘草酸单铵盐的有关物质［6］，未考察复方制剂中3个主成分间是否有相互作用而产生新的杂质。

本研究建立了在同一色谱条件下测定复方甘草酸苷片中3个主成分有关物质的HPLC法，经方法学考察和酸、碱、氧化和高温破坏试验，3种主成分与辅料及降解产物能很好分离，表明该法专属性强，灵敏度高，重现性好，操作简便，适用于该制剂的有关物质分析，也可作为中药材甘草或甘草酸类制剂的有关物质测定方法，进行产品质量控制和评价，保证临床用药安全。

采用《中国药典》不加校正因子的自身对照法［12］深入进行了复方甘草酸苷片3组分的有关物质研究，根据多批样品中有关物质的实测数据，结合稳定性考察中有关物质检查结果，并与原料药，市售产品美能中的有关物质进行对比研究，为本制剂有关物质限度的确定提供了依据。

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［5］田莉，高晓黎，云琦.反相高效液相色谱法测定复方甘草甜素片三组分的含量［J］.新疆医科大学学报，2005，32：

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［9］王鹏.关于甘草酸二铵类产品药学研发工作的几点建议［J/OL］.http:

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ResName=dzkw&order=907,2005-07-12.

［10］李志万，卓宏，张敏娟.复方甘草酸苷注射剂药学研究中几个问题［J/OL］.http:

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ResName=dzkw&order=907，2007-02-05.

［11］复方甘草酸苷片质量标准［S］.

［12］国家药典委员会.中国药典，Ⅱ部［S］.北京：

化学工业出版社，2005.