HPLC原理.docx

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HPLC原理

HPLC原理及方法简介

I．概论

一、液相色谱理论发展简况

色谱法的分离原理是：

溶于流动相（mobilephase）中的各组分经过固定相时，由于与固定相（stationaryphase）发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。

又称为色层法、层析法。

色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法（Chromatography）因之得名。

后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。

液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。

高效液相色谱法（HighperformanceLiquidChromatography，HPLC）是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。

它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法（HighPressureLiquidChromatography，HPLC）。

又因分析速度快而称为高速液相色谱法（HighSpeedLiquidChromatography，HSLP）。

二、HPLC的特点和优点

HPLC有以下特点：

高压——压力可达150-300Kg/cm2。

色谱柱每米降压为75Kg/cm2以上。

高速——流速为0.1-10.0mL/min。

高效——可达5000塔板每米。

在一根柱中同时分离成份可达100种。

高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。

同时消耗样品少。

HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：

速度快——通常分析一个样品在15-30min，有些样品甚至在5min内即可完成。

分辨率高——可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。

灵敏度高——紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。

柱子可反复使用——用一根色谱柱可分离不同的化合物。

样品量少，容易回收——样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。

三、色谱法分类

按两相的物理状态可分为：

气相色谱法（GC）和液相色谱法（LC）。

气相色谱法适用于分离挥发性化合物。

GC根据固定相不同又可分为气固色谱法（GSC）和气液色谱法（GLC），其中以GLC应用最广。

液相色谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。

LC同样可分为液固色谱法（LSC）和液液色谱法（LLC）。

此外还有超临界流体色谱法（SFC），它以超临界流体（界于气体和液体之间的一种物相）为流动相（常用CO2），因其扩散系数大，能很快达到平衡，故分析时间短，特别适用于手性化合物的拆分。

按原理分为吸附色谱法（AC）、分配色谱法（DC）、离子交换色谱法（IEC）、排阻色谱法（EC，又称分子筛、凝胶过滤（GFC）、凝胶渗透色谱法（GPC）和亲和色谱法。

按操作形式可分为纸色谱法（PC）、薄层色谱法（TLC）、柱色谱法。

四、色谱分离原理

高效液相色谱法按分离机制的不同分为液-固吸附色谱法、液-液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。

1．液-固色谱法　使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。

分离过程是一个吸附-解吸附的平衡过程。

常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度5-10μm。

适用于分离分子量200-1000的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。

常用于分离同分异构体。

2．液-液色谱法　使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。

分离过程是一个分配平衡过程。

涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须预先用固定相饱和，以减少固定相从担体表面流失；温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化；另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化。

由于涂布式固定相很难避免固定液流失，现在已很少采用。

现在多采用的是化学键合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。

液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法（NPC）和反相色谱法（RPC）。

正相色谱法　采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。

常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。

反相色谱法　一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。

适用于分离非极性和极性较弱的化合物。

RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。

随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。

为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值。

但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.5-7.5（2-8），太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。

有报告新商品柱可在pH1.5-10范围操作。

3．离子交换色谱法　固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季氨基（阴离子交换树脂）。

被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。

缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。

被分离组分在离子交换柱中的保留时间除跟组分离子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外，它还受流动相的pH值和离子强度影响。

pH值可改变化合物的解离程度，进而影响其与固定相的作用。

流动相的盐浓度大，则离子强度高，不利于样品的解离，导致样品较快流出。

离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。

4．离子对色谱法　又称偶离子色谱法，是液液色谱法的分支。

它是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度增大，从而使其分离效果改善。

主要用于分析离子强度大的酸碱物质。

分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。

另外高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。

分析酸性物质常用四丁基季铵盐，如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐。

离子对色谱法常用ODS柱（即C18），流动相为甲醇-水或乙腈-水，水中加入3-10mmol/L的离子对试剂，在一定的pH值范围内进行分离。

被测组分保时间与离子对性质、浓度、流动相组成及其pH值、离子强度有关。

5．排阻色谱法　固定相是有一定孔径的多孔性填料，流动相是可以溶解样品的溶剂。

小分子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长；大分子量的化合物不能进入孔中，直接随流动相流出。

它利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离。

常用于分离高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。

II．基本概念和理论

一、基本概念和术语

1．色谱图和峰参数

色谱图（chromatogram）——样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线（elutionprofile）。

基线（baseline）——经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。

一般应平行于时间轴。

噪音（noise）——基线信号的波动。

通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。

漂移（drift）——基线随时间的缓缓变化。

主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。

色谱峰（peak）——组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。

流出曲线上的突起部分。

正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。

不对称色谱峰有两种：

前延峰（leadingpeak）和拖尾峰（tailingpeak）。

前者少见。

拖尾因子（tailingfactor，Tf）——用以衡量色谱峰的对称性。

也称为对称因子（symmetryfactor）或不对称因子（asymmetryfactor）。

用于形容色谱峰拖尾和前伸的程度，多数为拖尾峰。

h进样进样

AB

1/10h

拖尾前伸

A、B如上图所示

通常Tf＝1.2-1.3，若Tf＞2则峰不合格。

峰拖尾的原因是硅胶基质上的Si－OH羟基未被全部键合而与溶质发生反应。

改进拖尾要用封尾技术：

即用小分子的含甲基的物质再次对硅胶进行键合，封闭硅羟基；还可在流动相中加入带–NH2氨基（对羟基敏感）的物质，将残余的羟基掩闭。

峰底——基线上峰的起点至终点的距离。

峰高（peakheight，h）——峰的最高点至峰底的距离。

峰宽（peakwidth，W）——峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。

W＝4σ

半峰宽（peakwidthathalf-height，Wh/2）——峰高一半处的峰宽。

Wh/2＝2.355σ

标准偏差（standarddeviation，σ）——正态分布曲线x＝±1时（拐点）的峰宽之半。

正常峰的拐点在峰高的0.607倍处。

标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。

σ小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高；反之，σ大，峰形胖、柱效低。

峰面积（peakarea，A）——峰与峰底所包围的面积。

A＝×σ×h＝2.507σh＝1.064Wh/2h

2．定性参数（保留值）

死时间（deadtime，t0）——不保留组分的保留时间。

即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。

在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。

死体积（deadvolume，V0）——由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。

它包括4部分：

进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙（被流动相占据，Vm）、柱出口管路体积、检测器流动池体积。

其中只有Vm参与色谱平衡过程，其它3部分只起峰扩展作用。

为防止峰扩展，这3部分体积应尽量减小。

V0＝F×t0（F为流速）

保留时间（retentiontime，tR）——从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。

保留体积（retentionvolume，VR）——从进样开始到某组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积。

又称洗脱体积。

VR＝F×tR

调整保留时间（adjustedretentiontime，t'R）——扣除死时间后的保留时间。

也称折合保留时间（reducedretentiontime）。

在实验条件（温度、固定相等）一定时，t'R只决定于组分的性质，因此，t'R（或tR）可用于定性。

t'R＝tR－t0

调整保留体积（adjustedretentionvolume，V'R）——扣除死体积后的保留体积。

V'R＝VR－V0或V'R＝F×t'R

3．柱效参数

理论塔板数（theoreticalplatenumber，N）——用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。

N取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相种类和流速及测定柱效所用物质的性质。

如果峰形对称并符合正态分布，N可近似表示为：

N为常量时，W随tR成正比例变化。

在一张多组分色谱图上，如果各组分含量相当，则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽，峰高则逐渐降低。

用半峰宽计算理论塔数比用峰宽计算更为方便和常用，因为半峰宽更易准确测定，尤其是对稍有拖尾的峰。

N与柱长成正比，柱越长，N越大。

用N表示柱效时应注明柱长，如果未注明，则表示柱长为1米时的理论塔板数。

（一般HPLC柱的N在1000以上。

）

若用调整保留时间（t'R）计算理论塔板数，所得值称为有效理论塔板数（N有效或Neff）。

理论塔板高度（theoreticalplateheight，H）——每单位柱长的方差。

H＝L/N。

实际应用时往往用柱长L和理论塔板数计算。

提高柱效的方法：

①固定相填料要均一，颗粒细，装填均匀。

②流动相粘度低。

③低流速。

④升高柱温。

4．相平衡参数

分配系数（distributioncoefficient，K）——在一定温度下，化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的浓度之比。

分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力有关。

在不同的色谱分离机制中，K有不同的概念：

吸附色谱法为吸附系数，离子交换色谱法为选择性系数　（或称交换系数），凝胶色谱法为渗透参数。

但一般情况可用分配系数来表示。

在条件（流动相、固定相、温度和压力等）一定，样品浓度很低时（Cs、Cm很小）时，K只取决于组分的性质，而与浓度无关。

这只是理想状态下的色谱条件，在这种条件下，得到的色谱峰为正常峰；在许多情况下，随着浓度的增大，K减小，这时色谱峰为拖尾峰；而有时随着溶质浓度增大，K也增大，这时色谱峰为前延峰。

因此，只有尽可能减少进样量，使组分在柱内浓度降低，K恒定时，才能获得正常峰。

在同一色谱条件下，样品中K值大的组分在固定相中滞留时间长，后流出色谱柱；K值小的组分则滞留时间短，先流出色谱柱。

混合物中各组分的分配系数相差越大，越容易分离，因此混合物中各组分的分配系数不同是色谱分离的前提。

在HPLC中，固定相确定后，K主要受流动相的性质影响。

实践中主要靠调整流动相的组成配比及pH值，以获得组分间的分配系数差异及适宜的保留时间，达到分离的目的。

容量因子（capacityfactor，k）——化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的量之比。

也称质量分配系数。

容量因子与保留时间之间有如下关系：

，t'R＝kt0。

上式说明容量因子的物理意义：

表示一个组分在固定相中停留的时间（t'R）是不保留组分保留时间（t0）的几倍。

k＝0时，化合物全部存在于流动相中，在固定相中不保留，t'R＝0；k越大，说明固定相对此组分的容量越大，出柱慢，保留时间越长。

容量因子与分配系数的不同点是：

K取决于组分、流动相、固定相的性质及温度，而与体积Vs、Vm无关；k除了与性质及温度有关外，还与Vs、Vm有关。

由于t'R、t0较Vs、Vm易于测定，所以容量因子比分配系数应用更广泛。

选择性因子（selectivityfactor，α）——相邻两组分的分配系数或容量因子之比。

α＝k2/k1（设k2＞k1）。

因k＝t'R/t0，则α＝t'R2/t'R1，所以α又称为相对保留时间。

要使两组分得到分离，必须使α≠1。

α与化合物在固定相和流动相中的分配性质、柱温有关，与柱尺寸、流速、填充情况无关。

从本质上来说，α的大小表示两组分在两相间的平衡分配热力学性质的差异，即分子间相互作用力的差异。

5．分离参数

分离度（resolution，R）——相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。

也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。

。

当R＝1时，称为4σ分离，两峰基本分离，裸露峰面积为95.4%，内侧峰基重叠约2%。

R＝1.5时，称为6σ分离，裸露峰面积为99.7%。

R≥1.5称为完全分离。

基本分离方程——分离度与三个色谱基本参数有如下关系：

其中称为柱效项，为柱选择性项，为柱容量项。

柱效项与色谱过程动力学特性有关，后两项与色谱过程热力学因素有关。

从基本分离方程可看出，提高分离度有三种途径：

①增加塔板数。

方法之一是增加柱长，但这样会延长保留时间、增加柱压。

更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。

②增加选择性。

当α＝1时，R＝0，无论柱效有多高，组分也不可能分离。

一般可以采取以下措施来改变选择性：

a.改变流动相的组成及pH值；b.改变柱温；c.改变固定相。

③改变容量因子。

这常常是提高分离度的最容易方法，可以通过调节流动相的组成来实现。

k2趋于0时，R也趋于0；k2增大，R也增大。

但k2不能太大，否则不但分离时间延长，而且峰形变宽，会影响分离度和检测灵敏度。

一般k2在1-10范围内，最好为2-5，窄径柱可更小些。

III．HPLC系统

HPLC系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。

其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。

有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等，现代HPLC仪还有微机控制系统，进行自动化仪器控制和数据处理。

制备型HPLC仪还备有自动馏分收集装置。

目前常见的HPLC仪生产厂家国外有Waters公司、Agilent公司（原HP公司）、岛津公司等，国内有大连依利特公司、上海分析仪器厂、北京分析仪器厂等。

一、输液泵

1．泵的构造和性能

输液泵是HPLC系统中最重要的部件之一。

泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性。

输液泵应具备如下性能：

①流量稳定，其RSD应＜0.5%，这对定性定量的准确性至关重要；②流量范围宽，分析型应在0.1-10mL/min范围内连续可调，制备型应能达到100ml/min；③输出压力高，一般应能达到150-300kg/cm2；④液缸容积小；⑤密封性能好，耐腐蚀。

泵的种类很多，按输液性质可分为恒压泵和恒流泵。

恒流泵按结构又可分为螺旋注射泵、柱塞往复泵和隔膜往复泵。

恒压泵受柱阻影响，流量不稳定；螺旋泵缸体太大，这两种泵已被淘汰。

目前应用最多的是柱塞往复泵。

柱塞往复泵的液缸容积小，可至0.1ml，因此易于清洗和更换流动相，特别适合于再循环和梯度洗脱；改变电机转速能方便地调节流量，流量不受柱阻影响；泵压可达400kg/cm2。

其主要缺点是输出的脉冲性较大，现多采用双泵系统来克服。

双泵按连接方式可分为并联式和串联式，一般说来并联泵的流量重现性较好（RSD为0.1%左右，串联泵为0.2-0.3%），但出故障的机会较多（因多一单向阀），价格也较贵。

各品牌输液泵的基本参数：

项目

Waters515

HP1100

LC-10ATvp

EliteP200II

检定要求

流速范围

0.001-10

0.001-10

0.001-9.999

0.01-4.99

调节精度

0.001

0.001

0.001

0.01

流量精密度

RSD0.1%

0.15%（<0.3%）

0.3%

0.5%

1.5%

流量准确度

±2.0%

±5.0%

±2.0%

最高压力

4000Psi

40MPa

39.2MPa

40.0MPa

2．泵的使用和维护注意事项

为了延长泵的使用寿命和维持其输液的稳定性，必须按照下列注意事项进行操作：

①防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。

流动相最好在玻璃容器内蒸馏，而常用的方法是滤过，可采用Millipore滤膜（0.2µm或0.45µm）等滤器。

泵的入口都应连接砂滤棒（或片）。

输液泵的滤器应经常清洗或更换。

②流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应保留在泵内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下。

如果将含缓冲液的流动相留在泵内，由于蒸发或泄漏，甚至只是由于溶液的静置，就可能析出盐的微细晶体，这些晶体将和上述固体微粒一样损坏密封环和柱塞等。

因此，必须泵入纯水将泵充分清洗后，再换成适合于色谱柱保存和有利于泵维护的溶剂（对于反相键合硅胶固定相，可以是甲醇或甲醇-水）。

③泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最终产生漏液。

④输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏液。

⑤流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，如果有大量气泡，泵就无法正常工作。

如果输液泵产生故障，须查明原因，采取相应措施排除故障：

①没有流动相流出，又无压力指示。

原因可能是泵内有大量气体，这时可打开泄压阀，使泵在较大流量（如5mL/min）下运转，将气泡排尽，也可用一个50mL针筒在泵出口处帮助抽出气体。

另一个可能原因是密封环磨损，需更换。

②压力和流量不稳。

原因可能是气泡，需要排除；或者是单向阀内有异物，可卸下单向阀，浸入丙酮内超声清洗。

有时可能是砂滤棒内有气泡，或被盐的微细晶粒或滋生的微生物部分堵塞，这时，可卸下砂滤棒浸入流动相内超声除气泡，或将砂滤棒浸入稀酸（如4mol/L硝酸）内迅速除去微生物，或将盐溶解，再立即清洗。

③压力过高的原因是管路被堵塞，需要清除和清洗。

压力降低的原因则可能是管路有泄漏。

检查堵塞或泄漏时应逐段进行。

3．梯度洗脱

HPLC有等强度（isocratic）和梯度（gradient）洗脱两种方式。

等度洗脱是在同一分析周期内流动相组成保持恒定，适合于组分数目较少，性质差别不大的样品。

梯度洗脱是在一个分析周期内程序控制流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和pH值等，用于分析组分数目多、性质差异较大的复杂样品。

采用梯度洗脱可以缩短分析时间，提高分离度，改善峰形，提高检测灵敏度，但是常常引起基线漂移和降低重现性。

梯度洗脱有两种实现方式：

低压梯度（外梯度）和高压梯度（内梯度）。

两种溶剂组成的梯度洗脱可按任意程度混合，即有多种洗脱曲线：

线性梯度、凹形梯度、凸形梯度和阶梯形梯度。

线性梯度最常用，尤其适合于在反相柱上进行梯度洗脱。

在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不断变化，因此带来一些特殊问题，必须充分重视：

①要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相。

有些溶剂在一定比例内混溶，超出范围后就不互溶，使用时更要引起注意。

当有机溶剂和缓冲液混合时，还可能析出盐的晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心。

②梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高，以保证良好的重现性。

进行样品分析前必须进行空白梯度洗脱，以辨认溶剂杂质峰，因为弱溶剂中的杂质富集在色谱柱头后会被强溶剂洗脱下来。

用于梯度洗脱的溶剂需彻底脱气，以防止混合时产生气泡。

③混合溶剂的粘度常随组成而变化，因而在梯度洗脱时常出现压力的变化。

例如甲醇和水粘度都较小，当二者以相近比例混合时粘度增大很多，此时的柱压大约是甲醇或水为流动相时的两倍。

因此要注意防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱能承受的最大压力。

④每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理，使其恢复到初始状态。

需让10-30倍柱容积的初始流动相流经色谱柱，使固定相与初始流动相达到完全平衡。

二、进样器

早期使用隔膜和停流进样器，装在色谱柱入口处。

现在大都使用六通进样阀或自动进样器。

进样装置要求：

密封性好，死体积小，重复性好，保证中心进样，进样时对色谱系统的压力、流量影响小。

HPLC进样方式可分为：

隔膜进样、停流进样、阀进样、自动进样。

1．隔膜进样。

用微量注射器将样品注入专门设计的与色谱柱相连的进样头内，可把样品直接送到柱头填充床的中心，死体积几乎等于零，可以获得最佳的柱效，且价格便宜，操作方便。

但不能在高压下使用（如10MPa以上）；此外隔膜容易吸附样品产生记忆效应，使进样重复性只能达到1-2%；加之能耐各种溶剂的橡皮不易找到，常规分析使用受到限制。

2．停流进样。

可避免在高压下进样。

但在HPLC中由于隔膜的污染，停泵或重新启动时往往会出现“鬼峰”；另一缺点是保留时间不准。

在以峰的始末信号控制馏分收集的制备色谱中，效果较好。

3．阀进样。

一般HPLC分析常用六通进样阀（以美国Rheodyne公司的7725和7725i型最常见），其关键部件由圆形密封垫（转