鬼臼毒衍生物诱导人肺腺癌A549细胞凋亡.docx

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鬼臼毒衍生物诱导人肺腺癌A549细胞凋亡

鬼臼毒衍生物诱导人肺腺癌A549细胞凋亡

【关键词】鬼臼毒素；肺肿瘤；腺癌；,细胞凋亡；抗原,CD95；基因,Bcl

　　ApoptosisinhumanlungadenocarcinomacelllineA549byderivativeofpodophyllotoxin

　　【Abstract】AIM:

TostudytheapoptosisofhumanlungadenocarcinomaA549cellsinducedbyCN2,aderivativeofpodophyllotoxin,andtoobtaininsightsintoitsmolecularmechanismofaction.METHODS:

MTTassay,electronmicroscopy,DNAagarosegelelectrophoresisandcellcycleananlysiswereusedtoexamineapoptosisinA549cells.ExpressionsofBcl2,caspase3andFasproteinsweremeasuredwithflowcytometry.RESULTS:

CN2wasdemonstratedtoexertantiproliferativeactivityinadoseandtimedependentmanner.IC50ofA549after24,48,72hexposuretoCN2was,,mg/L,respectively.Typicalapoptoticmorphologicalchangeswereobservedbyelectronmicroscope;agarosegelelectrophoresisshowedanevidentDNAfragmentation;cellcycleanalysisindicatedanincreasedSphaseproportion,aswellasanapparentS/G2phasearrest.CN2decreasedBcl2proteinexpression（P<dramatically.Fasproteinexpressionshowednoobviouschanges.CONCLUSION:

CN2couldinhibitthegrowthofA549cellsviatheinductionofS/G2phasearrest,whichisprobablyassociatedwiththedecreasedBcl2expressionandcellcyclearrest.

　　【Keywords】podophyllotoxin;lungneoplasms;adenocarcinoma;apoptosis;antigens,CD95;genes,Bcl2

　　【摘要】目的：

研究鬼臼素衍生物CN2对人肺腺癌细胞A549的凋亡诱导作用，并对其分子机制进行初步探讨.方式：

采纳四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法、电子显微镜、DNA琼脂糖凝胶电泳和细胞周期分析法检测A549细胞凋亡；采纳流式细胞术（FCM）测定细胞Bcl2,Fas及caspase3蛋白表达水平.结果：

CN2对A549细胞增殖具有明显的剂量和时刻依托的抑制作用，24,48,72hIC50别离为,,mg/L，电镜观看呈现典型的凋亡形态改变；DNA电泳可见明显的梯状条带；细胞周期分析显示S期细胞数明显增多，显现S/G2期阻滞；CN2能显著降低Bcl2蛋白表达（P<；Fas蛋白表达水平未见明显转变.结论：

CN2通过诱导A549细胞发生S/G2期阻滞而抑制其增殖，其机制可能与下调Bcl2表达及阻滞细胞周期有关.

　　【关键词】鬼臼毒素；肺肿瘤；腺癌；细胞凋亡；抗原，CD95；基因，Bcl2

　　0引言

　　鬼臼毒类化合物用于民间药物医治已有较长的历史，目前临床上比较成熟的药物依托泊甙（etoposide,vp16）和替尼泊甙（teniposide,VM26）对小细胞肺癌有良好的疗效.但由于此类化合物水溶性差、抗瘤谱窄及具有较严峻的骨髓抑制作用等不足使其应用受到限制［1］.自旋标记化合物CN2是一种引入了氮氧自由基的去甲表鬼臼毒（4β［2”,2,6”,6四甲基1”,2”,5”,6”四氢吡啶氮氧自由基4”西佛碱丁基］4脱氢4去甲表鬼臼毒,英文名为4β［2”,2,6”,6tetramethyl1”,2”,5”,6”tetrahydropyridinenitroxyl4”shiffsbase］4deoxy4demethylepipodophyllotoxin），其同类化合物可显著抑制小鼠移植性肿瘤白血病P388和实体瘤S180，能够诱导Raji细胞、NB4细胞凋亡［2-3］.咱们观看了CN2对人肺腺癌A549细胞的凋亡诱导效应，并对其作用机制进行了初步探讨.

　　1材料和方式

　　材料鬼臼毒素由兰州大学化工学院合成，用DMSO配成8g/L的贮备液，-20℃冻存备用.MTT购自Sigama公司.流式细胞术（FCM）用单抗（FITC标记的鼠抗人FasmAb和鼠IgG1同型对照，FITC标记的美国仑鼠抗人Bcl2mAb和美国仑鼠抗人单克隆IgG同型对照），为美国Caltag产品.A549细胞株购自中科院上海细胞生物学研究所.细胞贴壁生擅长含100g/L小牛血清（杭州四季青生物工程公司产品）的RPMI1640（GibcolBRL公司）完全培育基中，用含g/L胰酶的消化液进行传代,置37℃,50mL/LCO2孵箱中培育.实验时选用对数生长期细胞.

　　方式细胞增殖活性检测采纳MTT比色法，将细胞密度调整为1×108/L，接种于96孔培育板（Costar），每孔100μL,实验组别离加入不同浓度（10,20,40,80mg/L）CN2,对照组加入等体积PBS,另设只加完全培育液的调零组,每组4个复孔,饱和湿度条件下,37℃,50mL/L培育箱中培育,别离于24,48,72h加入MTT10μL/孔.继续培育4h，每孔加入100g/L的SDS100μL终止培育，37℃留宿，用酶联免疫检测仪测定570nm波优势A值，计算细胞生长抑制率和半数抑制浓度（IC50）.细胞经80mg/LCN2作用48h后用g/L胰酶消化，搜集细胞悬液离心（900r/min）5min,30g/L戊二醛固定48h,10g/L四氧化锇染色，经梯度脱水，Epon812包埋，超薄切片，铀铅双染子显微镜（JEM1230，日本电子公司）观看细胞超微结构，美国Gatan公司CCD搜集系统照相［4］.搜集80mg/LCN2作用48h后的细胞，常规提取DNA,15g/L琼脂糖凝胶，75V,50mA电泳h，应用凝胶图像分析系统（北京鼎永科技产品）观看.细胞周期分析，CN2作用24,48h后，搜集A549细胞，PBS洗涤，700mg/L冷乙醇固定，PI染色，FCM（CoulterEPICSXL）检测细胞周期时相的散布.A549细胞经CN2作用12,24h，搜集1×106个细胞，PBS洗涤.加入FITC标记的鼠抗人Bcl2mAb，鼠抗人FasmAb及鼠IgG1同型对照后，FCM别离检测Bcl2,Fas及caspase3蛋白的阳性表达率和平均荧光强度［5］.

　　2结果

　　抑制A549细胞增殖A549细胞经CN2作用24,48,72h后,代谢MTT的能力明显降低,显示较强的细胞毒性反映,呈剂量效应、时刻效应依托关系,CN2浓度为X轴，抑制率为Y轴，用Excel作图，别离取得不同时刻段的直线回归方程:

Y24h=+，Y48h=+,Y72h=+,由此可得24,48,72h的IC50估量值别离为,,mg/L（图1）.所用统计学软件为.

　　诱导A549细胞凋亡经不同浓度CN2处置A549细胞48h后，电镜下依次显现染色质凝集并边集、核碎裂及凋亡小体形成等凋亡的典型形态学改变，第二线粒体肿胀也可见（图2）.

　　对细胞周期的阻碍经20,40mg/LCN2作用24,48h后,S期细胞所占比例与对照组比较均增加（P<）,且随浓度增高而增多,以40mg/LCN2作用48h时增加幅度较大,为同期生长的对照细胞的2倍,G2/M期细胞减少显著，提示细胞发生S/G2期阻滞（表1）.

　　图1CN2对A549细胞生长的抑制（略）

　　A：

正常肿瘤细胞；B：

20mg/LCN2作用后，部份线粒体肿胀；C：

40mg/L作用后，显现染色质边集现象；D：

80mg/L作用后，有凋亡小体形成.

　　图2A549细胞铅铀双染的电镜照片×8000（略）

　　表1CN2作用后A549细胞的周期散布（略）　　琼脂糖凝胶电泳CN2作用48h后显现典型梯状条带（图3）.

　　M:

200bpmarker;1:

80mg/L;2:

40mg/L;3:

20mg/L;4:

对照组.

　　图3CN2对A549细胞凋亡的阻碍（略）

　　对A549细胞Bcl2,Fas蛋白表达的阻碍CN2处置后的A549细胞，Bcl2蛋白表达在CN2处置组较对照组显著降低（P<）,高剂量CN2组降低Bcl2蛋白的作用大于低剂量CN2组,Bcl2蛋白下调以40mg/LCN2作用12h时最明显,为对照组的倍.CN2作用前后Fas的表达水平转变不明显（表2）.

　　表2CN2对A549细胞Bcl2,Fas蛋白表达的阻碍（略）

　　PR：

阳性率，MFI：

平均荧光强度.

　　3讨论

　　鬼臼毒类衍生物属细胞周期依托性和特异性抗肿瘤药物，其抗癌机制可能与拓扑异构酶Ⅱ有关［6］，对S末期细胞具有较强的杀伤作用.关于这方面已有较成熟的理论.本实验利用的鬼臼毒的衍生物CN2对A549细胞表现出了明显的增殖抑制作用和凋亡诱导作用，致使A549细胞显现典型的形态和生化改变.CN2可使A549细胞发生S期阻滞，提示它能够阻止A549细胞由S期向G2期转变，抑制肿瘤细胞割裂和增殖，这进一步证明了加入氮氧基后的鬼臼毒仍维持了其母体的抗瘤活性.

　　药物诱导肿瘤细胞凋亡的调控机制超级复杂，两种直接途径是死亡受体途径和线粒体途径［7］.Bcl2家族是参与细胞生存或凋亡的重要调剂蛋白，与线粒体途径紧密相关.Bcl2蛋白散布于线粒体外膜、内质网表面及核膜,具有稳固线粒体膜功能、阻止线粒体释放Caspase及凋亡诱导因子（AIF），细胞色素C等作用.研究发觉，位于线粒体膜的Bcl2抗凋亡能力明显高于其他部位［8］.Bcl2蛋白可作用于线粒体通透性转换孔（PTP）相关蛋白，阻止PTP开放，维持ΔΨｍ,从而阻止细胞凋亡初期时期PTP释放及由此引发染色质浓缩和DNA断裂的蛋白质.另研究显示Bcl2基因过度表达能够维持正常ΔΨｍ,而阻止细胞凋亡［9］.Bcl2抗细胞凋亡的另一个机制是抗氧化力,抑制其诱导细胞凋亡.Bcl2能够抑制Ros诱导细胞凋亡,并以为其可能与线粒体SOD反映而起作用.咱们研究发觉CN2能够下调Bcl2蛋白的表达水平，且呈时刻、浓度依托性，推测通过降低Bcl2蛋白的水平引发线粒体内膜通透性的改变及随后的线粒体的释放反映（细胞色素C由线粒体膜间隙进入胞质）是CN2诱导A549细胞凋亡的机制之一.Fas抗原（APO1或CD95）是细胞表面的一种凋亡信号受体，属于死亡受体途径中的死亡信号蛋白，Fas蛋白表达越高的细胞通过与自身Fas配体彼此作用引发细胞自杀性死亡即凋亡的作用越强.咱们的实验研究发觉，CN2作用前与作用后Fas蛋白表达水平相对都较低，其缘故可能有①Fas可能不参与CN2诱导的A549细胞的凋亡；②实验重复性差.关于CN2的研究还在进一步深切中.

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