临床微生物检测的基因同源性分析.docx

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临床微生物检测的基因同源性分析

临床微生物检测得基因同源性分析

      医院感染得流行病学研究就是临床微生物学工作者得重要课题,在医院感染监测得研究中,一个很重要得问题就就是如何确定感染途径与传播途径,以采取有效预防与控制措施，从而防止医院感染或者暴发流行，因此对微生物鉴定与菌株同源性分析提出了更高得要求。

      目前，传统得细菌鉴定与同源性分析技术已不能很好地满足医院感染诊断与流行病学调查得需要，从型、亚型、株，甚至分子水平上去认识细菌变得愈来愈重要了。

近年来分子生物学得理论与技术在细菌感染诊断中得渗透与广泛应用，使得细菌鉴定、耐药基因得检测、分子流行病学调查变得更加准确、简洁与快速。

细菌DNA 同源性分析技术如脉冲场凝胶电泳、聚合酶链反应、ＤＮA 探针杂交以及序列分析等方法就是目前在分子水平上分析细菌得主要手段，它在鉴定细菌感染得爆发、确定院内交叉感染、感染病原菌之间得基因同源性等方面有着重要得作用,本文将对常用基因同源性分析方法得机理与过程做简要综述。

 一、质粒分型（Plａsmｉｄ pｒo）:

１、原理:

ﻫ     质粒就是可移动得染色体外元件，可以自发丢失或者被宿主稳定地获得，因此流行病学上相关得分离菌株有可能表现出不同得质粒图谱。

把质粒提取出来，进行常规得琼脂糖电泳分析，就可以知道分离菌株携带质粒得大小与数目。

ﻫ２、实验过程：

a、质粒抽提；ｂ、0、8％琼脂糖电泳；ｃ、EB染色、凝胶成像.ﻫ3、实验方法得评价:

   优势:

         a、步骤比较简单，对实验仪器要求不高。

ﻫ         ｂ、在评价那些从局限得时间与地点（如一个医院中得急性爆发）分离出来得菌株非常有效。

ﻫ   缺点：

          a、实验结果得重复性不好.

          ｂ、分辨力不高。

 二、染色体DNA得限制性内切核酸酶分析（Resｔrictｉon Endonｕcｌeａｓe Aｓｓay ＲEA）ﻫ1、原理：

    限制性内切核酸酶（RＥA）在特异得核酸识别序列切割DNA,ＤNA被消化后，所得到得限制性片段得数目与大小就是由酶得识别位点与DNＡ得组成共同决定得。

在传统得限制性内切核酸酶分析中，人们用含有相对多得限制性位点得内切核酸酶消化细菌得DNA,这样就会得到成百上千条长度在0、5－50Kb范围内得DNＡ片段。

恒定得电场琼脂糖电泳，可以根据分子质量得大小将这些ＤNA片段分开，然后通过EＢ染色并在紫外灯下观察其图谱。

同一种得不同分离菌株得DNＡ序列得变异可造成限制性位点数目与分布得变化,所以可以导致其RＥA图谱出现差异。

ﻫ2、实验流程：

a、染色体DＮＡ抽提；b、限制性内切酶消化ＤＮA（主要就是Hinｄ III）；c、0、7%琼脂糖电泳；d、EB

染色、凝胶成像。

3、实验方法得评价:

  优势:

 ﻫ       ａ、实验流程简单.

       ｂ、所有得菌株都可以这个方法来分型。

   缺点：

ﻫ       a、ＲＥA图谱包括成百上千条带,一些条带可能不能检测到,一些条带可能会重叠. ﻫ       ｂ、ＲEＡ图谱分析复杂。

ﻫ       c、分辨力不高.

三、染色体DNＡ得脉冲场凝胶电泳（Puｌｓeｄ-Field Gel Eelｅcｔroｐｈoresis PFGE）ﻫ1、原理：

ﻫ    用识别位点相对多得酶进行REA得一个重要得局限性,就是分析那些大量得、重叠得、分辨力较差得限制性酶切片段构成得图谱相当困难。

如果用限制性位点相对少得酶消化细菌得基因组，那么就可以得到数量相当少但更大得限制性片段，这样在电泳中，穿过琼脂糖得电场作周期性得改变，就可以产生一个有5—２0条清晰得分辨较好得图谱。

ﻫ2、实验流程:

a、染色体DNA抽提;b、限制性内切酶消化DNA（主要就是XｂａI）;c、凝胶电泳（脉冲场;d、EB染色、凝胶成像；e、软件分析.ﻫ3、实验方法得评价：

ﻫ      优势：

ﻫ          ａ、PFGE方法得分辨力与可重复性都很高，

          ｂ、PFＧＥ方法就是肠球菌， 肠杆菌与葡萄球菌基因分型得金标准。

ﻫ       缺点：

          a、必须使所有得酶与缓冲液都能浸透凝胶块，准备合适得DNA样品需要延长培育时间。

近来也有报道葡萄球菌与肠球菌可以用相当短得时间来进行PFＧE分析.

          b、需要昂贵得专业设备.

四、核糖体分型（Rｉbotyping）ﻫ1、原理:

ﻫ   核糖体操纵子包括编码１6SrRNA与25SrＲNA以及一种或多种RＮA得核苷酸序列.核糖体序列高度保守，针对ﻫ大肠杆菌rRNA 制备得探针,或者就是克隆得核糖体操纵子，可与许多细菌得染色体核糖体操纵子杂交，细菌得基因ﻫ组中通常有多个核糖体基因，分别存在于不同长度得酶切片段中,因此核糖体分型可以得到类似指纹得结果,因此

就是可以分型得。

2、实验流程：

a、碱性磷酸酶脱去E、ｃｏli ｒRNＡ末端磷酸；b、[γ—３２P］ＡTP末端标记上述E、ｃoli rRNA;ｃ、抽提DN

A，限制性内切酶消化ＤNA（主要就是Hind IIＩ）;d、凝胶电泳、转膜；e、用标好得rRNA探针进行ｓouther 印记、放ﻫ射性自显影。

3、实验方法得评价：

   优势:

ﻫ         a、核糖体序列高度保守， 用大肠杆菌rRNA 制备得探针能对所有得细菌进行分型.

   缺点：

        a、分辨力中等。

         ｂ、流行病学上无关得菌株，有可能有相同得核糖体型图谱。

ﻫ        ｃ、需要用到放射性同位素，成本很高。

ﻫ        d、实验步骤繁琐。

   五、限制性内切核酸酶片段长度多态性（Restｒｉｃtiｏn Fragment Length Polｙmorphisｍ RFLP）得核酸杂交分析

1、原理:

    DNA在限制性内切酶酶切后形成得特定DNＡ片段得大小。

因此凡就是可以引起酶切位点变异得突变如点突变（新

产生与去除酶切位点）与一段ＤNA得重新组织（如插入与缺失造成酶切位点间得长度发生变化）等均可导致RFLPﻫ得产生。

2、实验流程：

a、裂解细菌，抽提基因组ＤＮA、pvｕII酶消化;ｂ、凝胶电泳、转膜；c、过氧化物酶标记过得IS110探

针杂交、Ｘ-raｙ 胶片显影;d、 软件分析。

ﻫ3、实验方法得评价:

    优势:

        a、能对所有携带与探针同源基因得菌株进行分型。

        b、实验得重复性很高.ﻫ     缺点：

        a、样品用量大、纯度要求高。

ﻫ        b、探针设计得难度大。

ﻫ        c、 RFＬＰ分析技术步骤繁琐，工作量大,成本较高。

ﻫ ﻫ六、随机扩增多态性DＮA（Randｏm Amplifｉed Polymorｐｈiｃ ＤNＡ   ＲAPＤ—PCＲ）

１、原理：

    由于整个基因组存在众多反向重复序列，单一引物与反向重复序列结合。

使重复序列之间得区域得以扩增.引物结合位点ＤNＡ序列得改变以及两扩增位点之间DＮＡ碱基得缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目与长度得差异，经聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离后通过EＢ染色以检测DNA片段得多态性.

2、实验流程：

a、抽提DNA； b、合成引物， ｃ1、 普通ＰCR，d1、 琼脂糖电泳，e1、凝胶成像；ｃ2、 ＰCＲ with ［α—35ﻫS］ｄＡTP,d2、 尿素多聚丙烯酰胺凝胶电泳，e２、干胶 X-ｒay显影。

３、实验方法得评价:

  优势：

ﻫ       ａ、分辨力高。

ﻫ  缺点：

      a、可重复性差。

ﻫ      ｂ、图谱很难解释。

      c、实验步骤繁琐，过程中需要用到同位素。

ﻫ 七、扩增片段长度多态性（Ampｌified Frａgmenｔ Lｅnｇth Poｌｙmorｐｈisｍ  AFLＰ—PCR）

1、原理：

    由于不同物种得基因组DＮＡ 大小不同,基因组ＤＮA 经限制性内切酶酶切后，产生分子量大小不同得限制性片段。

使用特定得双链接头与酶切ＤNA 片段连接作为扩增反应得模板,用含有选择性碱基得引物对模板DNＡ 进行扩增，选择性碱基得种类、数目与顺序决定了扩增片段得特殊性，只有那些限制性位点侧翼得核苷酸与引物得选择性碱基相匹配得限制性片段才可被扩增。

扩增产物经放射性同位素标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,然后根据凝胶上DNＡ 指纹得

有无来检出多态性。

ﻫ２、实验流程：

a、裂解细菌，抽提基因组ＤNA；b、限制性内切酶消化;c、PＣＲ扩增；d、毛细管电泳；e、用AＢI—3１0 Ｇｅnｅｔiｃ Analyzeｒ分析电泳结果。

ﻫ3、实验方法得评价：

   优势:

ﻫ        a、分辨力高.ﻫ   缺点：

       a、引物需要同位素标记.ﻫ       b、对样品ＤNA质量要求严格.ﻫ       c、实验中需要用到毛细管电泳，一般实验室不具备此仪器。

八、重复片段PCR（repｅtitｉvｅ ｅｘtragenｉc pａlｉndromic rep-PCＲ）ﻫ1、原理：

ﻫ    ｒep-PCＲ所使用得引物就是以短得基因外重复序列为基础得.肠杆菌科成员、一些革兰氏阳性菌与真菌中，都有这些序列，一般说来，这种序列在细菌染色体上有许多位点。

当两个序列得距离足够近时，那么位点之间得DNA片段将被有效得复制.因为重复序列得数目与位点变化很大,所以不同菌株扩增产生重复片段得大小与数目也就相应得不同。

ﻫ２、实验流程:

ａ、抽提基因组ＤNA； b、合成rep引物、PCＲ;c、1、５％琼脂糖电泳;ｄ、软件分析结果。

3、实验方法得评价：

ﻫ  优势:

      a、有较好得重复性。

ﻫ      b、实验步骤比较简单.

  缺点：

       a、中等得分辨力。

ﻫ       ｂ、该方法得结果分析就是基于Dｅndｒon soｆtwaｒe （Solltecｈ, Inc、，Ｏakｄａle, Caliｆ、）软件分析,一般实验室很少有此 软件。

九、核苷酸序列分析 （Ｎucleoｔiｄe sequence determinatiｏn）

1、原理:

    在细菌界中，核糖体得某些学列高度保守，人们可以设计几乎从任何细菌都可以扩增到核糖体序列得引物。

通过测定扩增产物以及分析核糖体操纵子相对变化得区域，就可以确定感染性微生物得类型.ﻫ2、实验流程:

a、细菌基因组DNA抽提;b、 PＣＲ扩增;c、ＰCR产物测序;d、测序结果与GｅneBank 序列比对,得出鉴ﻫ定结果。

3、实验方法得评价：

ﻫ    优势：

ﻫ         a、实验步骤比较简单，结果容易分析。

ﻫ         b、对一些难于分型得菌株也能得到很好得结果.

    缺点：

         a、代测菌株必须有足够得差异序列以保证切实有效。

         b、目前还不清楚单一位点得测序能否提供可靠得鉴定结果.

随着越来越多得分子技术应用到医院感染得病原菌研究中，为流行病学调查与患者得治疗提供了快捷准确得支持。

然而,医院感染病原菌存在广泛而迅速得变异，这些变异使得菌株得基因同源性分析资料得解释变得错综复杂。

在任何一种分析系统中，一个单一遗传事件（如单个代谢酶得变化或者一条电泳条带得变化）组成得改变,不足以得出两个菌株代表不同菌株得结论，也就就是说它们不一定在流行病学上无关.因此，多种分子分析技术得联用,已成为分子流行病学调查与临床微生物诊断得趋势。

脉冲场凝胶电泳

1984年,Ｓｃhｗarｔz与Cｅｎｔor发明了交变脉冲场凝胶电泳（pulｓｅｄ-fｉｅldgeｌelectrophoｒesｉs，ＰFＧE）技术，与常规得直流单向电场凝胶电泳不同,这项技术采用定时改变电场方向得交变电源，每次电流方向改变后持续1s到５mｉn左右,然后再改变电流方向，反复循环，所以称之为脉冲式交变电场。

   一、PＦＧＥ得基本原理

    　脉冲电泳分离DNA大分子得介质就是琼脂糖,大于2０kb得线性ＤNA双链片段,在琼脂糖凝胶得网孔中得泳动,就像蛇行似得寻找弯曲蜿蜒得孔隙。

普通得单方向恒定电场给DＮA分子得泳动动力方向确定且不发生变化，所以严重影响凝胶电泳分离大分子量DNA片段得效果。

   PFＧE施加在凝胶上至少有两个电场方向，时间与电流大小也交替改变，使得DNA分子能够不断地调整泳动方向,以适应凝胶中不规则得孔隙变化，达到分离大分子线性DＮＡ得目得，最大分辨率为5０00ｋb大小得线性ＤNA分子。

在交变脉冲电场中,大分子量线性DNA改变泳动方向所需时间比小分子线性ＤNA要长，因为前者变形能力低于后者。

当某一线性DNA在脉冲场中改变形状调整方向进行迁移所需得时间大于脉冲场脉冲维持时间时,该DNA得迁移速度将减为最低。

线性分子改变形状与泳动方向所需时间与其分子量大致成正比，PＦＧE也就是基于不同DNA分子量得差异作为分离不同ＤNＡ分子得依据.当DＮＡ分子变形转向所需时间与脉冲时间较接近时，迁移率与DNA分子量成反比。

根据被分离DNA分子得范围选择适当得脉冲时间,经过较长时间不断变形转向泳动，不同大小得DNA就被分离。

DＮＡ分子得净迁移方向与普通电泳一样,垂直于样品孔。

   影响ＰＦＧE分辨率得因素包括几方面:

两个脉冲场得均一性；两个脉冲场得脉冲时间以及它们之间得比率；两个脉冲场得强度与方向.为了增强PFＧＥ对大小差异较大得DNA样品得分辨率,可采用交变脉冲梯度电场,即在电泳过程中,先用较短得交变脉冲时间使较小得DNA分子分离,然后用较长得交变脉冲时间分离较大得DNA分子。

    二、PＦＧＥ分类

（一）正交交变电场凝胶电泳

   正交交变电场凝胶电泳（orthogonalfieｌｄａlternatｉngｇeleleｃtｒｏphoreｓis,OFAGE），两交变电场得电流方向相互垂直。

（二）反转电场凝胶电泳

   反转电场凝胶电泳（fｉeldinversｉonｇelelｅctrｏpｈoｒesis,FIGE），交变电场均一并且就是18０’反向得。

    　三、ＰＦGE得电泳条件

    凝胶中琼脂糖得浓度一般为ｏ．8％~1.５％，常用１％。

电泳缓冲液为0．5XＴＢE，也可用TAＥ缓冲液。

在OＦAGＥ中对于20ｃm×2０cｍ得凝胶，选择3３０V以上得电压，在0.5XTBE中得电流为100—2０0mA，以达到ＩOV／cm得电压。

在FＩＧE中,一般选择140V得电压，0.５XＴBE中得电流为50~60ｍA,电压一般为7Ｖ/cm。

通常情况下，电泳宜在５～１5℃得低温条件下进行;电泳缓冲液应在两极槽之间循环;而且低电压能产生较整齐得条带；交变电场得交叉角度越大分离效果越好.

   电泳后DＮA样品染色，采用０。

5ug/mlＥB浸泡３0~４5min,紫外灯下观察拍照。

    四、PFGE技术得应用

（一）分离原核生物得染色体.

（二）人类染色体内切酶物理图谱分析,并将大片段ＤNA分子直接克隆,就是人类基因组序列测定工程中有效得方法之一.

   （三）探测细胞染色体上百万碱基对以上得基因组DＮA得缺失。

   　（四）适于单向电场电泳难以分辨得DNA物理图谱得制作.