蛋白质的分离纯化.docx

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蛋白质的分离纯化

蛋白质的分离纯化

一，蛋白质（包括酶）的提取

　　大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。

（一）水溶液提取法

　　稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。

提取的温度要视有效成份性质而定。

一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。

但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。

为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。

下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。

1、pH值

　　蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH范围内。

用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。

2、盐浓度

　　稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。

同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以0.15摩尔。

升浓度为宜。

缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。

（二）有机溶剂提取法

　　一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。

但必须在低温下操作。

丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为6.6%）不会引起酶的变性失活。

另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。

二、蛋白质的分离纯化

蛋白质的分离纯化方法很多，主要有：

（一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法

1、蛋白质的盐析

　　中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4）有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。

盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。

由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。

　　影响盐析的因素有：

（1）温度：

除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般可在室温中进行。

一般温度低蛋白质溶介度降低。

但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低，更容易盐析。

（2）pH值：

大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。

（3）蛋白质浓度：

蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。

因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2.5-3.0%。

　　蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。

其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25度时饱和溶液为4.1M，即767克/升；0度时饱和溶解度为3.9M，即676克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。

硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。

　　蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入秀析袋内（常用的是玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。

此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。

2、等电点沉淀法

　　蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。

3、低温有机溶剂沉淀法

　　用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。

（二）根据蛋白质分子大小的差别的分离方法

1、透析与超滤

　　透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。

　　超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质。

2、凝胶过滤法

　　也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。

柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶（Sephadexged）和琼脂糖凝胶（agarosegel）。

（三）根据蛋白质带电性质进行分离

蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同，可将其分开。

1、电泳法

　　各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。

值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。

2、离子交换层析法

　　离子交换剂有阳离子交换剂（如：

羧甲基纤维素；CM-纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素；DEAE?

FONTFACE="宋体"LANG="ZH-CN">纤维素），当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。

（详见层析技术章）

（四）根据配体特异性的分离方法－亲和色谱法

　　亲和层析法（aflinitychromatography）是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。

这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体（Ligand）的分子能特异而非共价地结合。

其基本原理：

蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离（Separation），提纯（Purification）

和鉴定（Characterization）是生物化学中的重要的一部分，至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来，因此往往采取几种方法联合使用。

蛋白质提取与制备

ProteinExtractionandPreparation

zhaott提供

蛋白质提取与制备蛋白质种类很多，性质上的差异很大，既或是同类蛋白质，因选用

材料不同，使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适

用各类蛋白质的分离。

但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均

可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有

机溶剂中。

因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质和酶。

蛋白质与酶在不同溶剂中溶

解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这

些基团的排列和偶极矩。

故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。

温度、

pH、离子

强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。

提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用。

将细胞内蛋白质提取出来。

并与其它不需要的物质分开。

但动物材料中的蛋白质有些可溶性

的形式存在于体液（如血浆、消化硫等）中，可以不必经过提取直接进行分离。

蛋白质中的

角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、

糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。

这些蛋白质经细胞破碎后，用

水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来，再用离心法除去不溶物，即得粗提取

液。

水适用于白蛋白类蛋白质的抽提。

如果抽提物的

pH用适当缓冲液控制时，共稳定性及

溶解度均能增加。

如球蛋白类能溶于稀盐溶液中，脂蛋白可用稀的去垢剂溶液如十二烷基硫

酸钠、洋地黄皂苷（

Digitonin）溶液或有机溶剂来抽提。

其它不溶于水的蛋白质通常用稀碱

溶液抽提。

一、蛋白质类别溶解性质的介绍

简单蛋白质：

白蛋白

球蛋白：

溶于水及稀盐、稀酸、稀碱溶液，可被

50%饱和度硫酸铵析出。

真球蛋白：

一般在等电点时不溶于水，但加入少量的盐、酸、碱则可溶解。

拟球蛋白：

溶于水，可为

50%饱和度硫酸铵析出

醇溶蛋白：

溶于

70～

80%乙醇中，不溶于水及无水乙醇

壳蛋白：

在等电点不溶于水，也不溶于稀盐酸，易溶于稀酸、稀碱溶液

精蛋白：

溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀

组蛋白：

溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀

硬蛋白质：

不溶于水、盐、稀酸及稀碱

缀合蛋白：

包括磷蛋白、粘蛋白、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、血红蛋白、金属蛋白、黄素蛋

白和氮苯蛋白等。

此类蛋白质溶解性质随蛋白质与非蛋白质结合部分的不同而异，除脂蛋

白外，一般可溶于稀酸、稀碱及盐溶液中，脂蛋白如脂肪部分露于外，则脂溶性占优势，如

脂肪部分被包围于分子之中，则水溶性占优势。

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[整理日期]：

2003—12—25

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蛋白质提取与制备ProteinExtractionandPreparation

二、蛋白质提取与制备概述

蛋白质的制备是一项十分细致的工作。

涉及物理学、化学和生物学的知识很广。

近年来

虽有了不少改进，但其主要原理仍不外乎两个方面：

一是利用混合物中几个组分分配率的差

别，把它们分配于可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析、有机溶剂提取、层析和

结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同区域而达

到分离的目的，如电泳、超离心、超滤等。

由于蛋白质不能溶化，也不能蒸发，所能分配的

物相只限于固相和液相，并在这两相间互相交替进行分离纯化。

制备方法可按照分子大小、

形状、带电性质及溶解度等主要因素进行分类。

按分子大小和形态分为差速离心、超滤、分

子筛及透析等方法；按溶解度分为盐析、溶剂抽提、分配层析、逆流分配及结晶等方法；按

电荷差异分为电泳、电渗析、等电点沉淀、离子交换层析及吸附层析等；按生物功能专一性

有亲合层析法等。

由于不同生物大分子结构及理化性质不同，分离方法也不一样。

即同一类生物大分子由

于选用材料不同，使用方法差别也很大。

因此很难有一个统一标准的方法对任何蛋白质均可

循用。

因此实验前应进行充分调查研究，查阅有关文献资料，对欲分离提纯物质的物理、化

学及生物学性质先有一定了解，然后再着手进行实验工作。

对于一个未知结构及性质的试样

进行创造性的分离提纯时，更需要经过各种方法比较和摸索，才能找到一些工作规律和获得

预期结果。

其次在分离提纯工作前，常须建立相应的分析鉴定方法，以正确指导整个分离纯

化工作的顺利进行。

高度提纯某一生物大分子，一般要经过多种方法、步骤及不断变换各种

外界条件才能达到目的。

因此，整个实验过程方法的优劣，选择条件效果的好坏，均须通过

分析鉴定来判明。

另一方面，蛋白质常以与其他生物体物质结合形式存在，因此也易与这些物质结合，这

给分离精制带来了困难。

如极微量的金属和糖对巨大蛋白质的稳定性起决定作用，若被除去

则不稳定的蛋白质结晶化的难度也随之增加。

如高峰淀粉酶

A的

Ca2+，胰岛素

Zn2+等。

此

外，高分子蛋白质具有一定的立体构象，相当不稳定，如前所述极易变性、变构，因此限制

了分离精制的方法。

通常是根据具体对象联用各种方法。

为得到天然状态的蛋白质，尽量采

用温和的手段，如中性、低温、避免起泡等，并还要注意防腐。

注意共存成分的影响。

如蝮蛇粗毒的蛋白质水解酶活性很高，在分离纯化中需引起重视。

纯化蝮蛇神经毒素时，当室温超过

20℃时，几乎得不到神经毒素。

蝮蛇毒中的蛋白水解酶

能被

0.1mol/LEDTA完全抑制，因此在进行柱层析前先将粗毒素

0.1mol/LEDTA溶液处理，

即使在室温高于

20℃，仍能很好的得到神经毒素。

整个制备过程一般可分为

5个阶段：

①材料的选择和预处理，②细胞的破碎（有时需进

行细胞器的分离），③提取，④纯化（包括盐析，有机溶剂沉淀，有机溶剂提取、吸附、层

析、超离心及结晶等），⑤浓缩、干燥及保存。

以上

5个阶段不是要求每个方案都完整地具

备，也不是每一阶段截然分开。

不论是哪一阶段使用哪一种方法，均必须在操作中保存生物大分子结构的完整性。

保存

活性防止变性及降解现象的发生。

因空间结构主要依靠氢键、盐键和范德华力的存在，遇酸、

遇碱、高温、剧烈的机械作用及强烈的辐射等均可导致活性丧失。

因此选择的条件应为十分

温和。

同时应注意防止系统中重金属离子、细胞自身酶系及其他有毒物质的污染。

三、蛋白质提取与制备具体操作方法

1、原料的选择

早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。

但至目前经

常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料，

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蛋白质提取与制备ProteinExtractionandPreparation

因而对提取要求更复杂一些。

原料的选择主要依据实验目的定。

从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成

本低的原料。

尽量要新鲜原料。

但有时这几方面不同时具备。

含量丰富但来源困难，或含量

来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。

一般要注意种属

的关系，如鲣的心肌细胞色素

C较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。

要事前调查

制备的难易情况。

若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。

如利用胰蛋白酶水解

蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。

但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属

必须一定。

研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯

.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但

使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。

可能时尽量用全年均可采到的原料。

对

动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。

2、前处理

a、细胞的破碎

材料选定通常要进行处理。

要剔除结缔组织及脂肪组织。

如不能立即进行实验，则应冷

冻保存。

除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先

将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。

不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难

易不一，使用方法也不完全相同。

如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即

可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。

⑴机械方法

主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。

常用器械有：

①高速组织捣碎机（转速可达

10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎；②玻璃匀浆器（用两

个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间

隔只有十分之几毫米，对细胞破碎程度较高速捣碎机高，机械切力对分子破坏较小。

小量的

也可用乳钵与适当的缓冲剂磨碎提取，也可加氧化铝、石英砂及玻璃粉磨细。

但在磨细时局

部往往生热导致变性或

pH显著变化，尤其用玻璃粉和氧化铝时。

磨细剂的吸附也可导致损

失。

⑵物理方法

主要通过各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。

Ⅰ反复冻融法

于冷藏库或干冰反复于零下

15～

20℃使之冻固，然后缓慢地融解，如此反复操作，使大

部分细胞及细胞内颗粒破坏。

由于渗透压的变化，使结合水冻结产生组织的变性，冰片将细

胞膜破碎，使蛋白质可溶化，成为粘稠的浓溶液，但脂蛋白冻结变性。

Ⅱ冷热变替法

将材料投入沸水中，于

90℃左右维持数分钟，立即置于冰浴中使之迅速冷却，绝大部

分细胞被破坏。

Ⅲ超声波法

暴露于

9～

10千周声波或

10～

500千周超声波所产生的机械振动，只要有设备该法方便

且效果也好，但一次处理量较小。

应用超声波处理时应注意避免溶液中气泡的存在。

处理一

些超声波敏感的蛋白质酶时宜慎重。

Ⅳ加压破碎法

加一定气压或水压也可使细胞破碎。

⑶化学及生物化学方法

Ⅰ有机溶媒法

粉碎后的新鲜材料在

0℃以下加入

5～

10倍量的丙酮，迅速搅拌均匀，可破碎细胞膜，

破坏蛋白质与脂质的结合。

蛋白质一般不变性，被脱脂和脱水成为干燥粉末。

用少量乙醚洗，

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蛋白质提取与制备ProteinExtractionandPreparation

经滤纸干燥，如脱氢酶等可保存数月不失去活性。

Ⅱ自溶法

将待破碎的鲜材料在一定

pH和适当的温度下，利用自身的蛋白酶将细胞破坏，使细胞

内含物释放出来。

比较稳定，变性较难，蛋白质不被分解而可溶化。

利用该法可从胰脏制取

羧肽酶。

自体融解时需要时间，需加少量甲苯、氯仿等。

应防止细菌污染。

于温室

30℃左

右较早溶化。

自体融解过程中

PH显著变化，随时要调节

pH。

自溶温度选在

0～

4℃，因自

溶时间较长，不易控制，所以制备活性蛋白质时较少用。

Ⅲ酶法

与前述的自体融法同理，用胰蛋白酶等蛋白酶除去变性蛋白质。

但值得提出的是溶菌酶

处理时，它能水解构成枯草菌等菌体膜的多糖类。

能溶解菌的酶分布很广。

尤其卵白中含量

高，而多易结晶化。

1g菌体加

1～

10mg溶菌酶，

pH6.2～

7.01h内完全溶菌。

于生理食盐水

或

0.2mol蔗糖溶液中溶菌，虽失去细胞膜，但原形质没有脱出。

除溶菌酶外，蜗牛酶及纤

维素酶也常被选为破坏细菌及植物细胞用。

表面活性剂处理

较常用的有十二烷基磺酸钠、氯化十二烷基吡淀及去氧胆酸钠等。

此外一些细胞膜较脆弱的细胞，可把它们置于水或低渗缓冲剂中透析将细胞胀破。

b、细胞器的分离

制备某一种生物大分子需要采用细胞中某一部分的材料，或者为了纯化某一特定细胞器

上的生物大分子，防止其他细胞组分的干扰，细胞破碎后常将细胞内各组分先行分离，对于

制备一些难度较大需求纯度较高的生物大分子是有利的。

尤其近年来分子生物学、分子遗传

学、遗传工程等学科和技术的发展，对分布在各种细胞器上的核酸和蛋白质的研究工作日益

增多，分离各种细胞器上的各类核酸和特异性蛋白质已成为生物大分子制备工作重要内容之

一。

各类生物大分子在细胞内的分布是不同的。

DNA几乎全部集中在细胞核内。

RNA则大

部分分布于细胞质。

各种酶在细胞内分布也有一定位置。

因此制备细胞器上的生物大分子时，

预先须对整个细胞结构和各类生物大分子在细胞内分布匹有所了解。

以肝细胞为例整理如表

1

表

1蛋白质、酶及核酸在肝细胞内分布情况

细胞器名称

主要蛋白质及酶类

核酸类

细胞核

精蛋白、组蛋白、核酸合成酶系

RNA占总量

10%左右

DNA几乎全部

粒线体

电子传递、氯化磷酸化、三羧酸循环、

脂肪酸氧化、氨基酸氧化、脲合成等

酶系

RNA占总量

5%左右

DNA微量

内质网（微粒体）

蛋白质合成酶系、羟化酶系

RNA占总量

50%左右

溶酶体

水解酶系（包括核酸酶、磷酸脂酶、

组织蛋白酶及糖苷及糖苷酶等）

高尔基氏体

糖苷转移酶、粘多糖及类固醇合成酶

系

细胞膜

载体与受体蛋白、特异抗蛋、

ATP酶、

环化腺苷酶、

5’

-核苷酸酶、琥珀酸

脱氢酶、葡萄糖

-6-磷酸酶等

细胞液

嘧啶和嘌呤代谢、氨基酸合成酶系、

可溶性蛋白类

RNA（主要为

tRNA）占总量

30%

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蛋白质提取与制备ProteinExtractionandPreparation

细胞器的分离一般采用差速离心法。

细胞经过破碎后，在适当介质中进行差速离心。

利

用细胞各组分质量大小不同，沉降于离心管内不同区域，分离后即得所需组分。

细胞器的分

离制备、介质的选择十分重要。

最早使用的介质是生理盐水。

因它容易使亚细胞颗粒发生聚

集作用结成块状，沉淀分离效果不理想，现一般改用蔗糖、

Ficoll（一种蔗糖多聚物）或葡

萄糖

-聚乙二醇等高分子溶液。

水溶液提取：

大部分蛋白质均溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中。

因此蛋白质的提取一般以水为主。

稀盐溶液和缓冲溶液对蛋白质稳定性好、溶度大，也是提取蛋白质的最常用溶剂。

盐溶液提取：

以盐溶液及缓冲液提取蛋白质进常注意下面几个因素。

盐浓度

等渗盐溶液尤以

0.02～

0.05mol/L磷酸盐缓冲液和碳酸盐缓冲液常用。

0.15mol/L氯化钠溶液应用也较多。

如

6-磷酸葡萄糖脱氢酶用

0.1mol/L碳酸氢钠

液提取等。

有时为了螯合某些金属离子和解离酶分子与其他杂质的静电结合，也

常使用枸橼酸钠缓冲液和焦磷酸钠缓冲液。

有些蛋白质在低盐浓度下浓度低，如

脱氧核糖核蛋白质需用

1mol/L以上氯化钠液提取。

总之，只要能溶解在水溶液

中而与细胞颗粒结合不太紧密的蛋白质和酶，细胞破碎后选择适当的盐浓度及

PH，一般是不难提取的。

只有某些与细胞颗粒上的脂类物质结合较紧的，需采

用有机溶剂或加入表面活性剂处理等方法提取。

PH值：

蛋白质提取液的

PH值首先应保证在蛋白质稳定的范围内，即选择在偏离等

电点两侧。

如碱性蛋白质则选在偏酸一侧，酸性蛋白质选择偏碱一侧，以增大蛋

白质的溶解度，提高提取效果。

如细胞色素

C属碱性蛋白质，常用稀酸提取，

肌肉甘油醛

-3-磷酸脱氢酶属酸性蛋白质，用稀碱提取。

某些蛋白质或酶与其分

物质结合常以离子键形式存在，选择

PH3～

6范围对于分离提取是有利的。

温度：

多数酶的提取温度在

5℃以下。

少数对温度耐受性较高的蛋白质和酶，可适

当提高温度，使杂蛋白变性分离且也有利于提取和进一步纯化。

如胃蛋白酶等及

许多多肽激素类，选择

37～

50℃条件下提取，效果比低温提取更好。

此外提取酶时加入底物或辅酶，改变酶分子表面电荷分布，也能促进提取效果。

有机溶剂提取：

有机溶剂提取用于提取蛋白质的实例至今是不多的。

但一些和脂结合较牢或

分子中非极性侧链较多的蛋白质，不溶于水、稀盐或稀碱液中，可用不同比例的

有机溶剂提取。

从一些粒线体（

Mitochondria）及微粒体（

Microsome）等含多量脂

质物质中提取蛋白质时，采用

Morton的丁醇法效果较好。

因丁醇使蛋白质的变

性较少，亲脂性强，易透入细胞内部，与水也能溶解

10%，因此具有脂质与水

之间的表面活性作用，可占据蛋白质与脂质的结合点，也阻碍蛋白质与脂质的再

结合，使蛋白质在水中溶解能力大大增加。

丁醇提取法的

pH及温度选择范围较

广（

pH3～

10，温度

-2℃至

40℃）。

国内用该法曾成功地提取了琥珀酸脱氢酶。

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蛋白质提取与制备ProteinExtractionandPreparation

丁醇法对提取碱性磷酸脂酶效果也是十分显著的。

胰岛素既能溶于稀