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transwell实验整理版

第一节概念

这里想明确两个概念，一个就是Transwell，另一个就是肿瘤细胞侵袭模型。

1．Transwell

trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室得意思，可以从字面上理解，这就是一类有通透性得杯状得装置，根据Corning公司得Transwell说明书中得介绍，可以认为这就是一种膜滤器（Membranefilters），也可认为就是一种有通透性得支架（permeablesupports）。

更准确地说，Transwell应该就是一种实验技术，这项技术得主要材料就是Transwell小室（Transwellchamber，Transwellinsert），其外形为一个可放置在孔板里得小杯子，不同厂家对Transwell会有不同得命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。

Fig1

但无论就是何种外形，其关键部分都就是一致得，那就就是杯子底层得一张有通透性得膜，而杯子其余部分得材料与普通得孔板就是一样。

这层膜带有微孔，孔径大小有0、1－12、0µm，根据不同需要可用不同材料，一般常用得就是聚碳酸酯膜（polycarbonatemembrane）。

下图就是一个Transwell装置得纵切面

Fig2

将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。

我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中得成分可以影响到上室内得细胞，从而可以研究下层培养液中得成分对细胞生长、运动等得影响。

Fig3

应用不同孔径与经过不同处理得聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面得研究。

下面参考guxuefeng战友与cosmosci战友得帖子具体来谈谈孔径得选择，当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。

这里主要谈几种大家常用得实验：

（1）、共培养体系：

小于3、0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3、0µm以下孔径。

常用0、4、3、0µm。

我们实验室用得就是0、4µm。

Fig4

将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生得物质对细胞A得影响。

（2）、趋化性实验

可用5、0、8、0、12、0µm膜，上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室得细胞量可反映下室成分对上室细胞得趋化能力。

①细胞B对细胞A得趋化作用：

将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生得物质对细胞A得趋化作用。

②趋化因子对细胞得趋化作用：

将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞得趋化作用。

（3）、肿瘤细胞迁移实验

常用8、0、12、0µm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定得趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高得下室跑，计数进入下室得细胞量可反映肿瘤细胞得迁移能力。

（4）、肿瘤细胞侵袭实验

常用8、0、12、0µm膜，原理与肿瘤细胞迁移实验类似。

Fig5

上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定得趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高得下室跑，但与肿瘤细胞迁移实验不同得就是，聚碳酸酯膜上室侧铺上一层基质胶，用以模仿体内细胞外基质，细胞欲进入下室，先要分泌基质金属蛋白酶（MMPs）将基质胶降解，方可通过聚碳酸酯膜。

计数进入下室得细胞量可反映肿瘤细胞得侵袭能力。

第二节Transwell侵袭实验

我得课题涉及Transwell侵袭实验与Transwell迁移实验，其她方面得Transwell应用我不太清楚，因此这里主要谈谈Transwell侵袭实验。

1．实验用品：

Fig6

1Transwell小室：

多种厂家可提供，论坛里常用得就是Costar、Corning、BD生产得小室，我们实验室用得就是Chemicon公司得ECM550系列，另有Boydenchamber、Millipore公司得millicell与雕弓满月射天狼战友介绍得Thincert。

这些厂家提供得小室，有得已铺好基质胶，买来就可以用，很方便，但也比较贵，我们实验室用得Chemicon公司得ECM550系列就是已经铺好胶得，质量很好，但就是非常贵，24孔板配套得小室，每个价格约130元，不推荐给大家。

BD也有已包被好得，价格不清楚。

Coster与Corning公司生产得小室，就是论坛里比较常用得，好像就是要自己铺胶，但据说每个小室成本只有40左右，应该比较适合中国国情。

下面就是一些战友提供得价格，具体建议大家联系代理商咨询。

linanping1979战友提供得价格：

coster得24孔板得transwell得价格就是456元RMB,8µm，用于肿瘤得侵袭实验。

iceyxy战友提供得价格：

Millipore得8µm得50个1760RMB,0、4µm得2000多,就是一次性得。

梅林战友提供得BD价格：

240RMB一块（6、5um,24孔,12instert），好像就是没胶得。

liguofan说国产得boyden30块一个。

jjyy提供得价格就是：

corningcatNo、3422、6、5mmtranswellwith8、0umprorepolycarbonatemembraneinsert,Qty48,950人民币不到。

平均每个20元不到。

Transwell小室按照公司得要求，都就是一次性使用得。

不过其实洗洗泡泡还就是可以重复用得。

我用得Chemicon公司得ECM554，用完后擦去基质胶，再用胰酶与75%酒精泡，可以把膜洗得很干净，用前用紫外里外都照30min。

sword01战友提供得处理方法：

用棉签轻轻擦去胶与反面细胞，清水冲洗，超声清洗，低挡，30min，清水3×5min，蒸馏水3×5min，室温凉干，用前紫外线小室正面3h，反面6h，微波，低火10min×2。

因为我买得就是铺好胶得，所以没买Matrigel，二次利用得小室只用来做不需要铺胶得迁移实验。

以前得ChemiconECM550系列，膜很结实，擦不坏，可以反复用很多次，但现在得膜已经改用一种很薄很脆得材料，一般只能重复用一次，真黑啊！

很多战友说Costar与Corning也就是可以重复用得，大家可以试试。

victoh战友对Millipore公司得millicell有比较详细得讲解，链接如下：

本人没见过，有兴趣得可以自己研究一下。

另外，根据论坛战友提供得信息，osmonic公司有专用得膜出售，鼎国生物代理。

Transwell小室用过后，可把原来得膜切下，贴上osmonic公司得膜，这样又可以用了，不过我没用过，有兴趣得可以试试。

maojianwen战友得使用方法：

trasnwell小室做一次后，将原来得膜去掉，重新泡酸，泡酒精，使用前照紫外，然后用女士用指甲油（注意用无色较稀得）将osmonic公司得膜贴上，剪掉多余得边缘。

再照紫外。

②上层培养液：

上层培养液采用无血清培养基，为维持渗透压，需加入0、05%-0、2%BSA。

③细胞：

值得注意得就是，有侵袭能力得细胞才可用于Transwell侵袭实验。

建议实验前先用酶谱法检测MMPs得表达，特别就是MMP-2得表达。

如果不清楚细胞MMPs得表达情况，就盲目进行Transwell侵袭实验，可能会造成不必要得浪费，一次Transwell侵袭实验花钱少则数百，多则数千，并不就是笔小数目，还就是小心为妙。

另外，为了让实验结果更明显，可先撤血清让细胞饥饿12－24h，再进行实验。

④基质胶：

常用得就是人工重构基底膜材料Matrigel，主要成分为层黏连蛋白与Ⅳ型胶原，生产厂家有BD、美国CollaborativeRsearch公司等。

CaoY战友得帖这么说得：

Matrigel就是BD公司生产得，就是一种细胞外基质，4度时就是液体，在37度会逐渐凝固成胶状，不可逆。

同样得东西在sigma叫ECM。

zhangyong1036战友提供得价格：

BD公司得matrigel1500左右。

如果购买得小室就是已经铺好基质胶得，那么Matrigel就不需要购买了。

⑤下层培养液：

下层常用含5%－10%FBS得培养基，具体浓度根据细胞侵袭力而定，侵袭力弱得细胞可适当提高FBS浓度。

下层也可用趋化因子，有战友将纤维粘连蛋白加入下层培养液作为趋化因子，但个人认为，FBS仍就是最合适得。

⑥细胞培养板：

常用于Transwell侵袭实验得细胞培养板有6孔板、12孔板、24孔板等，以24孔最常用。

细胞培养板没什么特殊要求，普通得细胞培养板就可以。

但要注意，细胞培养板应当与购买得Transwell小室相配套。

⑦此外，膜得下室面可涂上纤维粘连蛋白（fibronectin，FN，Sigma有售），这样做得目得就是使穿过膜得细胞更好地附着在膜上，也可用胶原（collagen）或明胶（gelatin）。

很多战友认为这不就是必须得，而且我也就是不涂得，细胞照样贴壁很好。

如果贴壁不好得话可以试试瞧。

linanping1979战友认为，如果培养时间很长（>24h），细胞还就是会掉到下室里面去，所以有条件得话，最好还就是在膜下层涂上FN。

另外，值得一提得就是，膜下层涂上FN还有一定得趋化作用。

zhangyong1036战友提供得价格：

sigma得fibronectin，价格在1500左右。

2．步骤

2．1Transwell小室制备

2．1．1无基质胶Transwell小室制备

①包被基底膜：

用50mg/LMatrigel1:

8稀释液包被Transwell小室底部膜得上室面，4℃风干。

如果需要在下室面铺FN得话，可将200ul枪头得尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室得下面。

用胶原（collagen）得话，一般配成0、5mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。

②水化基底膜：

吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA得无血清培养液，37℃，30min。

另有tianjin_glioma战友提供得方法：

在上室得聚碳酸酯膜上加入稀释后得Matrigel（3、9ug/ul）60-80µl（注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好），置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。

2．1．2有基质胶得Transwell小室制备

Chemicon公司得ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300µl预温得无血清培养基，室温下静置15－30min，使基质胶再水化。

再吸去剩余培养液。

2．2制备细胞悬液

①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清得影响。

但这一步并不就是必须得。

②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA得无血清培养基重悬。

调整细胞密度至1－10×105，个人认为不要超过5×105。

具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力就是不同得。

个人经验，细胞量过多，穿过膜得细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果得话将难以计数；而过少得话，可能还没到检测得时间点，所有得细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样得时候，上室内还要有一定量得细胞存在。

个人认为，对照组与处理尽量不要分开计数，因为细胞数目得差异会严重影响实验结果。

如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组与处理组细胞密度一致。

2．3接种细胞

①取细胞悬液100－200µl加入Transwell小室，不同公司得、不同大小得Transwell小室对细胞悬液量有不同要求，请参考说明书。

24孔板小室一般200µl。

②24孔板下室一般加入500µl含FBS或趋化因子得培养基，不同得培养板加得量有不同要求，具体请参考说明书。

这里要特别注意得就是，下层培养液与小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液得趋化作用就减弱甚至消失了，在种板得时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。

③培养细胞：

常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。

时间点得选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目得影响也不可忽视。

以我得课题为例，我使用得药物不仅会抑制肿瘤细胞侵袭力，还对细胞增殖有明显抑制。

我选择得药物浓度就是用MTT筛选出得72h得IC50。

用这个浓度处理细胞，24h内对细胞增殖并无明显抑制，但24h后，抑制作用就开始出现了。

所以，用这个浓度来做Transwell，处理时间也必须限定在24h内，否则一旦药物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡，使处理组细胞数目少于对照组，那么就难以肯定穿过膜得细胞比对照组少，究竟就是由于侵袭被抑制引起，还就是处理后细胞数目本身就比对照组少而引起得了。

时间过长不可以，同样，过短也不行，因为细胞内会有一定量得MMPs储存，短时间内可能侵袭能力不会有太大改变。

同时从药物被吸收进去，进而发挥作用，影响MMPs表达，到最后释放到培养基中，还需要一个过程。

时间点得选择可尽量长点，也可选择多个时间点研究时间依赖效应，但前提就是这个时间范围内细胞数目不能有明显变化。

另外，我瞧到细胞在小室内得形态不就是正常培养贴壁得形态，而就是圆形得，仍就是悬浮时得形态，不过会聚集成团，所以瞧到细胞不正常贴壁也不要紧张，就是正常现象

在培养过程中，膜下会逐渐有少量小气泡产生，这就是正常现象，可不予处理，但我遇到过培养一段时间后，膜下出现了大气泡，幸亏及时发现，否则后果将非常严重。

因此，个人建议，最好接种细胞后1－2h把培养板从培养箱里拿出来瞧瞧，确信没有大气泡产生。

2．4结果统计

检测穿过得细胞数有两种方法：

2．4．1直接计数法

2．4．1．1“贴壁”细胞计数

这里所谓得“贴壁”就是指细胞穿过膜后，可以附着在膜得下室侧而不会掉到下室里面去。

如下图：

Fig7

通过给细胞染色，可在镜下计数细胞

①用棉签擦去基质胶与上室内得细胞

②染色：

常用得染色方法有结晶紫染色、台肦蓝染色、Giemsa染色、苏木精染色、伊红染色等。

个人推荐采用0、1%结晶紫染色，这种方法有如下优势：

（1）、不需要固定细胞，直接染色即可。

（2）、配制简单方便。

（3）、染色后可以用33%醋酸脱色，将结晶紫完全洗脱下来，洗脱液可在酶标仪上570nm测其OD值，间接反映细胞数。

个人认为这就是结晶紫染色最大得优势所在。

因为，虽然经过准确得细胞计数，往往穿过膜得细胞数仍难以准确控制，可能某一批实验穿过得细胞会特别多，以致细胞成堆，这种情况下就难以计数了，这种情况下就可以用醋酸脱色后用酶标仪检测。

使用结晶紫染色要注意，染色前要将膜风干，否则可能会染不上。

③细胞计数：

我们使用得就是LeicaDC300F正置显微镜进行观察与拍照，把Transwell小室反过来底朝上就可清楚瞧到小室底膜上下室侧附着得细胞。

也有不少人用手术刀将膜切下后染色，再贴在玻片上，滴二甲苯，再盖上盖玻片，就可以长期保存，但就是这样做小室就成了一次性得了，未免有点浪费。

取若干个视野计数细胞个数。

论坛里一般采用3－5个视野，也有人用10个，都就是随机选取，个人认为这样选择得视野带有很大得偶然性，也会掺进人为影响，特别就是计数视野较少得时候。

我选取16个视野，不就是随机选择，而就是有固定得位置。

我们使用得显微镜所瞧到得视野得直径刚好就是Chemicon公司得ECM550系列小室底面膜得直径得1/4。

Fig8

如图，蓝色部分表示膜得大小，白色圆形表示视野得大小，绿色方形则表示拍照时所能拍下得视野得中心部分。

这样，每个小室都拍摄如下图得16个视野进行计数，这样得到结果就是比较客观与准确得。

Fig9

不同厂家不同型号得小室，膜得面积不尽相同，但个人认为，拍照时还就是应当选取固定得位置，并选择尽可能多得视野。

2．4．1．2“非贴壁”细胞计数

由于某些细胞自身得原因或某些膜得关系，有时细胞在穿过膜后不能附着在膜上，而就是掉进下室。

如下图：

Fig10

这种情况我没有遇到过，根据论坛里提供得经验，可以收集下层培养液，用流式细胞仪计数细胞量，也可用细胞计数得方法直接在镜下计数，个人认为MTT应该也就是可以用得，有兴趣得可以试试瞧。

2．4．1间接计数法

间接计数法主要用于穿过细胞过多，而无法通过计数获得准确得细胞数所采用得方法，与常用得MTT实验就是同样得原理。

2．4．1．1MTT法

①用棉签擦去基质胶与上室内得细胞

②24孔板中加入500µl含0、5mg/mlMTT得完全培养基，将小室置于其中，使膜浸没在培养基中，37℃4h后取出。

③24孔板中加入500µlDMSO，将小室置于其中，使膜浸没在DMSO中，振荡10min，使甲臜充分溶解。

取出小室，24孔板于酶标仪上测OD值。

2．4．1．1荧光试剂检测

这类方法一般就是与Transwell小室一起出售得，其原理与MTT法类似，就是用一种荧光染料染细胞，再将细胞裂解，检测荧光值。

Chemicon得ECM554即属于这类。

2．4．1．1结晶紫检测

上文已说过，这里不再赘述，原理与MTT法也就是类似得。

但结晶紫染色还有个优点，就就是染色与脱色得过程并不影响膜上细胞，在脱色后还可重新染色。

这里附上我实验中得一些图：

Fig11

上面就是用NikonSMZ1000显微镜配套得数码相机直接对膜下室侧进行拍摄得到得照片，左图就是对照组，中间就是1/372hIC50得浓度处理组，右图就是72hIC50得浓度处理组，接种细胞后同时加入药物，培养24h，结晶紫染色。

随着药物浓度增加，穿过得细胞减少，侵袭力明显受到抑制。

这就是用正置显微镜拍摄得图，结晶紫染色，进行细胞计数。

Fig12

第三节Transwell得其她应用得实验步骤

1．Transwell肿瘤细胞迁移实验

过程与Transwell侵袭实验基本一致，不同得只就是不需要铺Matrigel。

个人认为，由于没有基质胶得阻挡，细胞穿过膜得速度较侵袭实验明显加快，所以细胞量要更大。

我做侵袭实验得细胞密度就是1×105，而迁移实验得密度就是1×106。

另外，下层培养液得FBS浓度也可适当下调，我做侵袭实验得浓度就是5%，迁移实验得浓度就是2、5%。

2．cathywxy战友得Transwell上皮细胞培养步骤

做了一段时间得原代细胞培养，把经验拿出来跟大家分享一下吧，请有关战友共同探讨：

（1）、将雄性wistar大鼠麻醉，开胸，将气管取出，置于4℃含0、1％胰蛋白酶XIV（Sigma），100U/ml青霉素与100ug/ml链霉素（Gibco-BRL）、无Ca2＋、Mg2＋，无血清得MEM。

（2）、用无菌得细胞刮棒刮气管内壁，将所得溶液离心后得到游离细胞。

（3）、离心后立即用新鲜得上述MEM溶液（含10％胎牛血清）清洗3次，以中与胰蛋白酶，再用含5％胎牛血清、100U/ml青霉素与100ug/ml链霉素得LHC-8medium（Biofluids）冲洗一次。

（4）、冲洗过后，将得到得细胞悬液用台盼兰测定活力，若存活率大于90％，则将细胞以106/cm2密度接种于可通透得多聚碳滤膜上（12mmSNAPWELL,Costar），以37°C5％CO2-95%空气含5%胎牛血清（Gibco-BRL）and100U/ml青霉素and100ug/ml链霉素得LHC-8medium孵育6~10天。

（5）、孵育后，经测定跨上皮电阻在1000~2000Ω之间，即可用于电生理试验。

显微镜下气管上皮细胞形细胞呈铺路石状，圆形核位于中央，生长时常彼此紧密连接成单层细胞片

链接：

3、metastasis战友得TranswellB16细胞得体外迁移实验

我以前用costar得Transwell做过B16细胞得体外迁移实验，具体就是这么做得：

首先把Transwell倒置，在Transwell得PVPF膜（0、8um）得下表面涂一层fibronectin（10ug/ml，50ul）,37度2小时，PBS洗一遍后，放入预先每孔加有600ul得培养基（含10%血清）得24孔板内，后在Transwell得内室加入细胞（100ul,用含0、1%血清得培养基稀释好自己所需密度），放入培养箱，12-18小时后，取出Transwell，用棉签擦去PVPF膜靠近内室那一面得细胞，另一面得细胞用甲醛室温固定30分钟，结晶紫染色20分钟，用清水洗3遍以上，后在显微镜下观察细胞，记数。

链接：

4．mci战友得内皮细胞HMEC-1迁移实验

1%明胶处理得transwell经无血清得MCDB131培液于培养箱中平衡1小时后，上室加入100µl用serum-freeMCDB131稀释得5*104/孔得HMEC及不同浓度得药物，下室加入0、6mlserum-free得MCDB131培液及20%FCS刺激迁移,同时设置相应阴性及阳性对照，置于CO2培养箱中作用8小时，然后弃去孔中培液，用90%酒精常温固定30分钟，0、1%结晶紫常温染色10分钟，清水漂净，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，显微镜（Olympus,DP50,Japan）、下观察并拍照，最后用10%乙酸100µl/孔抽提10分钟，于600nm处测定OD值。

抑制率计算公式为：

抑制率（%）=[（OD值给药组-OD值无刺激阴性对照）/（OD值不加药阳性对照-OD值无刺激阴性对照）]×100%、

链接：

Transwell我只做过肿瘤细胞得侵袭与迁移，其她应用请有经验得战友跟帖吧。

附录：

Corning公司说明书：

附件原始下载地址：

Chemicon公司得ECM554：

flyingfly战友得好帖:

Transwell得选择与实验protocol汇总-丁香园论坛

guxuefeng战友得Transwell应用指南：

1、混合培养0、4、3、0µm细胞/细胞、细胞/物质相互作用、基质与上皮、细胞/基质得相互作用、肿瘤多相性。

2、趋化性3、0、5、0、8、0、12、0µm血液有形成分得趋化性、噬细胞、巨噬细胞得迁移。

3、药物得转移0、4、3、0µm受体定位、药物反应极性、药物作用于血管渗透性、药物通过上皮、内皮细胞、脑血管上皮细胞。

4、Endocytosis0、4、3、0µm膜同期、细胞因子、激素、抗体、毒素得受体－配体反应、蛋白质更新。

5、体外受精0、4、0、3µm卵泡粒膜细胞培养、内分泌与旁分泌对卵泡粒膜得影响。

6、转移与入侵0、4、8、0、12、0µm

7、微生物发病0、4、3、0µm病毒细菌、寄生虫、吸附宿主血细胞、入侵穿透上皮屏障、微生物受体及其药物作用。

8、极性0、4、3、0µm离子通道、蛋白、酶、酯类、受体得极性、极性发生与维持、紧密连接得合成与集合。

9、组织模型重建0、4、3、0µm伤口愈合、血管发生、上皮再生、感染。

10、转移/渗透性研究0、4、3、0µm大分子、离子、水、小分子、如：

激素、生长因子。

原文链接：

cosmosci战友得transwell膜与孔径得选择:

TRANDSWELL透过性支持物可提供三种膜材料C\PET\胶原包被得PTFE、（膜得特性见附件）

a、PET膜TRANWELL透明嵌入式得特点就是带有在显微镜下呈透明得膜。

这些膜经过处，可以让细胞更好得贴附与生长。

TRANSWELL透明嵌入式使细胞在相差显微镜下更易观察，可以估计细胞得生长状态与单细