灵芝多糖对前列腺素E2抑制小鼠脾细胞增殖及IL.docx

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灵芝多糖对前列腺素E2抑制小鼠脾细胞增殖及IL

灵芝多糖对前列腺素E2抑制小鼠脾细胞增殖及IL1α,IL2mRNA表达的拮抗作用

【摘要】　【目的】观察灵芝多糖对前列腺素E2抑制小鼠脾细胞增殖及IL1α、IL2mRNA表达的拮抗作用。

【方法】采用混合淋巴细胞培养反应作为实验模型，四甲基偶氮唑盐法检测细胞增殖程度，半定量逆转录聚合酶链反应法检测IL1α及IL2mRNA的表达水平。

【结果】PGE2连续作用48h后，脾细胞增殖反应受到不同程度的抑制作用，当PGE2浓度在10μmol/L以上时差异有显着性意义（P＜）;固定PGE2的浓度为20μmol/L，并合用不同浓度的GLB，当GLB为100mg/L以上浓度时可部分对抗PGE2的抑制作用（P＜）;培养8h及12h后，PGE2可抑制IL1α及IL2mRNA的表达，GLB为100mg/L以上浓度时可部分对抗PGE2的抑制作用。

【结论】灵芝多糖可部分拮抗前列腺素E2对小鼠脾细胞增殖及IL1α和IL2mRNA表达的抑制作用。

【关键词】　灵芝多糖/药　；肿瘤/中药疗法；肿瘤/免疫学；细胞培养

　　灵芝［Ganodermalucidum（LeyssexFr.Karst.）］是灵芝菌科灵芝属真菌。

文献报道［1-3］，灵芝多糖是灵芝中主要的生物活性成分之一，其主要的药理作用为增强免疫功能和抗肿瘤。

目前其抗肿瘤作用的机制尚不清楚。

肿瘤逃避免疫监视的机制比较复杂，其中之一是有些肿瘤细胞能直接分泌［4-5］或刺激巨噬细胞［6］分泌前列腺素E2（PGE2），后者可对免疫系统产生广泛的抑制作用。

藉此，肿瘤得以逃避免疫系统的攻击，在体内无限生长。

本研究观察了灵芝多糖对PGE2抑制小鼠脾细胞增殖及IL1α和IL2mRNA表达的影响，探讨灵芝多糖的抗肿瘤免疫学机理。

现报道如下。

　1材料与方法

　动物C57BL/6j及BALB/c小鼠，8～10周龄，雌雄兼用，购自南方医科大学实验动物中心，合格证号分别为：

2005A044和2005A046。

　药品与试剂RPMI1640培养基；新生牛血清；HEPES；四甲基偶氮唑盐、焦碳酸二乙酯、前列腺素E2均为Sigma产品；RNAoutTM；傻瓜逆转录反应体系［AccuPowerRTPreMix，内含逆转录酶、脱氧核苷三磷酸（dNTPs）、RNA酶抑制剂、缓冲剂等］,傻瓜聚合酶链反应体系均购自赛百盛公司；OligodT18（TaKaRa产品）；琼脂糖；溴化乙锭（EB,上海博彩生物工程公司产品）；GLB参照文献方法［7］提取，为多糖组分，呈浅棕色，易溶于水，分子量7000～9000D。

其他化学试剂均为分析纯。

　仪器311型CO2培养箱；AB120型电子分析天平；连续波长酶标仪；CS15R台式低温高速离心机；PTC100TMPCR循环仪；PowerPAL3000电泳仪；凝胶成像分析系统（法国EtsVILBERLOURMAT公司）。

　方法

　混合淋巴细胞培养参照文献［8］进行。

　MTT法检测细胞增殖程度参照文献［8］进行。

结果用570nm处的光密度（D570）值表示。

　总RNA提取根据试剂盒说明书所提供的方案按比例缩小进行操作。

于96孔板中，每孔加RNAoutTM试剂40μＬ，每组收集10孔裂解液于ＬEppendorf管中，提取总RNA。

　逆转录反应DEPC处理水配制的OligodT18（10nmol/L）与DEPC处理水配制的总ＲＮＡ按体积比1∶1混合于Eppendorf管中，70℃孵育5min，４℃冷却２min。

吸取上述混合液20μL加入AccuPowerRTPreMix管中，振荡混匀，加石蜡油15μL，1000r/min离心3s，置PCR循环仪中反应。

反应参数42℃、60min，94℃、5min。

　PCR扩增PCR引物采用在线Primer3进行设计。

小鼠IL1α：

上游引物5’GCATCCTCACAGCAGGATTT3’，下游引物5’GAATCCAGGGGAAACACTGA3’，PCR扩增产物为354bp。

小鼠IL2：

上游引物5’AAGCTCTACAGCGGAAGCAC3’，下游引物5’TCATCGAATTGGCACTCAAA3’，PCR扩增产物为348bp。

小鼠βactin：

上游引物5’CCAGAGCAAGAGAGGTATCC3’，下游引物5’GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA3’，PCR扩增产物为216bp。

经预实验发现IL1α和IL2mRNA的表达丰度约为βactin的1/5左右，为了使被检测基因的扩增速率与βactin的扩增速率基本一致，均处于指数扩增范围从而防止平台效应，在进行βactin基因扩增时，将逆转录第1链cDNA产物稀释5倍，其他条件与被检测基因相同，操作在PCRPreMix管中加入消毒双蒸水8μL,被检测基因mRNA逆转录产物2μL或内参βactinmRNA逆转录产物经5倍稀释后2μL，相应的上、下游引物各5μL（15pmol），振荡混匀，加石蜡油15μL，1000r/min离心3s，置PCR循环仪中反应。

反应参数94℃预变性,然后进入以下28个循环：

94℃变性45s，57℃退火1min，72℃延伸。

循环完毕，72℃延伸5min。

　半定量分析取被检测基因和βactinRTPCR扩增产物上样于20g/L琼脂糖凝胶梳孔中，采用倍Tris硼酸电泳缓冲液，在3V/cm电压条件下电泳50min。

将凝胶转移至凝胶分析系统暗箱中，在紫外线照射下测定PCR扩增产物的荧光强度（I）值。

结果表示为：

p=［I检测基因/］×100%。

　学方法采用统计软件进行统计分析。

混合淋巴细胞培养反应数据的显着性差异采用独立样本t检验；PCR半定量数据采用配对样本t检验。

　2结果

　PGE2对混合淋巴细胞培养反应抑制作用的造模浓度将C57BL/6j及BALB/c小鼠脾细胞按体积比1∶1混合作为MLR模型，PGE2连续作用48h后，小鼠脾细胞增殖受到不同程度的抑制作用，浓度在10μmol/L以上时差异有显着性意义（P＜）。

根据表1结果，选择PGE2抑制模型的造模浓度为20μmol/L。

　　　GLB拮抗PGE2对MLR中脾细胞增殖的抑制作用在MLR中，固定PGE2的浓度为20μmol/L，再加入不同浓度的GLB，观察GLB对PGE2的拮抗作用。

培养48h后，当GLB为100mg/L以上浓度时可部分对抗PGE2的抑制作用（P＜），但不能恢复至正常水平，结果见表2。

　GLB对PGE2抑制MLR中脾细胞IL1αmRNA表达的拮抗作用培养8h后，GLB可明显促进IL1αmRNA的表达，而PGE2抑制IL1αmRNA的表达。

两者合用，GLB为100、200mg/L的浓度时均可部分对抗PGE2对IL1αmRNA表达的抑制作用，结果见1、表3。

　GLB对PGE2抑制MLR中脾细胞IL2mRNA表达的拮抗作用培养12h后，GLB同样可以促进IL2mRNA的表达，而PGE2产生抑制作用，结果两者合用，GLB也可部分对抗PGE2对IL2mRNA表达的抑制作用，结果见图2、表4。

表1PGE2对MLR中小鼠脾细胞增殖的抑制作用方法：

t检验；①P＜，与阴性对照组比较表2GLB拮抗PGE2对MLR中脾细胞增殖的抑制作用统计方法：

t检验；①P＜,与阴性对照组比较；②P＜，与PGE2组比较表3GLB对PGE2抑制MLR中脾细胞IL1αmRNA表达的拮抗作用统计方法：

t检验；①P＜，②P＜，与阴性对照组比较；③P＜，④P＜，与PGE2组比较表4GLB对PGE2抑制MLR中脾细胞IL2mRNA表达的拮抗作用统计方法：

t检验；①P＜，②P＜，与阴性对照组比较；③P＜，与PGE2组比较

　　3讨论

肿瘤发生　的机制十分复杂，其中有些肿瘤能释放出一些可溶性免疫抑制因子，降低宿主免疫力，从而逃避免疫系统的监视。

PGE2是众多免疫抑制因子中最重要的一种，合成PGE2的限速酶是环氧化酶2（COX2）,许多良性癌前病变和恶性肿瘤中均有COX2基因的扩增及其蛋白的高表达,如结直肠腺瘤和腺癌、胃肠上皮化生和胃癌、食管癌、慢性肝炎和肝细胞肿瘤、胰腺癌、口腔黏膜白斑和头颈部肿瘤、腺瘤样不典型增生和非小细胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、宫颈癌、光化性角化病和皮肤癌、胶质瘤等［9-10］。

有些肿瘤除了本身合成和释放PGE2以外，还刺激宿主巨噬细胞产生PGE2［6］。

可见，产生PGE2抑制宿主的免疫功能，从而逃避免疫系统的攻击是众多肿瘤得以无限生长的重要机理之一。

PGE2对免疫系统的抑制作用广泛而深重，如抑制白介素1［11］和白介素2［12］的产生等。

在特异性免疫反应中，巨噬细胞在呈递抗原的同时，合成和释放IL1，IL1再作用于T辅助细胞产生IL2，后者产生广泛的免疫调节作用，包括促进前体细胞毒T细胞的活化，并分化为具有杀伤活性的效应细胞毒T细胞（Tc），Tc在肿瘤免疫中发挥重要作用。

混合淋巴细胞培养反应是同种异型抗原诱发的特异性免疫反应模型，具有特异性免疫应答的一般特征，实验操作简单、方便，得到的结果具有较好的指导意义。

本研究结果显示PGE2可抑制MLR中小鼠脾细胞的增殖，抑制IL1α和IL2mRNA的表达，这些结果与以往采用其他模型的研究结果相一致［11-12］，说明本研究的模型是可靠的。

灵芝多糖的免疫增强作用和抗肿瘤作用已得到广泛的研究和证实，但其抗肿瘤作用机制尚不十分清楚。

本研究发现GLB在100mg/L以上时可部分对抗PGE2对小鼠脾细胞增殖和IL1α、IL2mRNA表达的抑制作用（P＜），提示灵芝多糖对产生PGE2的肿瘤进行辅助治疗具有一定的意义，也提示灵芝多糖拮抗PGE2的免疫抑制作用可能是其抗肿瘤作用的免疫学机制之一。

【参考　文献】

　　［1］LiMC,LiangDS,XuZM,etal.EffectsofGanoderma（Ganodermalucidum）polysaccharideonPKAactivityofmurineperitonealmacrophages［J］.ChineseTraditionalandHerbalDrugs（中草药）,2000,31（5）:

353.

　　［2］NingAH,CaoJ,HuangM,etal.Observationontheimmuneindexandinhibitionfunctionofganodermapolysaccharidestomicetumor［J］.CancerResearchandClinic（肿瘤研究与临床）,2004,16（3）:

147.

　　［3］ZhaoSH，YaoWS，PangXS，etal.Isolation，purification，characterizationandantitumoractivitiesofGanodermaLucidumpolysaccharide［J］.ChineseJournalofBiochemicalPharmaceutics（中国生化药物杂志）,2003,24（4）:

173.

　　［4］YeF,WuJ,DunnT,etal.Inhibitionofcyclooxygenase2activityinheadandneckcancercellsbygenistn［J］.CancerLett,2004,211

（1）:

39.

　　［5］MitsuhashiM,LiuJ,CaoS,etal.Regulationofinterleukin12geneexpressionanditsantitumoractivitiesbyprostaglandinE2derivedfrommammarycarcinomas［J］.JLeukocBiol,2004,76

（2）:

322.

　　［6］TrejoYG,BordenaveRH,BeviacquaM,etal.InvitrosecretionofcytokinesandprostaglandinE2bymonocytesfromlungcancerpatients［J］.RespirMed,2001,95（4）:

243.

　　［7］LiRZ,HeYQ.　The　relationbetweenantiagingmechanismandtheactiveconstituentsofGanodermalucidum:

Studyofthechemistryandstructureactivityrelationshipofganodermapolysaccharides［J］.JournalofBjingMedicalUniversity,1991,23（6）:

473.

　　［8］SunLS,LeiLS,FangFZ,etal.Inhibitoryeffectsofkoumineonsplenocyteproliferationandhumoralimmuneresponseinmice［J］.PharmacologyandClinicsofChineseMateriaMedica（中药药理与临床）,1999,15（6）:

10.

　　［9］DannenbergAJ,AltorkiNK,BoyleJO,etal.Cyclooxygenase2:

apharmacologicaltargetforthepreventionofcancer［J］.LancetOncol,2001,2（9）:

544.

　　［10］HoweLR,DannenbergAJ.Aroleforcyclooxygenase2inhibitorsinthepreventionandtreatmentofcancer［J］.SeminOncol,2002,29（3Suppl11）:

111.

　　［11］FunakiN,AriiS,AdachiY,etal.EffectofPGE2oninterleukin-1andsuperoxidereleasefromprimaryculturedhumanhepaticmacrophages［J］.LifeSci,1992,51（17）:

1339.

　　［12］EmondV,FortierMA,MurphyBD,etal.ProstaglandinE2regulatesbothinterleukin-2andgranulocytemacrophagecolonystimulatingfactorgeneexpressioninbovinelymphocytes［J］.BiolReprod,1998,58

（1）:

143.