细胞因子检测.docx

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细胞因子检测

细胞因子是由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而合成、分泌的一类生物活性物质分泌的蛋白质,在体内广泛参与免疫调节及炎症反应、组织修复、刺激造血系统、刺激细胞的增殖与凋亡等重要生理活动,在抵抗外来病原及维持机体内环境平衡中均起重要作用。

某些刺激因子也可导致一些细胞因子超量表达,或表达减少,从而参与疾病的发病及病理过程。

1、免疫学检测法其基本原理是将细胞因子作为抗原进行定量检测。

如免疫斑点法、ELISA法、RIA法和免疫印迹法等均已用于细胞因子的检测。

2.、生物学测定法其原理是根据细胞因子对特定的依赖性细胞株（即靶细胞）的促增殖作用,以增殖细胞中的DNA的合成或酶活性为指标,间接推算出细胞因子的活性单位,如对IL-1、IL-2等细胞因子活性的检测。

亦可根据某些细胞因子对特定靶细胞的杀伤效应或对病毒的抑制作用进行测定,如对肿瘤坏死因子及干扰素的生物活性测定。

3、分子生物学测定法目前采用的技术有各种印迹法、斑点杂交、原位杂交和PCR等。

通过检测细胞内细胞因子的基因组成或mRNA量,推算出细胞因子的合成量。

一、IL-1的检测（生物活性测定）

产生IL-1的细胞种类很多,其中最主要的为单核-巨噬细胞。

IL-1可分为IL-1α（也称酸性IL-1,pI=和IL-1β（中性IL-1,pI=。

两者的分子量和生物活性相似,只能用抗体检测方法才能区别,常用的生物学测定法对两者都适用。

IL-1的生物学活性广泛,其检测方法亦较多,包括有小鼠胸腺细胞增殖法、D10G细胞增殖法及L929细胞增殖法等。

IL-1反应细胞增殖可以通过活性染料染色,显微镜直接计数,3H-TdR或125I-UdR的DNA掺入量或以活性细胞代谢率为指标来表示。

本试验介绍L929细胞增殖MTT比色法。

（一）IL-1的诱生

体外试验可用LPS等有丝分裂原诱导单核-巨噬细胞产生IL-1,或用P388D1（鼠）,THP-1（人）细胞株制备IL-1。

本试验以小鼠巨噬细胞制备IL-1。

1、取6～10周龄BALB/c或C57BL/6小鼠,雌雄均可,拉颈处死后用酒精消毒。

2、用带9号针头的5ml注射器腹腔注入5ml冷的含5％小牛血清的Hanks液（5％NBS-HBSS）,轻揉腹部吸出腹腔液体（内含腹腔细胞）,反复抽吸几次。

3、1500r/min离心8min,洗细胞2次。

4、将腹腔细胞用含10％小牛血清的RPMI-1640液（10％NBS-RPMI-1640）配成2×106/ml,加到24孔平底培养板,1ml/孔,置5％CO2,37℃温箱孵育2h。

5、每孔用5％NBS-HBSS洗3次,弃去未粘附细胞,贴壁细胞为巨噬细胞单层。

6、将LPS（10μg/ml）加入巨噬细胞单层,每孔1ml,培养4h；加入10％NBS-16401ml继续培养至48h,收集上清液,置-20℃冰箱保存,待测IL-1活性及含量。

（二）L929细胞增殖MTT比色法

MTT比色分析法的原理是利用四甲基偶氮唑盐[3--2,5-diphenyltetrazoliumbromide,MTT）在活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶作用下,被还原成兰黑色的MTT-甲,形成MTT-甲的量与细胞增殖程度呈正相关。

故通过测定细胞形成MTT-甲量,可间接定量分析细胞的增殖情况,具体步骤如下:

1、将生长成单层的L929细胞用％胰酶消化2～3min。

除去消化液后,用10%FCS的RPMI-1640将L929细胞配成1×105/ml,加入96孔细胞培养板中,每孔100μl。

2、取100μl不同稀释度的IL-1标准品和待测品,分别加入各孔中,每孔设3个复孔,置37℃,5%CO2温箱孵育56h。

3、用PBS溶解MTT为5mg/ml,用μm膜滤器除菌及杂质。

4、上述培养体系取出后,每孔加入10μlMTT（5mg/ml）,37℃继续培养4h。

5、从每孔吸出100μl上清弃去,加酸化异丙醇或加DMSO100μl/孔,充分混匀以溶解底物。

酸性条件使培养液中酚红指示剂变为黄色,以利于对MTT-甲转化物的测定。

6、将微量测定板置室温数分钟,保证转变的底物结晶被溶解。

7、用酶标光度计以检测波长为570nm,参考波长为630nm分别测量OD值。

测定应在酸化异丙醇加入后1h内完成。

OD570nm－OD630nm,再减去培养液对照的OD值。

8、用IL-1标准品各稀释度IL-1含量（X）和各稀释度对应的OD值（Y）作直线回归,按上述概率单位分析法计算待测样品IL-2的活性单位（u/ml）。

（三）注意事项

1、IL-1诱生剂的浓度,培养条件和细胞浓度对结果均有明显影响,应进行预试验以确定最佳实验条件。

2、培养器皿和研磨条件：

24孔培养板培养细胞活率较高,但生长稍慢。

玻璃瓶培养有时会因玻璃质量和清洗不净引起细胞死亡,故应注意采取相应措施。

大量培养时用大容量瓶比较方便,可减少操作中的污染。

研磨组织可用玻璃匀浆器、不锈钢网。

二、TNF的检测（免疫学测定法,双抗体ELISA夹心法）

（一）原理选用两种针对rHuTNF-α分子不同表位的单克隆抗体,一种单克隆抗体作为包被抗体,另一种单克隆抗体作为酶标抗体,如果待测样品中含有TNF-α,则形成抗体-TNF-α-酶标抗体复合物,通过酶催化底物显色,亦可根据标准品OD值绘制标准曲线,从标准曲线上查出待检标本中TNF-α的含量。

（二）材料和试剂

1、包被抗体:

使用时用包被缓冲液作适当稀释。

2、酶标抗体:

使用时用稀释液作适当稀释。

3、标准品:

rHuTNF-α（10ng/ml）,使用时用稀释液作倍比稀释。

4、阴性对照液（未免疫鼠Ig）。

5、ABTS底物:

2,2'-Azino-bis-（3-ehtylbenzthiozoline6-sulfonicacid）,2,2'-连氮基-双（3-乙基苯并噻吡咯呆-6磺酸）。

6、96孔ELISA板。

7、L,PBS:

配其它液体用。

8、包被缓冲液:

L,Na2CO3-NaHCO3缓冲液。

9、洗涤液:

％Tween20-PBS。

10、稀释液:

4％PEG-洗涤液（用于稀释标准品和酶标抗体）。

11、底物缓冲液:

L,柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液。

12、3％H2O2。

13、血清、枸缘酸盐或EDTA抗酸血浆、其它体液及细胞培养上清均可检测,后者应作适当稀释。

14、ELISA读数仪等。

（三）操作步骤

1、包被将稀释好的包被抗体加入ELISA板,100μl/孔,4％放置24h或48h。

2、加待检标本洗涤液冲洗ELISA板3次,加待测样品、阴性对照及倍比稀释的标准品,100μl/孔,37％,1h.标准品稀释方法:

取标准品150μl（10ng/ml）倍比稀释7个浓度:

5ng/ml、ml、ml、625pg/ml、312pg/ml、156pg/ml和78pg/ml。

3、加酶标抗体:

洗板3次,加入稀释好的酶标抗体,100μl/孔,37℃,1h。

4、显色:

洗板3次,加入配好的ABTS显色液,100μl/孔,室温或37℃显色15～30min。

5、ELISA读数仪测410nm处OD值,绘制标准曲线。

6、从标准曲线查得待测样品中的TNF-α含量。

四、注意事项

1、血清或血浆中残存凝块或红细胞须经离心去除,勿用溶血或脂肪过多的血清。

2、标本在2～8℃可储存3天,超过3天应放入-20℃或-70℃,避免反复冻融.

3、分别用加样器头吸取各份标本,避免相互交叉。

4、叠氮钠（NaN3）对辣根过氧化物酶（HRP）有灭活作用,在本实验系统中应避免使用。

5、底物显色液必须临用时配制,双氧水应放置在2～8℃,保存6个月以内。

附:

试剂配制

1.L,PBS

KH2PO4

Na2HPO4·12H2O

NaCl

KCl

双蒸水加至100ml

2.包被缓冲液

Na2CO3

NaHCO3

双蒸水加至1000ml

3.洗涤液

PBS1000ml

Tween20

4.稀释液

洗涤液100ml

鸡蛋清

PEG（聚乙二醇,MW6000）

NaCl

5.底物缓冲液

Na2HPO4·12H2O

拧檬酸

双蒸水加至100ml

6.ABS显色液

ABTS5mg

底物缓冲液10ml

3％H2O220μl

三、IL-2的检测（基因的检测）

细胞因子基因的检测包括对其DNA的检测和mRNA表达的检测,常用的方法有Southern印迹,斑点印迹,PCR,原位杂交及原位PCR等,Northern印迹及RT-PCR。

本文介绍IL-2mRNA的测定（斑点杂交法）。

将RNA变性后直接点样于硝酸纤维膜上,可用手工操作点样,也可用斑点式点样器点样,再与特异性探针进行杂交。

本法可用于基因组中特定基因及其表达产物的定性及半定量分析。

由于其操作比Northern印迹简单、迅速,所需样品量少,且可在同一张膜上同时进行多个样品的检测,故很适合于临床应用。

亦可用于DNA的检测。

但其缺点是不能鉴定所测基因的分子量。

（一）主要试剂

1.RNA提取试剂:

TRIZOL试剂（Gibcol,,DEPC水（Fluka,

2.质粒提取试剂盒:

（Promega:

WizardMiniprepsDNA,

3.DNA片段提取试剂盒:

（LaJolla）

4.地高辛标记和检测试剂盒:

（BoerhingerMannheim,

5.IL-2DNA探针

6.其他试剂

（1）STE溶液LNaCl

10mmol/L

1mmol/LEDTA

（2）溶液Ⅰ50mmol/L葡萄糖

25mmol/L（pH

10mmol/LEDTA（pH

可配100ml,高压灭菌15min,贮存于4℃

（3）溶液ⅡLNaOH（临用前用10mol/L贮存液稀释）

1%SDS（配20%贮存液）

盖紧瓶盖,颠倒离心瓶数次,以充分混匀内容物.于室温放置5～10min

（4）溶液Ⅲ5mol/L乙酸钾60ml

冰乙酸

水

所配成的溶液对钾是3mol/L,对乙酸根是5mol/L

（5）含相应抗生素的LB培养基

（6）氯霉素2ml）--->终浓度170μg/ml

（7）溶菌酶（10mg/ml,溶于10mmol/L1ml

（8）无水乙醇（部分-20℃预冷）.异丙醇.75%乙醇（部分4℃预冷）

（9）TE缓冲液

（10）5mol/LLiCl

（11）RNA酶,RPMI-1640,胎牛血清（FCS）,ConA（刀豆蛋白A）等

（12）500μl含13%（W/V）聚乙二醇（PEG800）的LNaCl

（13）3mol/LNaAc、饱和酚、氯仿:

异戊醇（24:

1）

（二）主要仪器

CO2培养箱:

美国FormaScientific产品;

无菌操作台:

苏州净化设备公司产品;

图象处理分析仪:

同济医大太阳公司产品;

低温高速离心机:

上海离心机械研究所.

（三）IL-2质粒DNA探针的大量制备

1、含IL-2质粒DNA探针的提取

取含IL-2质粒DNA的单个菌落置两个25mlLB培养基（含100μg/mlAmp）

↓37℃220r/min振摇过夜（约16h）

取10ml菌液加200mlLB培养液（含100μg/mlAmp）

↓37℃150r/min振摇4h

加氯霉素（终浓度170μg/ml）

↓37℃220r/min振摇3h

菌液倒入300ml离心管中离心

↓4℃5000r/min×10min离心弃上清除去残液（吸水纸无菌）

每管加40mlSTE溶液（冰预冷）悬浮细菌后,用移液管转入到50ml离心管中

↓4℃5000r×15min离心

弃上清,加5ml溶液Ⅰ（冰预冷）悬浮细菌,加1ml新配制的溶菌酶（10mg/ml）

↓轻摇,室温静置5min

加10ml溶液Ⅱ,盖上盖子,将离心管小心颠倒数次混匀液体,不要用旋涡振荡器

↓冰浴10min,且勿摇动

加溶液Ⅲ（冰预冷）,轻振荡离心管数次使之混合

↓冰浴20～30min,使沉淀完全,4℃12000r/min×20min离心

取上清到另一50ml离心管中,加体积异丙醇,混匀,室温静置15min

↓室温5000r/min×15min离心弃上清

用75%乙醇洗涤沉淀一次（不将沉淀悬浮）,倒出乙醇,倒置吸水纸上,使乙醇挥发

用将沉淀溶解,加等体积冰预冷的5MLiCl,混匀后置冰浴10min

↓4℃12000r/min×10min离心

取上清至新EP管,加等体积的异丙醇（约3ml）,充分混匀,室温静置15min

↓室温12000rmin×10min离心（回收沉淀的核酸）

小心去上清,将管倒置以使最后残留的液滴流尽,用75%乙醇洗涤沉淀,流尽乙醇,用吸纸吸去附于管壁的液滴,将管倒置在纸巾上数分钟,以使最后残余的痕量乙醇蒸发

用500μlTE溶解DNA沉淀,移至新EP管中,加入RNA酶（终浓度100μg/ml）

↓37℃水浴30min

加等体积（500μl）含13%（W/V）PEG（800）的LNaCl,充分混合

↓4℃12000r/min×5min离心

吸去上清,用400μlTE溶解质粒DNA沉淀

加等体积饱和酚（400μl）混合

↓12000r/min×10min离心

吸上层水相移至另一EP管,加入等体积酚:

氯仿:

异戊醇（25:

24:

1）剧烈混匀呈乳白状

↓12000r/min×10min离心

吸上层水相移至另一EP管,加等体积氯仿:

异戊醇（24:

1）混匀

↓12000r/min×10min离心

吸上层水相移至新EP管（硅化）,加入体积的3mol/LNaAc和2体积的-20℃预冷的无水乙醇,混匀（可见沉淀出现）,置-20℃2h或0℃20min

↓4℃12000r/min×15min离心

弃上清,加75%乙醇（4℃预冷）200μl,稍加振荡,离心洗涤2次

↓4℃12000r/min×5min离心去上清

敞开管口,将管置于实验桌上直到最后可见的痕量乙醇蒸发殆尽

溶沉淀于11μlTE溶液中

↓↓

取1μl电泳其余进行酶切

2.、经％琼脂凝胶电泳,确定有质粒DNA后,用XhoI进行酶切。

酶切反应体系:

质粒DNA10μl

XhoI6μl

10*Buffer（H）6μl

DW38μl

-----------------------

总体积60μl37℃消化过夜

3.用WizardTMPCR纯化试剂盒回收IL-2DNA片段

1）将60μl酶切反应体系经1%琼脂糖凝胶电泳

2）紫外灯下切下IL-2DNA片段,挑出凝胶到EP管中,加1mlResin使凝胶溶化

3）用5ml一次性注射器将Resin/DNAmix转移到WizardTMMinicolumn中,用2ml80%异丙醇洗涤Minicolum,12000g离心20s,加50μlDW到Minicolumn中,12000g离心20s,收集DNA。

（四）用DNA标记和检测试剂盒对IL-2探针进行地高辛标记地高辛是一种仅存在于洋地黄类物质花叶中的类固醇半抗原,又称异羟基洋地黄毒甙配基,地高辛精可以通过一个11个碳原子的连接臂与尿嘧啶核苷酸嘧啶环上的第5组碳原子相连接形成地高辛精标记的尿嘧啶核苷酸,BoehringerMannheim公司出售的地高辛精标记核苷酸有dig-UTP,dig-dUTP,和dig-ddUTP,它们分别适用于RNA探针,DNA探针和寡核苷酸探针的标记。

地高辛精标记核苷酸主要通过酶反应标记核酸探针,用标记探针做原位杂交,杂交体用特异性抗地高辛精抗体通过免疫组化技术检测。

在适宜的标记反应条件下,一般每20～25个核苷酸中带有一个标记的核苷酸。

这一标记密度最利于半抗原与碱性磷酸酶标记的抗地高辛精之间的反应。

因为一个标记抗体大约复盖20个核苷酸。

BoehringerMannheim公司生产的地高辛精DNA标记试剂盒和地高辛检测试剂盒在分子杂交中的应用愈来愈广泛。

现介绍地高辛标记cDNA探针随机引物延伸法。

1.、将DNA（1μg～3μg）加热95℃（或100℃）10min,随即在冰/NaCl中骤冷。

DNA充分变性对探针标记十分重要。

5μl对照DNA作为对照。

2、将离心管置于冰上,按顺序加入下列试剂:

①1μg～3μg新鲜变性DNA;②2μl六聚核苷混合物（试剂5）;③2μldNTP混合物（试剂6）,加入蒸馏水使总体积达到19μl,再加入1μlKlenow聚合酶。

3、离心片刻后,将离心管置37℃恒温箱内孵育60min。

延长孵育时间可长达20h,可使标记量增加。

4、加入2μlLEDTA）终止酶反应。

5、加入μl4mol/LLiCl和75μl预冷（-20℃）的乙醇,混匀置-70℃30min或-20℃2h,使标记探针沉淀。

6、离心（16500r/min）,弃上清液,用50μl70％冷乙醇轻洗沉淀物。

7、将沉淀物置于真空干燥仪内干燥后,溶解于50μlTE缓冲液,-20℃冰箱保存。

（五）培养细胞RNA的提取（采用Trizol试剂盒提取RNA）

1、收集培养细胞,用RPMI-1640培养液离心洗涤3次,第二次离心洗涤时用RPMI-1640培养液调整细胞数至5×106～1×107细胞。

2、最后一次洗涤时吸1ml细胞悬液至管中,在台式离心机离心,弃上清,加入1mlTRIZOL试剂,用移液器轻轻吹打细胞数次,充分混匀,室温（15～30℃）静置5min后,加入氯仿,快速摇动15s,室温静置2～3min。

3、于2～8℃离心14600r/min×15min,上层无色水相（RNA溶于此层中）约占整个细胞匀浆液的60％。

4、小心吸取其中400μｌ移至另一Eppendorf管中,加入异丙醇,轻柔混匀,室温静置5～10min后。

5、于2～8℃离心14600r／min×10min,在管壁下底处可见一乳白色小沉淀块,即为RNA。

弃上清。

6.用冰冷的75％乙醇1ml洗RNA沉淀（不用吹打沉淀）,然后于2～8℃,11500r/min离心5min,去除上层乙醇后于无菌环境（或真空）风干RNA沉淀,但不要使沉淀过于干燥,以免影响RNA的溶解,用20μlDEPC处理的双蒸水溶解RNA沉淀。

置-80℃冰箱备用。

（六）RNA的斑点杂交

1、RNA变性：

20μlRNA溶液（2μgRNA）

4μl20×SSC

14μl37%甲醛（formaldehyde）

40μl100%甲酰胺

------------------------------------

60℃温育30min,水浴冷却样品

在上述RNA液体中每100μl液中加210μl20×SSC（共310μl）,每孔加150μl。

2、纤维素膜处理过程：

硝酸纤维素膜（μm）水中浸泡５min,再用20×SSC室温浸泡１h。

3、滤器的处理及点样：

用NaOH浸泡（洗）多孔过滤加样器,再用灭菌水彻底冲液。

将纤维素膜压在多孔加样器的上层板的上面,再压在下层板上,赶去气泡,然后两部分夹紧,点样前,先用20×SSC（200μl）洗一遍每个孔,真空抽吸干净后,再分别点样。

如有未点样孔须用150μl的20×SSC封住其孔,然后用真空泵抽吸干净,再用20×SSC清洗一次,待流体滤过纤维膜后,继续抽吸５min以干燥滤膜。

4、取出膜,80℃烤2～3h,膜保存于-20℃

配20×SSC标准柠檬酸盐pH

NaCl

（柠檬酸钠）

H2O至1000ml

用10NNaOHor10NHCl调pH至,高压消毒

1NNaOH约

5、杂交

（1）预杂交

1）预杂交液：

5×SSC,%（W/V）封闭剂,%（W/V）N-lauroylsarcodine,%（W/V）SDS

2）先将预杂交液热至60℃。

3）将带有目的RNA的硝酸纤维素膜放入稍宽于滤膜的塑料袋,加入预杂交液,按每100cm2滤膜加20ml。

4）尽可能除净袋中的空气,用热封口器封住袋口,将其置60℃水浴过夜,其间不断翻动塑料袋。

（2）杂交

1）杂交液（DIGEasyHyb（20ml/100cm2）预温轻振荡30min

2）将标记探针DNA（5～25ng/ml）煮沸变性5min,迅速置冰水中冷却,

3）加入到预温的DIGEasyHyb100cm2）中混合,避免形成汽泡

4）然后每张膜上注入预杂交液和滴加探针/DIGEasyHyb

5）振荡孵育至少6h,在微量DNA时,建议16h,使其杂交。

6）2×SSC,％SDS清洗2次,每次5min,室温。

7）68℃振荡条件下,×SSC,％SDS清洗2次,每次15min。

（七）免疫测定

1、杂交后彻底清洗,将膜置入清洗缓冲液中1～5min。

2.、100ml封闭缓冲液（1×）中封闭30min。

3、抗地高辛-AP复合物（75mU/ml）用封闭缓冲液（1×）1∶10000稀释,

4、稀释的抗体溶液20ml与膜孵育30min。

5、100ml清洗缓冲液中2次,每次15min。

6、20ml测定缓冲液中平衡2～5min。

7、将膜置入新鲜制备的20ml显色液中孵育5min（暗处,即避光）,显色过程中避免振动。

8、数分钟显色沉淀开始形成,16h后反应完全,可短期在亮处观察显色情况

9、如果可见期望的斑点,加TE缓冲液50ml作用5min终止显色（缓冲液4）。

（八）图象分析结果用MPIAS-500多煤体彩色图文分析系统,以μm图查点长,在×105μm2测量窗下测得各斑点的积分光密度值,以标准参数作图查得各样本的数值或将各组积分光密度值进行比较。

（九）注意事项

核酸探针的标记及杂交是一个很复杂的过程,步骤多耗时长,影响因素多。

要想获得理想结果,每一步都应严格操作。

1、严格操作标记和杂交的各种溶液应高压灭菌;含SDS,Tween20的溶液应经滤膜除菌后加入其它溶液;使用灭菌吸头、干净平皿,每次用前必须严格清洗。

操作膜时戴无尘手套;只用无齿镊操作膜的边缘。

原位杂交的每步反应均应加盖硅化的盖玻片

2、标记反应注意事项

（1）随机引物标记前必须将探针变性:

100℃沸水浴10分钟后,迅即插入冰中,缺口平移则不需变性。

（2）DNA片段必须小于10Kb。

大于10KB的DNA序列则需要酶切。

最小能为随机法标记的片段是52bp,一般探针长度以大于100bp为好。

（3）随机法标记过夜能够获得较高的标记产量。

3、转膜

（1）中和:

尤其是计划使用硝纤膜时,凝胶中和后需查一下pH值,pH值应小于,否则会导致膜变黄和破坏。

尼龙膜可以承受更高的pH值。

（2）转移:

最好选用尼龙膜（带正电荷）。

处理膜时绝对小心,不能将指痕印在膜上,只能用无齿镊夹取边角位置。

（3）固定:

转膜后的DNA必须固定才能用于杂交。

方法有二,其一是紫外光照射;其二是120℃烘烤30分钟（尼龙膜）或180℃真空烘烤2小时（硝纤膜）。

相比之下,照射更为简便。

4、探针浓度探针浓度是非常重要的因素,应予高度重视。

浓度过高会增加背景,浓度过低又会导致敏感性下降。

应通过模拟杂交试验来确定最佳浓度。

5、可用β-actin作为内参考对照。