碳粉廓清法.docx
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碳粉廓清法
第五篇有关免疫调节剂筛选及评估机体免疫状态的实验
第一章检测非特异免疫功能的实验
第一节小白鼠碳粉廓清试验
基本原理
静脉注射一定大小的颗粒物质，迅速被肝、脾等器官内网状内皮细胞吞噬而使其在血浆
浓度降低，因此可从其廓清率了解整个单核巨噬细胞系统的吞噬功能。
材料和仪器
印度墨汁
0.1%Na2CO3溶液
毛细滴管
72分光光度计
操作步骤
1．体重18一22g小白鼠，雌雄各半，随机分为实验组与对照组。
2．每鼠尾静脉注射印度墨汁0.05ml/kg体重，于l（t1）和5（t5）分钟后分别从眼眶
静脉取血20ul，加到2ml、0.1%Na2CO3溶液中摇匀；
3．
用72型分光光度计在
680mm下比色,测光密度（以下分别用
OD1和OD5来表示l
分钟和5
分钟所取血样的光密度）；
4．
按下式计算廓清指数
K值：
LogOD1－logOD5
LogOD1/OD5
廓清指数K=
=
T5-t1
4
K值经体重及肝脾重换算后．得吞噬指数α值：
吞噬指数α＝体重／肝脾重×3k
以X±ＳＤ来表示给药组与对照组的k值和α值，进行组间t检验，比较差异的显
著性。
注意事项
1.印度墨汁应用生理盐水稀释l一5倍左右。
最好经超声处理后离心，弃出沉淀物，以免凝集的碳粒阻塞肺毛细血管，引起动物致死。
2.尾静脉注射要熟练，取血时间也可延长至10分钟，但必须准确无误。
参考文献
刘辉2000研究生免疫学教程大连大连出版社258-259
（张璐刘辉）
第二节小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬试验
基本原理
通过定量地观察巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬情况，反映小鼠巨噬细胞的吞噬能力。
材料和仪器
5％鸡红细胞生理盐水悬液
37℃孵箱
固定液：
1:
1丙酮－甲醇溶液
染色液：
4％（V／V）Glemsa一磷酸缓冲液
垫有湿纱布的搪瓷盒
操作步骤
1取体重18一22g的健康小白鼠．随机分成给药组试验组、阴性对照组和阳性对
照组。
2每鼠腹腔注射5％鸡红细胞生理盐水悬液0.5ml。
38-12小时后,颈推脱臼处死小鼠；正中剪开腹壁皮肤，经腹膜注入生理盐水2m1，
轻轻按揉鼠腹部1分种，然后吸出腹腔洗液lml，分滴于两片载玻片上，放人垫有湿纱布
的搪瓷盒内，移置37℃孵箱温育30分钟。
4以生理盐水漂洗，以除去未粘片的细胞，晾干。
5
1:
1丙酮－甲醇溶液固定5分钟。
6
4％（V／V）Glemsa一磷酸缓冲液染色
3分钟，用流水冲洗，晾干。
7
结果判定：
油镜下计数巨噬细胞，每片
200个按下式计算吞噬百分率和吞噬指数。
吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数
吞噬百分率＝
×100%
200个巨噬细胞（吞及未吞噬的）
被吞噬的鸡红细胞
吞噬指数＝÷2
２００个巨噬细胞
在计数时，应同时观察鸡红细胞被消化的程度，借以判定巨噬细胞吞噬和消化功能．通
常分为4级：
Ｉ级：
未消化。
被吞噬的鸡红细胞完整，胞质浅红或浅黄绿色，胞核浅紫红色。
II级；轻度消化。
胞质浅黄绿色，胞核固缩呈紫蓝色。
III级：
重度消化。
胞质淡染，胞核呈浅灰黄色。
IV级：
完全消化。
巨噬细胞内仅见形态类似鸡红细胞大小的空泡，边缘整齐．胞核隐
约可见。
注意事项
1.实验过程中应注意无菌操作。
2.若筛选免疫抑制药，预先可用巨噬细胞诱导剂，在实验前3—4天，腹腔注射0.5％淀粉
生理盐水溶液，每鼠0.5ml。
免疫增强剂多可激活小鼠腹腔巨噬细胞，并增强其吞噬功
能一般不再使用巨噬细胞诱导剂。
3.若滴片染色过深，可用1％HCI脱色；过浅则可复染。
4.每鼠两片的计数应基本一致，若差距过大，应予淘汰。
由小鼠腹腔吸出的液体为出血性渗出液时，不宜使用。
5.必要时用低渗法溶解胞外红细胞，这样容易鉴别细胞内外的鸡红细胞。
6.本法简便．但难于测定吞噬速率及其动力学改变，而且费时。
参考文献
1.巴德年1998当代免疫学技术与应用．北京：
北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，261－263
（张璐刘辉）
第三节溶菌酶测定法（光学法）
基本原理
体液或分泌物中溶菌酶活性可以通过检查其对指定敏感菌株的裂解作用来进行测定，将
检品与菌液混合，用分光光度计观察指定时间内透光度改变的百分数反映溶菌酶的活性。
材料与仪器
菌种；溶壁微球菌（MicrococusLysodeilicus）是从空气中分离出的一种革兰氏阳性球菌，
菌落呈黄色，普通培养基上生长良好，１
个月传代１次或冻干成菌种保存。
PH6.4,1/15M
磷酸盐缓冲盐水（ＰＢＳ）
：
①1/15M
磷酸二氢钾溶液：
磷酸二氢钾
9.04g,，加蒸馏水至
1000ml。
②1/15M
磷酸氢二钠溶液：
磷酸氢二钠·
2H2O11.87g，加蒸馏水至
1000ml。
③PH6.4,1/15MPBS：
1/15M
磷酸二氢钾溶液
73ml,1/15M
磷酸氢二钠溶液
27ml，氯
化钠
0.5g
混匀，溶解即成。
溶菌酶标准品：
结晶纯品。
5N氢氧化钾：
氢氧化钾
56g加蒸馏水至
200ml。
分光光度计
操作步骤
1.菌液制备：
将溶壁微球菌接种于普通琼脂斜面上，
37℃培养
24一
36小时．用
PH6.4、
1/15MPBS洗下，配成混悬菌液。
用分光光度计波长
640nm测定，并调整其浓度达到
透光率３０—
40％。
2.溶菌酶标准液：
称取溶菌酶标准纯品，用PH6.4、l／15MPBS配成1000ug/ml原液，放冰箱保存。
临用时再稀释成100、50、25及10ug／ml标准液。
3.
检品应根据估计溶菌酶含量作适当稀释．取适当稀释（或不稀释）检品
0.2ml放小试管
内。
置37℃水浴箱预热5分钟，再向管内加人预热的菌液
1.8ml混匀，立即记下开始
时间，至2分钟时加入
1滴5N氢氧化钾停止反应，立即将菌液倒入比色杯内．
用640nm
滤光板，0.5cm比色杯测其透光率T1%。
4.
另取同样浓度的检品
0.2ml．先加入1滴5N
氢氧化钾摇匀，在
37℃预热５分钟，再
加入1.8ml经37℃预热的菌液，在同样温度下
2分钟后同法测定其透光率Ｔ
0。
T１／一
Ｔ0％为透光率差值，即溶菌酶所致透光率的变化，从标准曲线上可查得检品中溶菌酶含量。
5.计算：
以0.2ml各种浓度的溶菌酶标准液代替检品，操作步骤与待检品相同。
以不同浓
度标准液测得的透光率差值为纵坐标（对数坐标），溶菌酶浓度为横坐标，在半对数纸上绘制标准曲线。
按检品的T％（2分钟的读数减去零时的读数）查出其对数，由标准
曲线上查出稀释的检品中溶菌酶的含量，乘以稀释倍数，即为检品中溶菌酶的含量。
注意事项
溶菌酶是一种小分子蛋白质，存在于机体的泪液、唾液、痰、鼻涕、白细胞和血清等。
测定它在体液或分泌物中的含量及其变动情况，可作为侧面了解机体防御功能一个指标。
在
选择标本及评价其意义时应予以注意。
参考文献
刘辉2000研究生免疫学教程大连大连出版社260－261
（张璐刘辉）
第四节溶菌酶测定法（平板法）
基本原理
体液或分泌物中溶菌酶活性可以通过检查其对指定敏感菌株的裂解作用来进行测定，在
混有菌液的琼脂疑胶上打孔，将检品放在孔内，一定时间后测定溶菌环的直径。
可反映溶菌
酶的活性。
材料与仪器
菌种：
溶壁微球菌（MicrococusLysodeilicus）是从空气中分离出的一种革兰氏阳性球菌，
菌落呈黄色，普通培养基上生长良好，１个月传代１次或冻干成菌种保存。
PH6.4,1/15M
磷酸盐缓冲盐水（ＰＢＳ）
①1/15M
磷酸二氢钾溶液：
磷酸二氢钾
9.04g,，加蒸馏水至
1000ml。
②1/15M
磷酸氢二钠溶液：
磷酸氢二钠·
2H2O11.87g，加蒸馏水至
1000ml。
③PH6.4,1/15MPBS：
1/15M
磷酸二氢钾溶液
73ml,1/15M
磷酸氢二钠溶液
27ml，氯
化钠
0.5g
混匀，溶解即成。
溶菌酶标准品：
结晶纯品。
普通琼脂培养基
操作步骤
1.
菌液制备：
将溶壁微球菌接种于普通琼脂斜面上，37℃培养24一36小时．用PH6.4、
1/15MPBS洗下，配成混悬菌液。
用72型分光光度计波长640nm测定，并调整其浓度
达到透光率３０—
40％。
2.溶菌酶标准液：
称取溶菌酶标准纯品，用PH6.4、l／15MPBS配成1000ug/ml原液，放冰箱保存。
临用时再稀释成100、50、25及10ug／ml标准液。
3.加热融化1.2%琼脂粉，待冷却至60-70℃时将溶壁微球菌混入摇匀，使其浓度为1mg/ml，
立即倾入已夹好的两玻片中（厚度为4mm）。
4.
待琼脂凝固后，以15mm间隔，用打孔器穿钻2.5mm直径小孔，每孔中加入
20ul检样
品，并在同一板上加上不同浓度的标准溶菌酶样品，置
24-26℃，12-18
小时，用测微
尺测溶菌环的直径。
5.
用半对数纸（以溶菌酶浓度为纵坐标，即对数坐标，溶菌环直径为横坐标）
绘制标准曲
线。
从线上查出每毫升样品所含溶菌酶的
ug数。
注意事项
在缺乏培养细菌的条件下也可使用干菌粉，
将溶壁微球菌
24小时培养物用
60倍体积蒸馏水
洗下，离心沉淀弃上清液，沉积的菌体加约
5倍体积的丙酮，用玻棒搅匀，放冰箱内
30分
钟、取出离心沉淀弃上清液。
按此法用丙酮浸洗
3次，再用乙醚洗
2次，将菌体放于燥器内
过夜，即得干菌粉。
用乳体研碎备用，使用时称干菌粉
500mg，放人上述磷酸缓冲液约
50ml，
如上调整菌液浓度约
30一
40%.
参考文献
刘辉
2000
研究生免疫学教程
大连
大连出版社
260－261
（张璐
刘辉）
第二章检测特异性免疫功能的实验
第一节血清溶血素测定
基本原理
经绵羊红细胞（
SRBC）免疫动物的淋巴细胞可产生抗
SRBC
抗体（溶血素）。
并释放
至外周血。
这种抗体在试管内与
SRBC
温育．在补体参与下可产生溶血反应．
免疫动物血清
中溶血素的含量可以通过溶血过程中释放的血红蛋白来测出。
材料与仪器
SRBC保存液（Alsever液）；葡萄糖2.05g，氯化钠0.42g，柠檬酸钠0.8g，蒸溜
水100ml，无菌过滤（Ｇ５漏斗）或8磅10分钟灭菌后备用。
都氏试剂（测血红蛋白用）；碳酸氢钠1.0g，高铁氰化钾0.2g，氰化钾0.05g，蒸
馏水1000ml。
补体：
新鲜豚鼠（至少3只）混合血清经SRBC（10:
1）于4℃吸收30分钟后置-20
℃以下备用。
SRBC：
在无菌条件下，自健康成年绵羊外颈静脉取血，置血液于有玻璃珠的三角
烧瓶中轻摇10分钟以除去纤维蛋白，加人2倍量的保存液，置4℃冰箱备用。
临
用时用生理盐水洗涤3次，经2000rpm10分钟得压积红细胞，再按所需浓度稀释。
操作步骤
1.免疫；小鼠腹腔注射20％SRBC0.2ml／天，免疫后第4天去眼球或腹动脉取血，分离
血清，将血清稀释（一般
500倍以上）后供测定。
2.
溶血反应：
反应管内依次加人经稀释的血清
lml，5％SRBC0.5ml，10％补体lml．置
3.
37℃恒温水浴中保温
30分钟，然后移至冰浴中终止反应，
1500rpm离心5分钟，取血
清液lml加都氏试剂
3ml，摇匀放置10分钟，于540nm波长比色读取吸光度。
4.SRBC半数溶血值：
取５％SRBC0.25ml加都氏液至4ml，比色读取吸光度值，即为实验中所用SRBC半数溶血时的吸光度值。
5.计算：
样品管中数溶血值CH50按下式计算：
每只鼠的血清样品的吸光度值
×稀释倍数
CH50=SRBC半数溶血时的吸光度值
注意事项
免疫用SRBC浓度可根据不同品系小鼠的敏感度和试验药物的作用强度作调整。
参考文献
刘辉2000研究生免疫学教程大连大连出版社261－262
（张璐刘辉）
第二节抗体形成细胞测定
基本原理
将经SRBC免疫的小鼠脾细胞、SRBC（靶细胞）及补体一起混合于琼脂内，抗体形成
细胞分泌的抗体在补体参与下；使其周围的SRBC溶解形成肉眼可见的溶血空斑，这种溶血
空斑数大体上可以反映抗体形成细胞数。
材料与仪器
SRBC保存液（Alsever液）；葡萄糖2.05g，氯化钠0.42g，柠檬酸钠0.8g，蒸溜水100ml，无菌过滤（Ｇ５漏斗）或8磅10分钟灭菌后备用。
SRBC：
在无菌条件下，自健康成年绵羊外颈静脉取血，置血液于有玻璃珠的三角
烧瓶中轻摇10分钟以除去纤维蛋白，加人2倍量的保存液，置4℃冰箱备用。
临用时用生理盐水洗涤3次，经2000rpm10分钟得压积红细胞，再按所需浓度稀释。
100目尼龙网纱布
Hank's液（见附录）
琼脂粉
0.4%台盼蓝
生理盐水
补体：
新鲜豚鼠（至少3只）混合血清经SRBC（10:
1）于4℃吸收30分钟后置-20
℃以下备用。
戊二醛
37℃温箱等
操作步骤
1.免疫：
用20％SRBC0.2ml／只腹腔注射免疫小鼠。
免疫后第4天处死供实验。
2.制备脾细胞悬液：
脱颈处死经SRBC免疫的小鼠，立即剖取脾脏，在冰浴中，将脾置于
100目尼龙网纱布上，加少许
Hank's液，轻轻挤压出脾细胞。
细胞计数时用
0.4%台盼
蓝染色观察活细胞应在
90％以上。
将脾细胞悬液配成
107个／ml
浓度。
3.制备琼脂底层；平皿中加人用Hank’s液配成的溶化的1．4％琼脂2—3ml制备琼脂底层。
4.加样：
取脾细胞悬液和5％SRBC各0.lml及原补体0.05ml混合加入保温于45℃水浴
的含0.4％琼脂糖0.8ml的试管中，摇匀后倒人平皿，旋转平皿使混合物均匀平铺于底
层琼脂上，凝固后将平皿装人温盒并置37℃温箱中孵育3—4小时后计数PFC。
如需保
存，可加入生理盐水或
PBS配制的
0.25％戊二醛
6ml
加以固定。
5.计算：
以每
106个脾细胞或整个脾脏所含的
PFC数表示结果。
注意事项
PFC代表抗体产生细胞的数量，PFC的面积代表抗体的活性，讨论试验意义时应予以注
意。
参考文献
巴德年1998，当代免疫学技术与应用．北京：
北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，
207～208
（张璐刘辉）
第三节特异性淋巴细胞转化试验
基本原理
先用抗原刺激机体，再用该抗原在体外刺激有关淋巴细胞，通过观察淋巴细胞转化情况
评定机体的免疫功能。
材料和仪器
反应细胞：
取自体内免疫后小鼠淋巴结的
T细胞
抗原：
1mg/ml
抗原溶于
PBS
辅助细胞：
经照射或丝裂霉素
C处理后同系小鼠脾细胞（或非
–T脾细胞）
Freunds完全佐剂
96孔圆底或平底细胞培养板
3H-标记甲基胸腺嘧啶
100%乙醇
闪烁液
多孔收集器
玻璃纤维滤纸
液体闪烁计数仪
液闪管等
【操作步骤】
⒈免疫小鼠：
制备抗原水溶液与Freunds完全佐剂的混悬液。
若为引起淋巴结细胞的免
疫应答，可经足垫免疫；若主要引起脾细胞免疫应答，可经腹腔免疫。
皮下免疫后再经尾静
脉免疫也是一条有效的免疫途径。
细胞抗原可经腹腔免疫。
需免疫2-3周才可进行体外试验。
⒉将抗原做4倍或10倍稀释，每孔加入30ul蛋白质抗原。
对照孔加入30ul培养基。
⒊无菌取免疫后小鼠淋巴结和未免疫同系小鼠淋巴结，制成细胞悬液，并计数。
⒋每孔加入100ul反应细胞。
反应细胞最好为纯化后T细胞，否则可能会因非抗原特
异细胞的增殖反应使对照值增高。
若使用未分离的淋巴结细胞，
每孔可加入
1-2×106
细胞。
⒌每孔加入100ul5×106辅助细胞。
⒍37℃，5%CO培养
2
4-5
天。
结束培养前
6-18h
每孔加入
0.5-1.0
μCi[
3H]-胸腺嘧啶。
⒎用细胞收集器将细胞收集在滤纸上，反复（至少10次）充吸培养孔，以保证DNA
3
留在滤纸上，而未掺入的[H]胸腺嘧啶被完全除去。
100%乙醇处理以助于滤纸干燥。
或静
置过夜。
⒏将干燥的滤纸片加入液闪瓶，每瓶含5ml闪烁液。
⒐液闪仪计数cpm值。
注意事项
⒈多数情况下，1×106/ml细胞浓度对多数刺激能产生良好的增殖反应。
否则需预先
滴定出合适的细胞浓度。
当细胞浓度低时，改用96孔圆底培养板能提高增殖反应。
⒉细胞在培养前应具有良好的活力。
⒊[3H]-胸腺嘧啶掺入时间长，会提高实验的重复性。
每批实验时，应固定掺入时间和
掺入量。
参考文献
叶应妩1997全国临床检验操作规程南京：
东南大学出版社379-381
（张璐刘辉）
第三章有关免疫实验的动物模型
第一节免疫功能低下动物模型
基本原理
利用淋巴细胞敏感的细胞毒药物抑制或杀伤淋巴细胞，使机体免疫功能低下。
试剂与器材
环磷酰胺
氢化可的松
操作步骤
方法一：
健康小鼠，每鼠皮下注射环磷酰胺：
80－100mg/kg，5天后免疫功能显著
降低。
方法二：
健康小鼠，每鼠每天皮下注射氢化可的松：
50－100mg/kg，6－8天后免
疫功能显著受抑。
注意事项
1.必须设对照组，随机分配。
在用免疫功能障碍的动模型时，亦应加设正常动物对照组，以检验模型是否成功。
2.由于免疫反应与基因类型有关，应尽可能采用纯系动物，并控制鼠龄、性别和体重，以减少个体差异。
参考文献
余传霖1998，现代医学免疫学．上海：
上海医科大学出版社，1202－1214
（张璐刘辉）
第二节大鼠同种被动皮肤过敏反应
基本原理
将致敏大鼠的血清（内含丰富的lgE抗体）皮内注射于正常大鼠腹壁或背部，每点形成一皮丘。
IgE与局部皮肤肥大细胞的FC受体结合，使之被动致敏。
当抗原攻击时，引起局
部肥大细胞释放过敏介质，从而使局部血管的通透性增加，注入伊文思蓝，可渗出于皮丘内，形成一个蓝斑。
根据蓝斑范围或深浅程度，判定血管通透性变化，以反映皮肤过敏反应的程度。
试剂与仪器
天花粉
4％氢氧化铝
5％伊文思蓝溶液（内含天花粉
1mg）
操作步骤
1.
抗血清制备：
取体重90—100g
混悬液，给大鼠4个足跖注射各
健康大鼠，天花粉以4％氢氧化铝凝胶配成5mg／ml的
0.lml，共0.4ml。
于致敏后10－14天，处死动物采血，
血经低速离心，分离血清，置冰箱备用。
2.被动皮肤致敏及抗原攻击：
另取体重150～200g健康大鼠，在乙醚麻醉下剪去背部的毛，
将稀释的抗血清（稀释度可在I：
20一1：
80）皮内注射于鼠背部，每一稀释度注射二
点。
每点0.lml，至少注射两个稀释度。
48小时后进行抗原攻击，静脉注射lml、0.5％
伊文思蓝溶液（内含天花粉1mg）。
20分钟后断头处死动物，翻转背部皮肤，测定蓝色
反应斑的直径大小。
注意事项
1.本法是抗I型变态反应药物常用的筛选方法，方法简便，筛选的结果与临床效果基本吻合。
2.注意假阳性的发生，有些药物可以降低血管通透性，也能得到阳性结果，但不一定影响过敏反应，应予排除。
3.为使结果更加客观，可剪下蓝斑皮肤，每点以
5ml丙酮生理盐水溶液
（3:
7V／V），浸泡
48小时，离心，取出上清液，以
590nm测定光密度。
PCA抑制百分率可用下式计算：
抑制百分率＝
对照组蓝斑直径或光密度一用药组蓝斑直径或光密度
×100%
对照组蓝斑直径或光密度
参考文献
刘辉
2000
研究生免疫学教程
大连
大连出版社
266－267
（张璐
刘辉）
第三节Ⅱ型变态反应动物模型
基本原理
经绵羊红细胞（SRBC）免疫动物的淋巴细胞可产生抗SRBC抗体（溶血素）。
将这种
抗体注射于正常动物的皮内组织，在补体参与下，可引起皮肤血管炎，使血管通透性增加。
皮肤血管炎反应轻重可以通过血管通透性来反映。
亦称Forssmam皮肤血管炎反应。
试剂与仪器
SRBC保存液（Alsever液）；葡萄糖2.05g，氯化钠0.42g，
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