微生物实验操作10页.docx
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微生物实验操作10页
油镜的使用和维护
目的:
掌握油镜的使用与维护,熟悉油镜的使用原理。
材料:
显微镜,拭镜纸,液体石蜡油,二甲苯
原理:
油镜的透镜极小,工作焦距最短,光线通过玻璃和空气,由于介质密度不同发生折射,射入镜筒的光线极少,视野暗,物象不清晰。
如在玻片与镜头(透镜)之间加上折光率和玻片(n=1.52)相近的香柏油(n=1.515)就可减少光线的折射,加强视野的亮度,获得清晰的物象。
步骤:
显微镜油镜的使用和维护
1.将显微镜平稳地安放在实验台适宜处。
识别油镜头:
标有100×、OIL、HI等字样。
2.打开电源,用低倍镜对光,打开光圈,调节聚光镜的位置,使视野光线充足。
3.标本上加镜油一滴,转动粗螺旋,使油镜头缓缓下降,用眼从侧面观察,直到油镜头浸入油中接近玻片为止。
4.从目镜观察,同时徐徐转动粗螺旋提升,见模糊物象后再用细螺旋调节,直到见到清晰物象为止。
5.观察完毕,粗螺旋提高镜头,取下标本片,油镜头使用后立即用擦镜纸擦净镜头上的油。
如油已干,可在擦镜纸上滴少许二甲苯擦拭,并立即用另一擦镜纸擦去二甲苯,因二甲苯能溶解镜头上的固定胶以致使镜头脱落。
6.将镜头转呈“八”字,调低聚光器,对号送入柜子内存放。
革兰染色
目的:
掌握革兰染色的原理及操作。
材料:
干净玻片,接种环,葡萄球菌和大肠杆菌18-24h培养后的混合菌液,酒精灯,一套革兰染液
原理:
主要为细胞壁结构的差异。
G+三维肽聚糖结构的交联度大,通透性低,脂质少或无,酒精作用使孔径缩小;而G-肽聚糖为二维疏松结构,薄,外膜含大量脂质,易被酒精溶解,使细胞壁通透性增高,结晶紫-碘复合物被酒精溶解而脱色。
步骤:
1.细菌标本的制作
(1)涂片:
无菌操作。
取一接种环混合细菌悬液,涂布成直径约1cm的涂片,涂片应薄而均匀。
(2)干燥:
涂片最好在室温中自然干燥。
必要时可将标本面向上,放在酒精灯上方微火处干燥。
(3)固定:
标本面向上,在酒精灯火焰外焰按钟摆的速度来回通过3次,放置待冷后染色。
固定的目的是杀死细菌,使细菌与玻片黏附较牢固。
菌体蛋白质变性后,提高与染料的亲和力。
2.革兰染色
(1)初染:
滴加结晶紫染液1-2滴于涂片上,1min钟后用自来水缓缓冲洗。
(2)媒染:
滴加碘液1-2滴,1min后用自来水缓缓冲洗。
(3)脱色:
加95%酒精数滴,摆动玻片使酒精与细菌充分接触,约20-30s后,立即用自来水缓缓冲洗。
(4)复染:
滴加稀释碳酸品红液,30-60s后,自来水缓缓冲洗。
用吸水纸吸干后,用油镜观察。
镜检后,载片放入消毒缸。
细菌特殊结构的观察
目的:
观察并掌握细菌的形态及特殊结构。
材料:
细菌鞭毛、芽孢、荚膜的标本片;革兰阳性菌、革兰阴性菌染色标本片
示教:
革兰阳性菌:
葡萄球菌,紫色
革兰阴性菌:
大肠杆菌,红色
细菌鞭毛
细菌芽孢
细菌荚膜
细菌的分布
目的:
了解细菌在自然界中的分布情况。
材料:
普通琼脂平板培养基、血平板、镊子、无菌棉拭子、革兰染液。
操作步骤:
1.空气中细菌的检查
(1)采用沉降法:
取普通琼脂平板培养基1只,任意置一处,启盖约15分钟,再盖上,37oC培养24小时,观察有无细菌生长。
(2)结果判定:
培养基表面可见多种大小、形态不一的菌落。
2.皮肤表面细茵检查
(1)采用涂抹法:
先在平板底面用记号笔分成两区,作标记,将未消毒的手指在平板的1/2处表面轻轻涂抹划线,然后用碘酒、乙醇擦拭手指皮肤,用消毒后的手指在平板另一1/2处进行涂抹,操作完毕,置37℃培养24小时后,取出观察结果。
(2)结果判定:
培养基表面有几种大小及形态不同的菌落生长,注意比较消毒前后细菌的生长情况。
3.咽喉部细茵检查
(1)用无菌棉拭子在咽喉部涂抹后,涂在血平板上,并划线分离,37oC培养24小时后观察结果。
注意观察平板上菌落种类以及是否有溶血现象,并可挑取菌落进行革兰染色检查。
口腔微生物检查也可用无菌牙签直接挑取少量牙垢,制成涂片,进行革兰染色检查。
(2)结果判定:
血平板表面有大小和形态不同的菌落,有的菌落周围可见溶血环。
牙垢涂片镜检可见革兰阳性菌和革兰阴性菌。
紫外线杀菌实验
目的:
掌握紫外线杀菌的原理,熟悉紫外线杀菌实验的操作。
材料:
大肠杆菌,琼脂平板,无菌回形状纸片,接种环,镊子,紫外灯.
原理:
紫外线波长范围为240~280nm,最适的波长为260nm,这与DNA吸收光谱范围相一致。
其杀菌原理是紫外线易被核蛋白吸收,使DNA的同一条螺旋体上相邻的碱基形成胸腺嘧啶二聚体,从而干拢DNA的复制,导致细菌死亡或变异。
紫外线特点:
紫外线的穿透能力弱,不能通过普通玻璃、尘埃。
步骤:
1.平板密集划线接种。
2.在平板上贴无菌回形纸片。
3.UV照射30min(打开平板盖子)。
4.取出回形纸,将回形纸放入消毒缸中。
5.37oC培养24h后观察结果。
细菌代谢产物观察和生长现象
目的:
掌握细菌代谢产物的检测和结果的判断。
熟悉细菌在各种培养基中的生长现象。
材料:
各种生化管,大肠杆菌、伤寒杆菌、产气杆菌、变形杆菌等。
原理:
不同菌的酶系统不同,对底物的代谢产物也不同,用生化的实验方法可将产物检测出来,从而对细菌鉴定。
步骤:
一、细菌代谢产物观察
1.糖发酵实验
将大肠杆菌、伤寒杆菌分别接种在葡萄糖发酵管内,37℃培养18-24h进行观察。
培养基中指示剂为溴甲酚紫。
如能分解葡萄糖,则产酸,培养基由原来的紫色变为黄色,记录符合为“+”。
如同时还产生气体,则其中倒置的小管中有气泡出现,记录符合为“⊕”。
如能分解乳糖,则产酸,培养基由原来的紫色变为黄色,记录符合为“+”。
如同时还产生气体,则其中倒置的小管中有气泡出现,记录符合为“⊕”。
如培养基未变色,仍为紫色,则表明细菌不能分解乳糖不能分解乳糖。
记录符合“-”。
2.枸橼酸盐利用实验
该培养基中提供的唯一碳源是枸橼酸钠。
指示剂是澳麝香草酚兰。
分别接种大肠杆菌和产气杆菌,37℃培养24h进行观察.
若斜面有菌落出现,培养基由原来的绿色变为深兰色,表明细菌能利用枸橼酸钠,记录符合“+”,反之“-”。
3.靛基质吲哚产生实验
能产生色氨酸酶的细菌,可分解蛋白胨水培养基中的色氨酸,产生靛基质。
将大肠杆菌和产气杆菌分别接种在蛋白胨水培养基中,37℃培养48h后,每管各加吲哚试剂(对二甲基氨基苯甲醛)3-4滴,若出现红色化合物-玫瑰色吲哚,表明靛基质产生阳性“+”;反之为阴性:
“-”。
4.硫化氢产生实验
有的细菌能分解含硫氨基酸(胱氨酸、半胱氨酸)产生硫化氢。
将大肠杆菌和变形杆菌分别接种在这样的培养基中,37℃培养18-24h。
若培养基中出现黑色沉淀物即为阳性“+”,表明产生的硫化氢与培养基中的铅盐(或铁盐)结合,生成黑色的硫化铅(或硫化铁)。
二、细菌生长现象
1、在液体培养基上生长情况
(1)表面生长:
液体清晰,细菌生长在液面形成菌膜。
如枯草杆菌。
(2)混浊生长:
液体均匀混浊,或有少量沉淀。
如大肠埃希菌。
(3)沉淀生长:
液体清晰,细菌生长在管底,形成沉淀。
如链球菌。
2、在固体培养基上的生长情况
(1)菌苔:
在琼脂斜面培养基上长成菌苔。
(2)菌落:
在平板上形成肉眼可见的细菌集团,称为菌落。
观察时要注意菌落的大小、形状、表面形状、边缘是否整齐、透明度、颜色等,可作为鉴别细菌的依据之一。
(3)色素:
水溶性色素和脂溶性色素。
3、在半固体培养基上的生长情况
有鞭毛的细菌,由于能运动,在半固体培养基内沿穿刺线弥漫性生长,使穿刺线变得模糊不清。
无鞭毛的细菌,因为不能运动,接种生仍没穿刺生长,穿刺线与周围界限清楚。
凝集实验(玻片法)
目的:
掌握抗原抗体反应的基本原理和特异性,熟悉凝集反应的操作。
材料:
伤寒杆菌A-F群O多价血清、志贺氏痢疾多价血清、生理盐水、未知菌、玻片。
原理:
颗粒性抗原(凝集原)与相应的抗体(凝集素)直接结合,在一定的条件下形成肉眼可见的凝集现象。
如红细胞ABO血型的测定,测定细菌的细菌凝集实验。
步骤:
1.取清洁载物玻片一张,用蜡笔划为三格,并注明号码。
于第一格和第二格内各加约30ul伤寒杆菌A-F群O多价血清及志贺氏痢疾多价血清,第三格内滴加约30ul生理盐水。
2.用接种环挑取待检菌种少许,分别均匀地涂抹于1、2、3格内的液体中。
接种环每次使用前后均需经酒精灯火焰烧灼灭菌。
3.轻轻摇动玻片,数分钟后用肉眼观察结果,出现灰白色凝集颗粒者即为阳性反应;仍为均匀混悬液者为阴性反应。
如结果不够清晰,可将玻片放于低倍显微镜下观察。
沉淀反应(双扩散)
目的:
掌握抗原抗体反应的基本原理和特异性,熟悉沉淀反应的操作。
材料:
干净玻片,玻璃蜡笔、打孔器、微量加样器、正常人血清IgG、羊抗人IgG
原理:
将抗原与抗体分别加到电解质凝胶板相邻的两孔中,抗原与抗体双方自由扩散,在最适当比例处形成抗原抗体复合物(沉淀线)。
步骤:
1.制板:
取干净玻片一片,用蜡笔分为三格,用吸管将4-5ml加热溶化的1.5%食盐琼脂充盈中格,制备琼脂板。
2.打孔:
待琼脂板凝固后,用打孔器打孔。
孔间距约为5mm。
3.封底:
将打好孔的琼脂板凝板过火焰三次。
4.加样:
用微量加样器在三孔中加入生理盐水,正常人血清IgG和马抗人IgG。
每孔加入约10μl。
注意:
加样时勿使液体溢出和孔内出现气泡。
5.扩散:
将琼脂板放入湿盘内,置37℃温箱中(均保持水平位置),于24小时后观察结果。
药敏实验(纸片法)
目的:
掌握纸片法药敏实验方法,熟悉微生物培养,了解抗生素对细菌的作用机制。
了解含药纸片的制备
材料:
大肠埃希菌,普通琼脂培养基,无菌镊子,打孔器(直径6cm),抗生素纸片。
原理:
药物在琼脂上扩散,形成浓度涕度,在一定的浓度下,对细菌抑制或杀死,浓度过低,则不能抑制或杀死。
从而形成一定大小的抑菌圈。
步骤:
1.平板上密集划线接种。
2.贴4-5种含抗生素的纸片于平板上。
药片与平板边缘相距至少1.5cm,药片之间相距至少2cm。
3.37oC培养24h后观察结果。
测量抑菌圈直径大小,判断敏感性。
消毒剂对细菌的影响
目的:
掌握含药纸片的制备。
熟悉微生物培养,了解消毒剂对细菌的作用机制。
材料:
大肠埃希菌,普通琼脂培养基,无菌镊子,打孔器(直径6cm),滤纸纸片(直径约6mm),70%酒精,金星消毒水,紫药水、红药水。
原理:
药物在琼脂上扩散,形成浓度涕度,在一定的浓度下,对细菌抑制或杀死,浓度过低,则不能抑制或杀死。
从而形成一定大小的抑菌圈。
步骤:
1.平板上密集划线接种细菌。
2.将无菌干燥的滤纸片放入各种消毒剂中浸湿,在容器边缘沥干,即为含药的滤纸片。
3.将以上含药滤纸片贴于平板上,每块贴4种。
药片与平板边缘相距至少1.5cm,药片之间相距至少2cm。
4.37oC培养24h后观察结果。
测量抑菌圈直径大小,判断抑菌效果。
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