第三章核素标记化合物.docx

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第三章核素标记化合物

第四章核素标记化合物

第一节概述

一、标记化合物的概念

凡是分子中某一原子或某些原子（或基团）被放射性核素或稳定核素所取代，而成为一类易被识别的化合物，则称之为核素标记化合物（以下简称标记化合物）。

如CH3·14COOH是放射性14C的标记化合物；CH3·13COOH则是稳定核素13C的标记化合物。

其中14C和13C均为标记原子。

本章侧重介绍放射性标记化合物（radionuclidelabeledcompound）,仅在第三节中对稳定核素标记化合物和其他标记化合物作扼要说明。

二、常用的术语及标记化合物的命名

（一）标记化合物的分类

按照取代原子与被取代原子的关系，可把放射性标记化合物分为两类：

1．同位素标记化合物（isotopiclabeledcompound）

化合物中某元素的稳定同位素原子被同一元素的放射性同位素或稳定同位素原子取代，称为同位素标记化合物，取代前后的化合物，在理化性质上完全相同（同位素效应除外），这类标记称为同位素标记（isotopiclabeling）。

如葡萄糖分子中的C、H分别被14C、3H取代，二氧化碳中的碳被14C或13C取代，都得到同位素标记化合物。

2.非同位素标记化合物（nonisotopiclabeledcompound）

该类标记化合物是用化学性质相似或根本不同的放射性核素取代原化合物中所含的某元素的稳定核素原子,这种标记称非同位素标记（nonisotopiclabeling）。

此类标记化合物即非同位素标记化合物，如125I-IgG（免疫球蛋白）。

非同位素标记亦称非理想标记，得到的标记化合物在理化和生化性能上与原化合物有一定的差异，但严格控制质量，仍能在医学中得到广泛应用。

标记化合物也可按标记核素是放射性核素还是稳定核素分成放射性核素标记化合物和稳定核素标记化合物，统称为核素标记化合物。

（二）标记化合物的命名及常用术语

1．标记化合物的命名

对放射性标记化合物的命名尚缺少统一法则。

一般情况下，有机标记化合物的命名，通常先指出标记位置，再列出标记核素，最后是化合物的名称，如l-14C-醋酸。

必要时，可在核素符号的右下角注明分子内标记原子的数目，如DL-苯丙氨酸-[环2H3，α-2H3]。

无机标记化合物命名，通常在化合物的前面注明放射性核素，也可把标记核素直接写在分子式内，如125I-碘化钠或Na125I）。

2．常用术语

标记分子的具体情况常用下列术语或符号来说明：

（l）定位标记（specificlabeling）即分子中的标记原子限定在指定的位置上。

常用“S”表示，如1-14C（S）-乙酸或1-14C-乙酸。

表示1位碳原子被14C标记。

（2）准定位标记（nominallabeling）在3H标记中，理论上应获得预期的定位标记分子，实际上，3H在预期位置上的分布，有时低于化合物中3H总量的95％，或百分比值不详。

此类标记称准定位标记，用“n”表示。

是一种名义上的定位标记。

（3）均匀标记（uniformlabeling）是一种非定位标记（non-specificlabeling），指整个分子中的某元素所有的原子均被放射性核素取代，或是放射性原子在分子中均匀地分布或者是达到统计学上的均一性。

用“U”表示，如[U-14C]-乙酸。

（4）全标记（generallabeling）是非定位标记，指分子内所有相同的氢原子都可被3H取代，机遇各不相同。

不具有统计学上的均一性。

用“G”表示，如[G-14C]-乙酸。

（5）双标记或多标记（doublelabelingormultiplelabeling）指在标记化合物内引入两种或两种以上的元素的同位素，或引入一种元素的两种或两种以上的同位素原子，如15NH214CHCOOH。

生物医学示踪研究中，有时将一种化合物的两种或两种以上单标记物混合起来应用，通常也称为双标记或多标记物。

第二节制备标记化合物的基本技术

一、放射性核素的选择及标记要求

由于放射性核素有其自身的特点，因此选择核素时应注意：

（1）有合适的核性质。

例如发射γ射线的核素容易测量，往往成为制备标记化合物的首选；半衰期不能太短，以便完成制备和实验；但是太长的寿命给处理放射性废物带来诸多麻烦,以及比活度偏低，不易测量。

（2）得到的产物应与被示踪化合物性质尽量接近，以便得到可信的实验结果和结论。

（3）标记方便，得到的化合物稳定。

放射性标记化合物在标记时也有一些特殊的要求：

（1）标记时应充分利用放射性核素，标记率应尽量高，未标记的核素应注意回收利用。

（2）放射性核素标记是一种微量化学过程，需用微量或超微量方法进行标记、纯化和鉴定。

标记时应尽量减少放射性核素的稀释，避免加入不必要的载体。

（3）选择标记方法时，最好用同位素标记；如使用非同位素标记，则标记核素的位置应以不影响整个标记分子的特定功能为佳；各种放射性核素的化学状态不同，标记方法也有差别。

（4）标记过程应简单、快速；最好在标记的最后阶段加入放射性核素，以减少损失和污染；有条件时，在标记前作冷实验，以取得经验。

二、标记方法

制备放射性标记化合物的常用方法归纳如下：

（一）化学合成标记法（chemicalsynthesis）

此方法是通过化学反应将放射性核素引入化合物中。

换言之，就是将放射性核素的初始原料，通过选定的工艺步骤，合成所需要的标记化合物。

此法可定位标记，但合成步骤较多。

14C，3H标记化合物常用此法进行合成标记。

（二）同位素交换标记法（isotopeexchange）

一般系指两种不同分子之间同一元素的同位素相互替代的过程，利用这个交换过程直接把某种特定的放射性核素引入化合物中。

该方法操作快速、简便。

在放射性核素半衰期短、化学合成步骤多的情况下，该方法的实用意义更大。

适用于大量有机化合物或天然产物的3H标记，是制备3H标记化合物的重要方法。

（三）生物合成标记法（biosynthesis）

该方法是利用酶、微生物、动植物的生理代谢过程，引入放射性核素合成有机化合物。

特别是对目前尚不能用人工方法合成的物质，如某些激素、蛋白质、抗生素、核酸、维生素等，生物合成法则成为其惟一的制备方法。

在酶的催化下，该方法合成的标记化合物大都是具有旋光性的异构体，产物不必经过分离。

用微生物或动植物进行生物合成的缺点是产额低，标记位置不易控制，易造成污染。

此外，还有加速离子和热原子反冲标记法。

实际上，这种反冲标记法与中子活化标记、辐射诱发激活标记一样、都属于辐射合成标记法。

一般它们多用于化合物的3H标记，如甾族化合物、激素和维生素的3H标记。

三、常用的标记化合物及其制备

常用的标记化合物通常指3H、14C和放射性碘标记的化合物，目前碘标记化合物用得比较多。

（一）放射性碳的标记化合物

碳是构成生命物质的基本元素。

在碳的放射性同位素中，生物医学中用得最多的是14C和11C。

14C由反应堆生产，半衰期为5，730年,只发射β-粒子（0.159MeV），用液闪测量很方便，外照射较弱，易防护。

用于自显影时，影像清晰。

半衰期长，能保证连续实验，又不需要进行放射性衰变校正。

理论上，14C标记化合物的放射性比活度可高达2.3088TBq／g，丰度可达100％（商品达80％以上）。

与3H相比，14C标记化合物辐射自分解速度低。

由于构成物质的C－C键比较牢固，标记化合物中的14C原子也比较稳定，所以在生物示踪研究中很有用。

11C标记化合物用于核医学诊断，由加速器生产，它发射β+射线，半衰期为20.1min，需要用快速标记和分离方法制备相应的化合物。

由于11C的良好核性质，因此它的化合物，如11C-蛋氨酸、11C-甲基螺环哌啶酮等是PET（protonemission　tomography，正电子发射断层术）显像中所用的主要放射性药物之一。

放射性碳的标记常从最简单的化合物（如11CO2或Ba14CO3）开始，然后逐步合成得到所需的产品，可定位标记，纯化方便，放射性比活度高。

14C标记化合物的制备方法，基本上分为化学合成法、生物合成法和辐射合成法3类。

14C标记化合物制备工艺复杂，要求设备条件高和防护措施全。

一般放射性实验室从事14C标记有一定的困难。

11C的标记通常用全自动装置，在几分钟内可得到所需的产品。

（二）3H标记化合物

3H为弱β-辐射体（Emax=18.4keV），半衰期为12.35年，可适用于各类实验。

3H的比活度可达1077.44GBq／mmol，比较容易获得高比活度的标记化合物。

并可借助核磁共振仪鉴定3H在标记物中的标记结构。

3H的丰度高，标记化合物的制备方法较14C容易。

一些难以用14C标记的化合物，如肽类、蛋白质等，常可用3H标记。

此外，还能作为碳骨架结构的示踪剂，这点是14C所不及的。

所以，3H标记化合物的用途较广，用化学合成法、同位素交换法和生物合成法均可制备。

（三）放射性碘标记化合物

在医学中常用的放射性碘有131I、125I、123I、124I等，其核性质如表4-1，其中125I和131I是生物医学中最常用的放射性核素。

不少有机化合物都可以进行碘标记，方法简单，适合制备比活度高的化合物。

123I和124I标记化合物主要用于临床功能检查，131I用于甲状腺疾病和各种肿瘤的治疗，125I标记化合物则主要用于生物医学研究与体外分析中。

表4-1医学中常用的放射性碘

核素

半衰期

衰变方式

主要射线能量，MeV（分支比）

123I

13.0h

EC

γ：

0.159（82.9%）

125I

60.2d

EC

γ：

0.035（6.7%），X：

0.027

131I

8.04d

β-

β-：

0.606（86%），0.336（13%）

γ：

0.364（81%），0.637（8.94%）

120I

1.4h

β+

γ：

0.511，β+：

4.6

122I

3.6m

β+

γ：

0.511，β+：

3.1

124I

4.2d

β+

γ：

0.511，β+：

2.1

1．放射性碘标记的蛋白质和多肽

放射性碘标记的蛋白质和多肽方法很多，如一氯化碘法、电解标记法、氯胺-T法、乳过氧化物酶法、Iodogen法和联接标记法等。

后四种方法应用较多。

（l）氯胺-T（ChloramineT，Ch-T）法这是一种微量标记方法，最初由Greenwood和Hunter建立。

该方法标记率高，重复性好，是常用的经典标记方法。

Ch-T是一种较温和的氧化剂，在水溶液中形成次氯酸，将阴离子I-氧化为分子态的碘或I+，在pH为7.5的环境里能与蛋白质的酪氨酸残基苯环上的H+发生置换反应，制得碘标记物。

具体操作方法举例：

在5μg/50μL蛋白质（0.5mol/L的磷酸缓冲液，pH7.5）中，依次加入74MBq/50μL碘[125I]化钠（Na125I），100μg/50μLCh-T，4℃下快速搅拌1min后，加入200μg/100μL偏重亚硫酸钠（Na2S205）终止反应，加入lmg/100μL碘化钾（KI），然后用SephadexG-25凝胶柱分离标记蛋白质和游离碘。

一般游离碘不超过5％。

其反应式为：

氯胺-T法标记125I反应式

Ch-T水溶液对光和氧不稳定，易分解，和Na2S2O5一样，使用前临时配制。

Ch-T的实际用量超过理论值（按氧化74MBq新鲜无载体的125I计算，理论上仅需Ch-TO.15μg），Ch-T的浓度越高，标记率也越高，但用量过高会引起标记物的生物活性和免疫活性降低；用量过低或局部浓度过高也能导致标记率降低。

严格控制反应温度，能减少Ch-T对蛋白质的损伤作用。

加入KI是为了充分分离游离碘。

反应时间由待标记物质的性质决定。

综上所述，控制Ch-T的浓度、反应时间和温度有利于蛋白质的标记。

（2）乳过氧化物酶法即用乳过氧化物酶（lactoperoxidase，LPO）催化过氧化氢（H2O2）释放出活泼的新生态氧，使125I离子活化并标记在蛋白质的酪氨酸残基上的一种标记方法。

此类酶催化反应速度很快。

以标记蛋白质为例，其方法举例如下：

37MBq/50μLNa125I，2～10μg/10μL蛋白质，20～100ng/10μLLPO，200～500ng/10μLH2O2混匀，反应10～30min，加入l0mmol/L的巯基乙醇（或缓冲液）0.5mL终止反应。

10min后加入0.1mmol/L的NaI载体溶液100μL，按常规方法纯化分离。

其反应式为：

乳过氧化物酶法125I标记反应式

此法反应温和，对蛋白质的活性损伤较小，但标记率低。

反应期间可能出现LPO自身碘化和H2O2对LPO的抑制作用。

目前对此法作如下的改进：

①采用固相酶法，将LPO交联在Sepharose4B（琼脂糖凝胶）固相上，解决了LPO碘化后分离难的问题；②采用乳过氧化物酶-葡萄糖氧化酶（LPO-GO）法，利用反应过程中葡萄糖氧化产生的小量H2O2，毋须外加H2O2，使得标记物能保持其生物学活性。

由于标记位置仅限于LPO接近的部位，即蛋白质分子的表面，远离活性中心，所以对保持酶、激素和抗体的活性有利。

与Ch-T法一样,LPO法标记的主要是酪氨酸残基和少量组氨酸残基；不同点是Ch-T法不限分子表面，分子的空间因素对Ch-T法的碘化效率影响不大，但空间因素对LPO法标记率却有着重要影响。

此外，LPO法不仅可以碘化标记蛋白多肽，也能碘化标记各种脂肪、细胞和细胞膜。

成为研究细胞膜结构的重要方法，尤其是固相LPO法标记仅限于酶分子达到的部位，可作为大分子探针，是研究免疫应答过程中细胞膜变化的有力手段。

（3）固相氧化法（Iodogen标记法）1978年由Fraker和Speck建立的碘标记方法。

Iodogen（l，3，4，6-四氯-3α，6α-二苯基甘脲，1，3，4，6-Tetrachloro-3α，6α-diphenlglycoluril,氯甘脲）不溶于水，能溶于氯仿、二氯甲烷、二甲基亚砜等有机溶剂,在碘标记过程中起催化作用。

Iodogen为固相催化剂，毋须新鲜配制。

催化反应终止时不需加还原剂。

具体标记方法举例如下：

1mgIodogen溶于25mL二氯甲烷中，取50μL涂渍在试管底部,用氮气吹干,密封保存于-20℃待用。

标记时向试管中加入10μg/10μL欲标记蛋白质（0.05mmol/L磷酸缓冲液体系，pH为7.4）和37MBq/10μLNa125I，轻轻摇匀，冰浴中反应10min，用250μL的缓冲液稀释，以终止反应。

取出液相，通常用葡聚糖凝胶（Sephadex）柱纯化标记品。

Iodogen标记法具备Ch-T法和LPO法的优点，即标记酪氨酸残基不受空间位置的影响。

同时因固相Iodogen不与蛋白质密切接触,反应过程中的氧化损伤小，反应时间易控制，这一方法越来越为人所接受。

此外，利用Iodogen不溶于水的特点，可直接对培养细胞进行碘标记，方法简便。

将盖片涂Iodogen的一面向下漂浮在含有细胞的培养液上，然后向培养液中加入Na125I，细胞膜蛋白被标记。

注意不应使用含血清和酪氨酸的培养液。

此法已用于研究网织红细胞、红细胞和肿瘤细胞。

（4）联接标记法（conjugationlabeling）这是一种间接标记方法。

先使放射性碘与联接剂相结合，然后碘标记的联接剂再结合到蛋白质或多肽分子上，成为标记化合物。

此方法的基本原理是：

在Ch-T作用下，先用Na125I使酰化剂3-（对-羟基苯）丙酸-N琥珀亚胺酯（HPNS，即Bolton-Hunter试剂）碘化。

125I-HPNS通过一个酰氨键，与蛋白质末端的氨基联结，制得标记物。

其反应式为：

125I-HPNS的苯溶液已有市售商品。

标记方法如下：

取一定量125I-HPNS（每μmol蛋白用3~5μmol碘标试剂），用氮气吹去保存剂后，加入5~10μg（10μL）预冷至0℃的欲标记蛋白，混匀，调至pH8～8.5为宜。

在冰浴中反应15～30min，加入0.5mL0.2mol/L甘氨酸终止反应。

欲标记蛋白质与甘氨酸均用0.lmol/L硼酸缓冲液配制，用SephadexG-50凝胶柱进行分离纯化。

Bolton-Hunter试剂能与血清蛋白结合，因此过柱前不能用蛋白质饱和柱子，去除游离碘后标记物可加蛋白质保护。

此法的优点是能避免蛋白质与氧化剂和125I的直接接触，防止标记过程中引起蛋白质变性失活，并适用于缺乏酪氨酸的蛋白质的标记。

但此法操作比较麻烦，须经过两步反应，碘利用率低。

标记小分子会引起空间构型的破坏，较适合标记分子量＞10，000的蛋白质。

2．核酸的体外碘标记

标记原理：

加热把DNA解析成单股，在三氯化铊（TlCl3）氧化作用下，使125I原子与胞嘧啶环上5位碳原子以稳定的共价键相结合，而形成5-碘胞嘧啶。

标记方法：

将8μL（4μg）DNA水溶液和15μL含肝素（200μg/mL）的0.2mol/L的醋酸钠缓冲液（pH为5）混匀；加入2μLNa125I（7.4MBq）和lμLTlCl3（6mg／mL），再次混匀，45℃保温45min后，冷却至0℃，加入2-巯基乙醇终止反应。

用含有10％甘油和10μgDNA的0.6ml醋酸缓冲液（0.lmol/L，pH为5）稀释；经SephpdexG-25柱纯化，除去游离碘和核酸以外的成分。

合并含核酸的组分；用苯酚-氯仿萃取一次，再用乙醇沉淀，保存备用。

本方法采用的条件温和，可避免核酸裂解、变性和电泳迁移率的改变。

（四）32P及35S标记化合物

32P及35S均为β-发射核素。

磷和硫是核酸和蛋白质本身所含有的元素，32P标记的核苷酸用于DNA序列测定，35S-胱氨酸和35S-蛋氨酸用于研究蛋白质代谢过程，它们均为生物医学中不可缺少的试剂。

32P（T1/2=14.3d,Emax=1.71MeV）和35S（T1/2=87d,Emax=0.167MeV）标记物的制备主要用化学合成、生物合成、酶促法和同位素交换法等。

例如分子生物学中很重要的γ-32P-ATP（32P-三磷酸腺苷）用酶促法制备过程：

①反应液：

6mmol/LMgCl2，2mmol/LL-半胱氨酸，0.73mmol/L无水硫酸钠,0.33mmol/L5’-ATP-Na,0.1mmol/L辅酶I,0.33mmol/L甘油酸-3磷酸钠盐；②酶液：

200μL甘油酸-3-磷酸激酶,60μL甘油醛磷酸脱氢酶,2mmol/L谷胱氨酸，0.1mmol/L辅酶I；③标记反应：

反应液、酶液和H332PO4混合，在pH8.0的0.05mol/Ltris-HCl缓冲液中,37°C反应30min；④纯化：

将反应产物用0°C蒸馏水稀释至18mL，用强碱性阴离子交换树脂柱纯化，先用0.02mol/LNH4Cl-0.02mol/LHCl缓冲液洗去杂质,然后用0.25mol/LHCl将γ-32P-ATP洗脱出来,用活性炭吸附浓缩；⑤放化纯度测定：

硅胶G板为固定相，用叔丁醇：

异丙醇：

20%三氯醋酸=13：

10：

10：

0.1（V/V）展开6~8h。

（五）金属放射性核素的标记化合物

金属放射性核素包括99Tcm、67Ga、111In、90Y、186Re、188Re、153Sm等，它们的生物制剂被广泛用于医学诊断和治疗中，成为标记化合物中不可缺少的一部分。

其标记方法主要有直接标记和间接标记两类。

1．直接标记法

直接标记法即将金属放射性核素直接标记到生物大分子上，如99Tcm和186Re、188Re的标记有时采用这种方法。

该法操作步骤包括：

①金属核素变成能与生物大分子结合的状态。

99Tcm和186Re、188Re均需预先进行还原，并加入合适的络合剂以使其低价态保持稳定。

常用的还原剂有亚锡（Sn2+）、连二硫酸钠（Na2S2O4）等，络合剂有柠檬酸盐、葡萄糖酸钠等。

②生物大分子：

用抗坏血酸、Sn2+、Na2S2O4等打开二硫键，得到还原态氢。

③低价态的金属核素与打开二硫键的生物大分子反应，一般用醋酸缓冲液体系，pH5左右，得到所需的标记化合物。

直接标记法的优点为标记率高，方法简单，通常不必进一步纯化；缺点是打开了二硫键，降低了标记物的生物活性。

2.间接标记法

间接标记法是通过连接剂将放射性核素与生物大分子连接而达到标记目的。

操作步骤为:

①连接剂与生物大分子连接，连接剂常用双功能螯合剂，如DTPA（二乙基三氨基五乙酸）、DOTA（1，4，7，10-四氮杂环十二烷-

四乙酸）、2-IT（2-亚氨基四氢噻吩）、2-ME（2-巯基乙醇）、MAG3（巯基乙酰基三甘氨酸）等；②用Sephadex柱除去多余的螯合剂，得到生物大分子-螯合剂联结物；③有的金属核素如99Tcm和186Re、188Re需要在络合剂存在下还原，与直接标记相同，而67Ga、111In、90Y等则可直接与生物大分子-螯合剂联结物反应，得到相应的标记物；④纯化，除去未标记的放射性核素和其他杂质。

间接标记法的优点是可用于不含二硫键的配体标记；缺点是得到合适的双功能螯合剂较困难，对于不同的核素需要针对性地合成不同的连接剂，否则容易产生标记物不稳定、标记产率低等问题。

另外，制备过程步骤多，放射性核素损失大。

四、标记化合物的纯化与质量鉴定

（一）标记化合物的纯化

各种方法得到的标记化合物都含有一定量的杂质，放存一段时间的标记化合物也会出现分解产物，所以在使用前必须分离纯化。

常用的纯化方法有沉淀法、萃取法、离子交换分离法和层析分离法等。

纯化方法的选择主要依据标记化合物的化学性质，副反应生成的化合物的性质，标记化合物的产额，标记时已存在的或反应中生成的杂质的性质与量。

（二）标记化合物的质量鉴定

标记化合物的质量鉴定指标应包括：

放射性核素纯度、放射化学纯度、放射性比活度及生物学指标。

1.放射性核素纯度（radionuclidepurity）

放射性核素纯度指标记化合物所需要的放射性核素的活度占样品中各种核素总放射性活度的百分比，计算公式：

一般要求标记化合物的放射性核素纯度应在98％以上。

常用的检查方法有两种：

①半衰期测定法，适用半衰期短的核素，一般跟踪时间为3～5个半衰期；②射线能量测定法，利用各种放射性核素固有的能谱，检查测定放射性核素的纯度。

2.标记率（labelingefficiency）和放射化学纯度（radiochemicalpurity）

所谓标记率是指所标记的物质（有可能包括一种以上的化学形态）的放射性活度占样品中总放射性活度的百分比。

放射化学纯度是指某一特定化学形态的标记物的放射性活度占总放射性活度的百分比。

放射化学纯度一般应达到95％以上方可使用。

常用的检查方法有放射性层析法，包括电泳法、薄层色谱、纸色谱及高效液相色谱法等，有时也用放射性核素稀释法和放射自显影法。

3．放射性比活度（specificactivity）

放射性比活度简称比活度，是指单位质量物质所含的放射性活度。

用MBq/mmol或GBq/mmol表示。

测定方法有直接测定计算法、层析扫描面积计算法等。

4．生物学鉴定

生物学鉴定包括生物活性和免疫活性等的测定，这对体内示踪剂尤为重要。

一般说来，受体的生物活性可通过受体和配基结合率测定，免疫活性可通过抗体和抗原结合率测定。

五、标记化合物的贮存

放射性标记化合物除具有化合物本身的不稳定性外，还具有放射性原子所引起的不稳定性。

用于标记的放射性核素所发出的射线能使标记化合物自身分解，称之为辐射自分解（autoradiolysis）。

辐