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鱼皮中胶原蛋白的提取
鱼皮中胶原蛋白的提取
摘要
胶原蛋白是构成动物支持组织的结构蛋白质,其提取制品已广泛应用于医药、保健、食品加工、化装品等众多领域,迄今其制品主要是从一些陆生哺乳动物如牛、鱼等的皮肤提取。
但近年来，科学家对鱼皮中胶原蛋白的提取也没有止步，“鱼皮〞含有丰富的蛋白质和多种微量元素，其蛋白质主要是大分子的胶原蛋白与粘多糖的成分，是女士养颜护肤美容保健佳品，也是滋补佳品。
提取方法主要有聚能式脉冲逆流超声辅助法、中性盐萃取法、酶法、酸法、碱法，而这些方法都尚未获得较高的提取率，但其中酶法提取对胶原蛋白破坏性小，能更好、更完全地得到活性胶原蛋白，具有反响速度快、时间短、无环境污染等优点。
超声波提取因其空穴效应、污染小、节能、环保等优越性能在当今的生产、生活和科学研究中被广泛使用。
所以本论文以新鲜鲫鱼皮为原料，以胶原蛋白提取率为目标参数，采用超声波提取法对鱼皮中胶原蛋白提取，从而进一步提高鱼皮的药用、食用价值。
选取提取时间、料液比、提取功率3个影响因子进展单因素实验。
在单因素实验设计的根底上利用正交试验，得鱼皮中胶原蛋白提取的最正确工艺条件。
结果说明，当提取时间为55min、料液比为1:
45、提取功率为100%时候提取率最高为
关键字：
鲫鱼皮；超声波提取法；胶原蛋白；正交试验
OptimizationOfExtractionofcollagenfromskin
Abstract:
Proteincollagenisanimalsupportorganizationstructure,itsproductshavebeenwidelyusedinmedicine,healthcare,foodprocessing,cosmeticsandmanyotherfields,sofaritsproductsmainlyfromterrestrialmammalssuchascows,pigsandotherskinextract.Butinrecentyears,scientistsontheextractionofcollagenfromskindidnotstop,"skin"isrichinproteinsandothertraceelements,proteinsarelargemoleculesofcollagenandglycosaminoglycanconstituents,itisbeautyskincareandbeauty-caretoshare,andtonic.ExtractionmethodshaveshapedPulsecounterultrasound-assisted,neutralsaltextraction,enzymaticmethod,acid,alkali,allofwhichhavenotbeenhighextractionrate,butlessdamagingenzymaticextractionofcollagenprotein,canprovidebetter,morefullyactivecollagen,highresponsespeed,timeisshort,noenvironmentalpollutionandsoon.Ultrasonicwaveextractionfromtheholeeffect,pollution,energysaving,environmentalprotectionandotheradvantagesintoday'sproductionanddailylifeandiswidelyusedinscientificresearch.Freshfishasrawmaterialthisthesis,aimedatcollagenextractionrateparameters,extractedbyultrasonicwaveextractionofcollagenintheskin,soastofurtherenhancethevalueofmedicinal,edibleskin.Selecttime,solid-liquidratio,extractionpower3factorsofsinglefactors.Singlefactorsbasedonorthogonaltestdesign,optimumconditionsofextractingofcollagenintheskin.Resultsshowthat,whenthetimeis55min,solid-liquidratiois1:
45,thepoweris100%whentheextractionratesofupto
Keywords:
CARPskins,ultrasonicextractionofcollagenprotein;byorthogonaltest
1.1鱼皮简介1
4结论9
参考文献11
致12
1引言
1.1鱼皮简介
中国是世界上最大的淡水鱼养殖[3]，根据中国2007的淡水鱼生产1971万吨统计，主要品种有青鱼、草鱼、鲢鱼、鳙鱼。
随着鱼类加工业的开展，在生产过程中产生大量的废弃物，包括皮、鳞和鱼骨，50%～70%〔占总鱼重量的4〕。
通常这些低水平的加工和利用的废物，只有一小局部被加工成饲料和肥料，大局部是简单的丢弃，它不仅会污染环境，并造成资源浪费。
据介绍，富含胶原蛋白的皮肤、鱼骨和鳞片[3]，尤其是鱼类，其中胶原蛋白含量高达80%以上，许多高于身体其他部位[5]，鱼皮胶原蛋白的提取不仅能够充分利用资源，增加鱼加工的附加值，减少环境污染，是促进鱼类加工业开展的重要。
1.2胶原蛋白简介
胶原蛋白是哺乳动物体含量最为丰富的动物蛋白，也是细胞外基质的结构蛋白质,其结构由3条а链多肽组成，每一条胶原链都是左手螺旋构型，3条左手螺旋链又相互缠绕成右手螺旋结构,即超螺旋结构[11]。
胶原蛋白可作为细胞、组织乃至器官正常功能的支持,对创伤修复具有重要的作用。
此外,胶原蛋白还具有抗衰老、美容、增强体质等成效[12]。
近年来,胶原蛋白已被广泛应用于食品、医药、美容、保健品等行业[13]。
在食品领域,但需要注意的是，胶原蛋白不能通过直接食用动物的皮或肉所得到，必须经过加工处理，才能够更大程度的实现其价值。
在食品加工中,应用精制活性胶原蛋白和高浓缩胶原蛋白质模拟食品,口服给人体直接吸收，另外，胶原蛋白还可作为食品添加剂、饮料澄清剂、食品包装材料等应用于食品中[14-17]；在医药方面，胶原蛋白以其天然的低毒性、低抗原性、低免疫性、能抑制上皮组织细胞的迁移、能引导细胞再生和与人体相容性好等优点[10]，而广泛应用于生物医学材料和临床医疗[11-14]。
在美容、保健领域，由于胶原蛋白富含除色氨酸和半胱氨酸外的18种氨基酸,可用作优质化装品的新型原料与近代医学美容中皮肤组织理想的填充物[15-18],胶原蛋白具有输送钙并结合在骨骼中沉淀起到增加骨量，增强骨密度的明显作用，不仅能增强和维持肌肤良好的弹性,强化肌肤的韧性,延缓肌体的衰老,同时还可强筋健骨,增强体质[19-20]。
从根本上来说，胶原蛋白的来源来自于动物的皮骨中，但由于现阶段群体养殖，卫生方面效劳不到位，导致出现的各种各样得在动物间传播的疾病。
例如禽流感-H7N9，疯牛病等等，同时由于各地信奉的不同，例如我国回族不吃猪肉，印度人不吃牛肉等，导致这种来源广阔，快捷的动物提取胶原蛋白很难真正意义的进入市场,因此作为猪、牛的替代原料，“鱼〞这个人们都爱的食品逐渐的在胶原蛋白提取这个行业的重要性越来越突出，人们吃鱼不仅能促进身体发育，还能有效的降低胆固醇。
因此深入开展胶原蛋白研究，对开展和创制新药与功能性保健食品，以与对资源的合理开发利用和环境的保护都具有重要学术意义和直接或潜在的社会经济价值。
1.3超声波萃取技术
穿透能力强，能够更好、更便捷的获得声能一直是超声波优于其他提取技术的特点。
当涉与到超声波在介质中的传播时,由于超声波与介质之间的相互作用,介质中的物理化学变化,其结果是机械效应、空化效应、热效应、4种超声波作用的化学作用。
高的加速度、乳化、扩散、击碎和搅拌作用等多级效应，增大物质分子运动频率和速度，增加溶剂穿透力，从而加速目标成分进入溶剂，促进提取的进展。
其中对超声波辅助提取起作用的是机械效应和空化作用。
超声波辅助萃取可大大促进溶剂提取天然成分的过程。
传统的提取方法是为了提取原材料中的某种成分，选取相对应的溶剂，同时加上多层级的辅助方法—搅拌，加热等。
超声波的空化效应、高频振动效应和混和效应，形成膨胀和压缩的全过程，在空化场的作用下，在萃取溶剂中，因为膨胀从而形成负压，如果在实验条件允许的情况下尽可能的加大超声功率，膨胀的整个过程就会在溶液中生成气泡或将溶液击碎成很多很小的的小孔。
这些小孔立马就会自行密封，在密封过程时产生高达3000MPa的瞬间压力，到达提取容物的目的[21]。
经过反复阅读大量文献，超声波的强烈、振动、空化作用再辅以搅拌可以有效破坏细胞结构，加速有效物质的溶出，不仅可以提高提取效率，而且可以大大缩短时间，节省能源。
目前，超声波提取胶原蛋白研究中，萌萌[22]等人在用超声波提取牛蹄筋胶原蛋白取得较为严谨和好的成果。
近年来很多科研工作者在皮胶原蛋白提取工艺方面进展了研究，。
刁雪洋[24]分别采用振荡、微波、超高压和超声波几种辅助提取方法对胶原蛋白进展提取，为鱼皮的开发利用奠定了根底。
1.4本论文选题意义与研究容
近年来，随着生物化学、分子生物化学和细胞生物化学的不断开展，人们对胶原蛋白的认识不断深入。
特别是20世纪末“绿色化学〞概念的提出，使得利用天然生物质资源，采用环境友好的技术，开发高附加值的环境友好型产品意义更为重大。
胶原蛋白作为优质天然高分子的应用也必将越来越广泛。
但由于其高昂的价格（特别是特殊类型的胶原蛋白的价格）难以让人们普遍承受，应用超声辅助提取手段,在不影响其生物活性的条件下，提高其产量,进展工业化应用，对降低产品的本钱有积极的意义。
因此本论文采用超声提取对鱼皮胶原蛋白的提取工艺,有一定的学术价值和应用价值。
选题的意义和价值表达在以下三方面：
〔1〕鱼皮胶原蛋白的特性
目前已经确认的胶原蛋白有27种类型，其中Ⅰ型胶原蛋白在动物体含量最多应用也最广泛，主要存在于动物的真皮中[6]。
现阶段人们大多从深海鱼鱼皮中提取胶原蛋白，由于深海的低温低压，使这类胶原蛋白具有着普通的陆生动物胶原蛋白和淡水鱼、浅海鱼胶原蛋白所不具备的特殊性质。
对于水产养殖只是少量胶原和胶原类型,被发现的鱼类广泛分布在软骨和脊髓型ⅠⅡ和Ⅵ型和真皮的肌肉,类型骨骼,鳞片,膀胱,肌肉等。
皮肤的主要成分是纤维状胶原蛋白,最高的蛋白质含量可以占总价值的80%,除了少量的弹性蛋白、白蛋白、球蛋白和粘液[8]。
〔2〕鱼皮胶原蛋白的价值
相对于从陆生动物中提取的胶原蛋白，鱼皮中提取的在美容和抗衰老方面更优。
由于鱼类属于变温动物，因此鱼皮胶原蛋白与哺乳动物皮胶原蛋白相比，首先得区别在于胶原蛋白活性激发温度，从陆生动物中提取的胶原蛋白要在35度以上才能完全激发胶原蛋白活性，而鱼的胶原蛋白活性激活温度就要低的多，只需要适度就可以，如果要进展美容，外敷的话，鱼皮胶原蛋白是最好的选择，在直接食用方面，鱼皮胶原蛋白的胶原纤维束更粗。
2材料与方法
2.1材料与试剂
新鲜鲫鱼〔沃尔玛超市〕、乙酸〔市恒兴化学试剂制造〕、氯化钠〔市鼎盛鑫化工〕、盐酸〔痕量分析生物科技〕、透析袋〔乐进生物实验器材商城〕。
2.2主要仪器与设备
DK-8AB电热恒温水浴锅〔-恒科学仪器〕、CP214电子天平〔奥豪斯仪器〕、DHG9123型恒温烘箱〔精细科学仪器〕、80-2台式低速离心机（医疗器械〔集团〕手术器械厂）、SK3200LHC超声波清洗仪（科导超声仪器），其他为实验室常用仪器设备。
2.3方法
〔1〕试验材料预处理：
将新鲜鲫鱼剥皮去污，然后用刀剔去皮下脂肪。
将剔脂后的鱼皮切成0.5×3cm或1×3cm不等的皮条，精细称取2.000g，清洁两次。
脱脂时，将皮条放在烧杯中,用4-5倍40℃温水洗净，按上述方法重复一次，再用Nacl溶液进展浸泡〔料液比1:
100〕6小时后用清水漂洗两次，再用NaOH溶液进展浸泡〔料液比1:
100〕6小时后用清水漂洗两次，将脱脂后的鱼皮置于0.5moL/L乙酸中〔料液比1:
50，w/v〕，浸泡12h后放入冰箱待用。
（2〕胶原蛋白的提取：
按预定参数超声处理，用乙酸为溶液，放入鱼皮，再放入容量瓶中进展超声。
用纱布过滤得滤液；取上述滤液，参加NaCl进展盐析，使NaCI最终浓度不超过2mol/L；盐析后的溶液于4℃下沉降12h，离心（10000r/min）30min，弃去上清液，沉淀转入透析袋中透析，蒸馏水为透析外液，期间每30min换一次透析液，直到用10％的AgNO3溶液检查透析外液无白色沉淀为止，透析完毕将透析袋液倒入干净的培养皿中，普通枯燥法枯燥得胶原蛋白。
公式中：
G为枯燥后胶原蛋白质量，g；G0为鱼皮质量，g。
选取超声功率、提取时间、料液比3个可能影响胶原蛋白提取效率的因素，以胶原蛋白提取率为考察指标，进展单因素试验。
〔1〕超声功率对样品鱼皮胶原蛋白提取的影响：
精细称取样品2.000g，经上述预处理后，在室温下料液比为〔1:
25〕的情况下分别，以60%、70%、80%、90%、100%超声功率提取35min，测定其胶原蛋白的提取率。
〔2〕乙酸与鱼皮比对鱼皮胶原蛋白提取的影响：
精细称取样品2.000g，经上述预处理后，在室温下以100%超声功率提取35min，用料液比为1:
15，1:
25，1:
35,1:
45，1:
55测定其胶原蛋白的提取率。
〔3）提取时间对样品鱼皮胶原蛋白提取的影响：
精细称取样品2.000g，经上述预处理后，在室温下，以100%超声功率，料液比1:
25提取15min，25min，35min，45min，55min,测定其胶原蛋白的提取率。
根据超提取的单因素试验结果，以提取率为目标参数，分别对超声功率A、提取时间B、料液比C3因素进展正交试验。
试验因素与编码水平设计见表1。
表1鱼皮胶原蛋白提取正交试验设计因素水平与编码
Tab.1Thelevelandcodingofcarpskincollagenextractionorthogonalexperimentaldesignfactor
编码变量水平
超声功率〔A,%〕
提取时间〔B,min〕
料液比〔C,g/ml〕
1
60
25
1：
15
2
70
35
1：
25
3
80
45
1：
35
4
90
55
1：
45
5
100
65
1：
55
3结果与分析
3.1单因素试验
不同超声功率对鱼皮胶原蛋白提取效率的影响见图1。
由图1可知，在料液比〔乙酸：
鱼皮=1:
25〕提取时间为35min情况下，随着超声功率的增大，鱼皮胶原蛋白提取率增加，当超声功率为60%-70%时，胶原蛋白提取率增加较缓慢，提取率在8%-12%之间；当超声功率超过80%时，胶原蛋白提取率增加较快，提取率为16%；当超声功率到达100％时，胶原蛋白提取率最大，此时提取率为25%。
以上实验说明在乙酸作为萃取剂的情况下，超声功率越大，超声波越容易破坏细胞结构，加速有效物质的溶出，这样不仅可以提高提取效率，而且可以大大缩短时间，节省能源，因此选择超声功率为100％比拟适宜。
图1超声功率对样品胶原蛋白提取的影响
Figure1Theeffectofdifferentultrasonicpowerontheextractionofcollageninthesample
提取时间对样品胶原蛋白提取的影响
提取时间对鱼皮胶原蛋白提取效率的影响见图2。
由图2可知，在超声波处理〔超声功率为100％〕，料液比1:
25情况下，随着提取时间的增加，胶原蛋白的提取率呈现先升高后降低的趋势，提取率围为0%-24.5%，并且提取时间到达55min时，提取率到达最大值，此时提取率为24.5%；当提取时间超过55min时，胶原蛋白提取率逐渐降低，但降低速度较缓慢。
上述实验结果说明随着提取时间的增加，反响速率加快，当添加量到达一定程度时，反响速率根本不变，说明提取充分，产物浓度的增大对提取率有一定的抑制作用。
因此，初步选择提取时间为55min为最正确时间。
图2提取时间对样品胶原蛋白提取的影响
Figure2Effectofcollagenextractiontimeonsampleextract
不同料液比下对鱼皮胶原蛋白提取效率的影响见图3。
由图3可知，在超声波处理35min〔超声功率为100％〕的条件下，随着萃取剂乙酸的增加，胶原蛋白的提取率呈现先升高后降低的趋势。
当乙酸与鱼皮比为〔1:
35〕时，胶原蛋白提取率增加较快，提取率介于14%和21%之间；当料液比为〔1:
45〕时，提取率到达最大值，此时提取率为21%；当料液比超过〔1:
45〕，未达〔1:
55〕时，胶原蛋白提取率呈现缓慢降低的趋势；而超过〔1:
55〕时，胶原蛋白提取率降低速度较快。
以上实验结果说明胶原蛋白提取率随着萃取剂乙酸的增加，提取速率会受到影响，所以初步确定料液比为〔1:
45〕为最正确比值。
图3料液比对样品胶原蛋白提取的影响
Figure3Effectofsolid-liquidratioonsampleswereextractedcollagen
3.2正交设计试验
鱼皮胶原蛋白提取正交试验设计与结果见表2，由表2可知：
在3种提取条件中，超声功率（A）极差最大，为1.806，胃蛋白酶参加量（B）其次，为1.680，酶解温度（C）最小，为0.854。
由此说明影响鱼皮胶原蛋白提取的主次因素顺序为超声功率＞胃蛋白酶参加量＞酶解温度。
从各因素的水平看，A7、B7、C9组合的提取率应最大。
但此组合不在正交试验中，作验证试验。
试验结果为在该组合条件下，鱼皮胶原蛋白提取率为12.88%。
由此优化出鱼皮胶原蛋白提取的最优条件为：
以鱼皮为原料，超声功率为100%，胃蛋白酶参加量为2.5g，酶解温度为31℃，酶解时间为2h。
表2鱼皮胶原蛋白提取正交试验设计分析表
Tab2Testresultscarpskincollagenextractionorthogonalexperimentaldesigntable
试验号
超声功率〔A，%〕
提取时间〔B，g〕
料液比〔C℃〕
胶原蛋白提取率〔％〕
1
1
1
1
10.6
2
1
2
2
14.2
3
1
3
3
18.7
4
2
1
2
15.6
5
2
2
3
22.5
6
2
3
1
14
7
3
1
3
14.6
8
3
2
1
14.3
9
3
3
2
11.9
K1
14.500
13.600
12.967
K2
17.367
17.000
13.900
K3
13.600
14.867
18.600
R
3.767
3.400
5.633
4结论
我国水产资源非常丰富，以与对于大多数而言，鱼不像猪肉一样，由于的问题很难推广，而且越来越多的人从安康养生的角度发现了吃鱼肉的好处，这可为鱼类加工产生的大量废弃物为胶原蛋白的提取提供了充足的来源以与广阔的市场前景，但是目前对于这些废弃物的利用较少，国很少有专门的企业来做这件事。
从这些废弃物中获取胶原蛋白可以有效地创新企业产品，增加企业效益，还能为大家带来好产品，安康的产品，而且还有效的减少了环境污染。
目前,在工业生产中,鱼类胶原蛋白的比重很低,即便是鱼类胶原的热变性温度一般低于陆地动物,但这也是它优于陆生动物的地方,利用超声提取鱼皮胶原蛋白,其抗原性、过敏性相对都比拟低,这些特有的胶原蛋白特性，让其与陆生动物胶原蛋白竞争更有优势。
本论文采用超声提取法对鱼皮胶原蛋白进展提取，选用称重法对鱼皮中胶原蛋白含量进展测定。
首先利用单因素试验研究不同超声功率、不同提取时间、不同料液比3个因素对鱼皮胶原蛋白提取的影响，以确定正交试验所需水平，后进展正交试验对提取工艺进展优化以确定胶原蛋白提取的最正确条件。
结果显示：
单因素试验中，选取超声功率为100%，提取时间为55min，料液比为1:
45；正交实验设计优化的最正确提取条件为超声功率100％，提取时间为55min，料液比为1:
45。
在此最正确提取工艺条件下，鱼皮胶原蛋白的提取率为22.5%。
目前的鱼类胶原蛋白提取普遍存在的问题是提取周期长，提取率不高，以与酸、碱等废液排放对环境造成影响，因此今后的在鱼皮胶原蛋白提取的科学研究方面，主要需要攻克的是提高其提取效率，缩短提取时间，尽最大的努力减小对环境的污染。
另外，除了现阶段已有的提取胶原蛋白和明胶等产品，还要加大对这些废弃物潜在价值的挖掘，不断创新出新的产品。
相信随着科技的不断进步，我们对鱼类加工废弃物的开发利用会越来越充分，其开展前景将十分广阔。
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