食品中兽药残留的检测技术常用版.docx

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食品中兽药残留的检测技术常用版

一、

食品中兽药残留的检测技术

我国食品安全检测主要应用技术的研究及现状

食品工业科技VOL24，（12），2003张志洁林清玉

现状分析

随着集约化畜牧业的发展，兽药的作用范围也在扩大，有的药物如抗生素、磺胺药、激素等已广泛用于促进畜禽的生长、减少发病率和提高饲料利用率、促进同期发情。

在饲料添加剂中，抗生素用量占有相当大的比重。

兽药的广泛应用使畜牧业在增产的同时，也带来了兽药残留的问题。

八十年代，欧美等国已开始建立了兽药残留检测体系，并制定了较为完善的兽药用量、休药期及有关法律法规。

我国兽药残留检测体系尚不够完备，时常发生因畜产品中药物残留超标而被外国拒绝进口的事件，给我国农产品出口造成很大的经济损失。

“十五”期间，我国将重点加强兽药监察体系和兽药残留检测体系的建设。

农业部每年投入1755万元用于兽药残留监控，发展了近75种单个兽药在饲料监控和动物源食品中残留的测定方法。

国家质检总局每年也投入大量资金，针对出口和欧盟监控的需要，建立一些兽药残留的检测方法。

但对于某些禁用兽药（主要是"）兴奋剂和激素），其分析方法的灵敏度尚不能满足需要，或大量监控的成本难以承受。

克伦特罗（瘦肉精）的检测方法

欧盟和美国FDA立法禁止克伦特罗在肉用畜禽中的使用;规定牛和马肝中的最大残留限量必须小于0.5µg/kg。

我国2001年也实施了鲜冻禽产品不准检出克伦特罗的标准。

对于克伦特罗，农业部已经颁布了采用高效液相色谱筛选和气）质联机验证的饲料测定方法（NY428-2001），但未使用国际认可的确证方法（稳定性同位素稀释技术）。

卫生部组织了肉中克伦特罗中毒控制方法的探索研究，营养与食品安全所和北京市疾病控制中心分别建立了HPLC-紫外与电化学检测方法和GC-MS方法，正在探索HPLC-MS/MS串联检测方法。

营养与食品安全所、南京农大、华中农大和河南农科院均进行了ELISA试剂盒国产化的研究。

但是，用HPLC或GC-MS检测克伦特罗处理步骤复杂，费用昂贵，制约了其大量推广使用。

在国内，河南农业科学院生物技术研究所与河南百奥生物工程应用单克隆抗体，研制出具有自主知识产权的盐酸克伦特罗快速检测试剂盒和试纸条，已在全国推广应用。

上海赛群生物科技、上海复博软件科技均有克伦特罗酶免疫检测试剂盒出售。

国内流通的进口产品有德国拜发公司的R-BIOPHARM及英国RANDOX公司的ELISA检测试剂盒。

氯霉素的检测方法

测定氯霉素可以用生化方法，但这些方法的灵敏度偏低0.5-1µg/kg），大多情况下主要采用GC和HPLC及色质联用的方法，也有薄层色谱法的报道，但过程繁琐，显色复杂。

美国食品药物管理局FDA最近通报了美方现行的氯霉素检测方法：

用CHARM-II方法筛选，用LC-MS方法进行确认，检测限量由原来的5µg/kg降为现在的1µg/kg，再降为0.3µg/kg，且FDA正在研究应用更敏感的方法，可使检测限达到0.1µg/kg。

国内正在加紧对氯霉素快速检测的研究开发，如华中农大的石德时等建立了氯霉素的间接竞争ELISA法，湖南长沙的福科特生物化学已经在出售氯霉素免疫检测试剂盒。

兽药残留引起的食品污染不仅与公众的健康密切相关,而且直接影响产业界的经济利益和国际贸易,已成为公认的农业和环境问题。

20世纪70年代以来,畜牧业生产中抗生素、抗菌素、生长促进剂的广泛使用,食品中药残的问题已经相当普遍。

尽管残留的水平通常很低,发生急性中毒的可能性极小,但这种长期、低水平的接触方式产生的各种慢性、蓄积毒性,如三致（致癌、致畸、致突变）、免疫毒性、发育毒性和　　生态毒性等对健康和环境产生的危害是肯定的[2-4]。

滥用兽药、不遵守休药期、非法使用违禁药物导致食品中药物残留超标的现象常有存在,兽药残留引起的食品安全问题令人担忧。

　　由于药物添加剂对畜牧业生产的重要价值,近年来的使用仍呈上升势头,取消全部药物添加剂的使用已不现实,因此,各国政府和国际组织十分重视对兽药残留实施愈来愈严格的计划监控[5]。

　　药物残留分析是实施药残监控的基本手段,20世纪80年代以来发展迅速,成为农业化学、分析化学中最活跃的研究方向之一。

与药品分析不同,药残分析的特殊性和复杂性在于待测物的痕量、动态、浓度波动范围大,在于样品基质复杂、干扰物质多,在于样品基质和待测组分的不确定性等,要求分析技术具有灵敏度高、选择性或分离能力强和线性范围宽等特点,传统意义上的化学分析方法通常不能独立进行。

待测物的样品前处理和检测是药物残留分析的两个基本主题,现阶段,色谱、质谱、电泳、免疫分析及联用技术不断优化和日趋完善,药残的检测工作逐渐简化,而样品的前处理越来越成为兽药残留分析过程中的关键。

　　因兽药残留的痕量及生物样品的复杂性,将药残从生物流体或生物基质中释放出来、除去其中的干扰杂质并达到仪器可检测的浓度范围是一件麻烦的事。

样品的前处理过程涉及的因素很多,直接影响各项分析指标、成本和效率,占用70%以上的分析工作量。

近十几年来,兽药的种类和应用规模剧增,化学结构组成日益复杂,并日趋高效或低剂量化,特别是人们对长期摄入低水平兽药残留所致的各种慢性及远期效应的关注和国际间贸易等原因,使分析对象、样本数量和测定难度大大增加,经典的样品前处理方法通常繁琐复杂、操作

　　时间长、选择性差,逐渐满足不了兽药残留分析的发展要求,一些新的样品前处理技术被应用到这个领域。

　　1　固相萃取（SPE）

　　固相萃取（SolidPhaseExtraction,SPE）是利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附,与样品的基体和干扰化合物分离,然后再用洗脱液洗脱达到分离和富集目标化合物的目的。

SPE的净化机制和淋洗操作与传统的开放式柱色谱方法之间不存在原则上的区别,但SPE常指使用预制的装有各种色谱填充料的可弃小柱。

与液-液萃取相比固相萃取有很多优点:

固相萃取不需要大量互不相溶的溶剂,处理过程中不会产生乳化现象,它采用高效、高选择性的吸附剂（固定相）,可以净化很小体积的样品（50-100μl）,能显著减少溶剂的用量,简化样品于处理过程,同时所需费用也有所减少。

固相萃取实质上是一种液相色谱分离,其主要分离模式可分为正相、（吸附剂极性大于洗脱液极性）,反相（吸附剂极性小于洗脱液极性）,离子交换和吸附。

固相萃取所用的吸附剂也和HPLC常用的固定相相同,大多为高聚物,分离效率高,处理样品的比容量大,只是在粒度上有所区别,固相萃取柱上所加压一般都不大,分离目的只是把目标化合物与干扰化合物和基体分开即可,柱效要求一般不高,仅为10-50塔板/m2,故作为固相萃取吸附剂的填料都较粗,一般在40μm即可用,粒径分布要求也不严格,这样可以大大降低固相萃取柱的成本,易操作,并且一次性使用。

除了各种规格和型号的固相萃取小柱已商品化之外,有多种固相萃取的专用装置出售,使固相萃取使用起来更加方便简单,实现净化过程的自动化。

　　SPE既可用于复杂样品中微量或痕量目标化合物的提取、又可用于净化、浓缩或富集,是目前兽药残留分析样品前处理中的主流技术。

磺胺类药物（sulfonamides,Sas）是畜牧业中常用的广谱抗菌素,采用液-液萃取的方法处理样品,检测结果背景干扰大、低浓度下回收率低,容易产生误判。

刘海新[6]以HPLC检测罗非鱼肌肉中磺胺二甲基嘧啶（Sulfamethazine）,其样品前处理采用ODS-C18（200mg）柱固相萃取,该方法的精密度和准确度都比现有的标准方法SN8-93出口肉中10种磺胺残留量的检测方法高,在0.01mg/kg的浓度下,回收率可达到80%以上,相对标准偏差为2.83%;李俊锁等[7]采用Sep-Pak碱性氧化铝SPE用于肝组织中7种磺胺药物的净化:

样品经乙腈提取、正已烷萃取和氧化铝柱SPE净化后测定,净化效

　　果显著,回收率68.8%-100.0%,检出限低于0.05mg/kg。

对于复杂样品净化,组合SPE方式（样品经过二个SPE柱）通常很有效果。

检测蜂蜜样品中的四环素（tetracyclines,TCs）残留,样品经C18柱净化后尚不能满足HPLC的检测要求,背景干扰峰影响了结果的定性定量,Oka[8]等采用双柱SPE净化形式,

　　蜂蜜样品用EDTA缓冲液提取后,先过Baker10C18柱,再经Baker10-COOH（阳离子交换柱）进一步净化,这种前处理方法所得结果的回收率、精密度都能满足HPLC分析要求。

在多残留组分分析中,更简便的方法是采用混合型固定相（mixed-phase）SPE,可以使用混合键合相硅胶（通常具有疏水和离子交换两种基团）,或将两种填料混合装柱,分离机制取决于pH和淋洗溶剂。

苯乙胺（phenethylamines,PEAs）是一组药理效应上属于拟肾上腺素的药物,典型的药物如克仑特罗（clenbuterol）,其结构中均含有疏水的饱和烃链和含氮碱性中心,分苯酚型和苯胺型两大类,理化性质差异较大,用单一SPE净化样品回收率较低,净化效果不理想,Gabiola[9]等建立用混合固定相SPE柱（Bod-ElutCertify）净化牛尿样中的克仑特罗、沙丁胺醇、特布他林及它们的轭合残留物的方法,先将样品调至中性pH,样品通过SPE柱,PEAs被反相机制保留,将SPE柱用1.0mol/L乙酸酸化,质子化的药物与固定相中的磺酸基（-SO-3）结合,有机溶剂洗涤除去杂质,用含2%氨水的乙酸乙酯洗脱药物。

　　2　基质固相分散技术（MSPD）

　　基质固相分散（Matrixsolid-phasedispersion,MSPD）是Barker等[10]在1989年提出并给予理论解释的一种快速样品处理技术。

其基本操作是将样品（固态或液态）直接与适量反相键合硅胶一起混合研磨,使样品均匀分散于固定相颗粒的表面,制成半固态装柱,然后采用类似于SPE的操作进行洗脱。

所用的填充料一般为C18或C8,样品和填充料的比例通常为1:

4。

MSPD是一种在SPE的基础上改进后的样品处理方法,较SPE,它的优点在于:

它依靠机械剪切力、C18键合相的去垢效应和巨大的表面积使样品结构破碎并且在填料表面均匀分散,浓缩了传统的样品前处理中所需的样品匀化、组织细胞裂解、提取、净化等过程,避免了样品匀化、转溶、乳化、浓缩造成的待测物损失,而且固定相处理样品的比容量大,提取净化的效率较高。

　　MSPD处理样品耗时短、节省溶剂、样品用量少,引起兽药残留分析界的广泛关注,在Barker等[10]提出MSPD,成功地应用于分析牛肉中的苄青霉素、氨苄青霉素和头孢匹林后的数年间,该方法已被用于近40种的兽药残留分析[1]。

Schenck采用MSPD和碱性氧化铝SPE柱净化牛肝组织中的伊维菌素（ivermectin,IVR）,将2gC18填料（40-60目）与0.5g组织混合,研磨成均质的半固态,装柱,正已烷洗涤,二氯甲烷-乙酸乙酯（3+1）洗脱,流出液经氧化铝柱,浓缩后进行荧光衍生化HPLC/FLD测定,平均回收率75%,检测限为0.001mg/kg;Boyd[12-13]等报道了肝组织中的克仑特罗的MSPD净化法,将0.5g组织与2gC18填料在研钵中混合,研磨30-40s,装柱,正已烷和水依次洗涤,甲醇洗脱,RIA或ELISA测定,检测限低于0.5μg/kg;Long[14]曾用MSPD净化牛奶中的氯霉素,将牛奶加到C18填料颗粒上,混匀后填充到柱子中进行净化,这种方法避免了牛奶直接加SPE柱容易发生柱子阻塞。

C18作MSPD填料较常用,其它种类填料的MSPD也有些报道,Barker等[15]使用硅藻土MSPD和酸/碱萃取建立了肝组织8种苯并咪唑药物（benzimidazoles,BZs）的LC/UVD分析法,MeLaughlin[16]采用较少见的cyanopropylsilyl（CN）吸附剂作为填料净化组织中的氨基糖苷类抗生素（aminoglycosideantibiotics,Ags）。

　　3　超临界流体萃取（SFE）

　　超临界流体萃取（SupercriticalFluidExtraction,SFE）技术是以超临界状态下的流体为溶剂,利用该状态下的流体所具有的高渗透能力和高溶解能力分离混合物的过程。

超临界流体是温度与压力均在其临界点之上的流体,性质介于气体和液、体之间,有与液体相接近的密度,与气体相接近的粘度及高的扩散系数,故具有很高的溶解能力及良好的流动、传递、渗透性能,可代替传统的有毒、易燃、易挥发的有机溶剂。

最常用的超临界流体CO2,由于具有临界条件温度（Tc=31.3℃.Pc=7.48×106Pa）、对大部分物质呈化学惰性、无溶解污染等优点,特别适用于热敏性、易挥发、易氧化成分的分离萃取。

用CO2作流体,可萃取非极性和中等极性的物质,对极性较强的组分,则需要在CO2中加入适量的极性溶剂充当改良剂以提高流体的极性,或采用极性的超临界流体,如N2O、H3等。

　　SFE与其它技术如溶剂萃取、蒸馏、常规柱色谱等相比,显示了许多特点,如速度快、效率高、选择性强,几乎不消耗溶剂等优点,十多年来,在环境监测、医药卫生、食品检验等领域得到广泛应用。

在兽药残留分析的样品前处理方面,SFE有其独到之处。

Pensabene等[17]将鸡蛋样品与基体分散剂混合,在40℃,68Mpa的条件下用CO2作流体进行超临界流体萃取,用HPLC/UVD检测其中的磺胺类药物,该法检测限为25μg/kg,回收率在81%-101%之间。

Pensabene等[18]用SFE对鸡蛋样品中的氯霉素残留进行提取与净化,用HPLC检测,结果表明净化效果很好,当加标浓度为0.01mg/kg,回收率77.4%-86.6%,相对标准偏差4.3%。

甾类同化激素（anabolicsteroids,ASs）包括性激素和肾上腺皮质激素,具有较高的脂溶性,即便在温和的条件下超临界CO2对ASs仍有相当好的溶解性,近年来已有不少SFE在ASs净化中的应用报道[19-21],一般首先将组织冻干、研碎,与适量的助滤剂（Celite566,主要成分为SiO2）混匀后装入SFE萃取池萃取。

多数苯乙胺类药物为中等极性的疏水物质,样品处理用SEF也较合适,Jimenez等[22]采用离子对型的SEF提取食品中的克仑特罗,CO2为萃取剂,在38.3Mpa和80℃下萃取30min,回收率达87%。

　　4　免疫亲和色谱（IAC）

　　免疫亲和色谱（Immunoaffinitychromatography,IAC）是以抗原抗体的特异性、可逆性免疫结合反应为原理的色谱技术,其基本过程为将抗体与惰性基质（如珠状琼脂糖、键合相硅胶）偶联制成固定相,装柱。

当含有待测组分的样品通过IAC柱时,固定抗体选择性地结合待测物,其它不被识别的样本杂质则不受阻碍地流出IAC柱,经洗涤除去杂质后将抗原-抗体复合物解离,待测物被洗脱,样品得到净化。

IAC的最显著优点在于对待测物的高效、高选择性保留能力,特别适用于复杂样品极稀组分的净化与富集。

IAC的理论基础和技术早在20世纪六十年代已经确立。

　　八十年代以来,常规的分析方法（主要是样品的前处理过程）无法满足高分辩、高灵敏度、低检测限的兽药残留分析的发展要求,IAC作为一项颇具发展潜力的技术开始渗透到兽药残留分析中样品前处理过程,它的高选择性的净化和富集能力使得很多繁琐的样品处理难题迎刃而解。

氯霉素危害人体的造血系统,容易引起再生障碍性贫血,是禁用的抗生素,因此方法的检测限很受研究者关注,VandeWater[23-24]等报道了猪肌肉、蛋和牛奶中氯霉素的IAC净化法,样品经提取、离心、过滤和稀释后用IAC柱净化,HPLC/UVD测定,10μg/kg加标回收率70%-99%,牛奶样品的检测限最低可达20ng/L。

激素类也是残留毒理学意义最重要的药物之一。

甾类同化激素（ASs）的残留水平低,内源性干扰物质多,很难找出可供设计样品净化方法的性质,采用IAC这种高选择性的样品分离净化的报道较多[25-27];为了适应多组分ASs净化的要求,一般制备的IAC均具有一定结合多种AS的能力,如采用簇特异性抗体、将两种以上抗体混合偶联制备吸附剂或将两种以上免疫吸附剂混合使用,VanGinkel等[28]曾使用由7种免疫吸附剂装填的IAC柱净化尿液中的多种AS。

IAC在另一类激素药物苯乙胺（PEAs）残留的净化中也应用广泛,已有不少商品柱出售,在许多的分析方法中IAC是PEAs的关键净化步骤,有时是唯一的净化方法。

Haasnoot等[29]首次使用IAC净化尿样或组织提取液中的克仑特罗;Cooper等[30]使用克仑特罗和沙丁胺醇两种结合抗原同时免疫绵羊产生抗血清制备免疫吸附剂,从柱容量、回收率等方面对制备的IAC柱性能进行评价;VanGinkel等[31]制备了针对N-叔丁基和N-异丙基结构的PEAs混合抗体的IAC柱,成功地对猪尿中的克仑特罗、沙丁胺醇、马布特罗和塞曼特罗进行净化,GC/MS测定;将IAC柱与SPE柱结合使用能显著提高净化效果,并保护IAC柱,易再生使用,Lawrence等[32]将样品提取液先经弱阳离子交换柱后再过IAC柱,反相HPLC/UVD直接测定PEAs,重复使用10次后未发现IAC柱容量降低。

　　5　结语

　　除上述之外,还有一些高效的样品提取净化技术和专门的自动化提取装置,如微波辅助提取（MAE）、超声波辅助提取（SAE）、固相微萃取（SPME）、膜分离技术（渗析、超滤）、分子印迹技术（MIP）、吹扫捕集（SCD）、制备色谱法等也在药残分析中得到应用[33-37]。

这些近年来发展起来的样品前处理方法,在药物残留分析中的应用上各有其特点。

固相萃取（SPE）的应用最为普遍成熟,SPE柱已是商品化产品,方法容易标准化,可选择的品种很多,一次性使用,是目前兽药残留分析样品前处理中的主流技术,特别是SPE通过柱切换装置以适当的结构与HPLC、GC连接,实现了样品净化富集过程自动化,但SPE的高选择性的优点不够突出,容易将共存的干扰物一起萃取出来,对于分析物浓度极低的样品,富集倍数有限,可能达不到测定要求;基质固相分散（MSPD）对生物组织样品的处理较有效,但研磨的粒度大小和填装技术的差别可能会使淋洗曲线有所差异,方法不易标准化;免疫亲和色谱（IAC）是目前净化和富集效能最强的样品处理技术,但尚处探索阶段,仍限于常规技术净化困难的重要残留组分样品处理过程,大量性质均一的纯化抗体的供应和非特异性吸附难题的解决是IAC真正走向实用化的前题;超临界流体萃取（SFE）速度快、效率高、几乎不消耗溶剂,但装置价格昂贵、不适合水样分析。

       上述介绍的样品提取净化富集方法,并不能全部代替传统的组织匀浆法、振荡法、索氏提取法或液-液萃取法,事实上,在很多情况下这些新技术对样品的前处理是在经典的方法配合下完成的,但它们反映了药物残留分析样品前处理技术简便高效、高选择性、样品用量少、溶剂消耗量少、自动化程度高、适合多残留分析等的发展方向,随着人们对这些新技术不断的应用、优化、确证和相互渗透,它们将在兽药残留的分析中有更大的应用空间。

自HPLC仪问世以来，其硬件技术、分析方法及应用研究发展迅速。

本文仅就在食品化学分析中，HPLC分析技术与应用进展概述如下。

一、HPLC分析方法进展

●液-固色谱法（LSC）LSC是根据组分基团对吸附剂表面亲和力的大小，决定了其保留程度。

在LSC色谱中应用最广泛的极性固定相是硅胶。

●反相色谱法（RPC）RPC是指在非极性固定相上的液相色谱法，固定相多为化学键合相。

其代表为ODS。

目前，某些极性键合相，如氨基键合相也广泛应用于反相色谱中。

反相色谱可分离离子型和非离子型化合物。

据统计，在食品化学HPLC分析中，90%以上的分析过程都是反相色谱法。

●离子对色谱（IPC）IPC又称为离子对分配色谱，是近年来发展较快的一种色谱技术。

目的是应用液-液分配色谱实现对强电解质和弱电解质混合物，或对电解质和非电离物质混合物的分离。

IPC根据固定相和流动相的相对极性分为正相和反相方式，但反相IPC应用较多，如氨基酸、多肽、核酸、各种药物、有机酸的分析。

●离子色谱法（IC）IC法是HPLC中用于分离分析离子型化合物的方法，按分离机理的不同，IC可分为高效离子交换色谱法（HPIC）、高效离子排斥色谱法（HPICE）和流动相离子色谱法（MPIC）。

HPIC主要用于亲水阴、阳离子和碳水化合物的分离；HPICE多用于无机弱酸、有机酸、氨基酸、醛、醇的分离；MPIC可用于疏水性阴、阳离子和过渡金属配合物的分离。

IC分析多种阴离子快速、灵敏、选择性好。

目前许多国家建立了采用IC法测定水质中阴、阳离子的标准检验法；AOAC已批准四项用于食品分析的IC法。

●反相胶束色谱法（RPMC）在反相离子对色谱中，当反离子采用表面活性剂超过一般离子对色谱所用的浓度时（达0.02～0.2mol/L），此时的反相色谱称为RPMC。

RPMC分为正反相胶束色谱。

特点是具有高度的选择性，有利于梯度洗脱，提高了检测灵敏度。

主要应用于血清、尿液中药物浓度测定，其优点是样品可直接进样分析，分析时间短，样液量少，准确度高。

●空间排阻色谱法（SEC）又称为体系排阻色谱法，是利用多孔凝胶固定相，依据分子大小差异来进行分离的方法。

根据凝胶性质可分为凝胶过滤色谱法（GFC）和凝胶渗透色谱法（GPC）。

SEC适用于需很快提供未知样品分子大小、组成、近似分子量信息。

GFC适用于分析水溶液中多肽、蛋白质、核苷酸、多糖等；GPC主要用于高聚物的分子测定。

如聚乙烯、聚氯乙烯等精细化工原料。

●间接光度液相色谱法间接光度液相色谱检测技术是一项正在发展中的色谱技术，在离子和离子对色谱中都有应用。

该法是对于无紫外吸收的样品采用UVD来检测的方法。

优点是扩大UVD的应用范围，可用于低响应或无响应的样品。

多用于无机和有机阴离子的测定。

。

●化学衍生液相色谱法它是采用衍生试剂，借助化学反应给样品组分化合物分子接上某个特殊基团，使其衍生物能够改善分离效果和提高检测灵敏度的方法。

可分为柱前和柱后衍生法。

衍生试剂有多种，可与胺类、氨基酸、酚、醇等发生衍生化反应。

二、HPLC检测器应用进展

（一）检测器与应用进展

●激光诱导荧光检测器（LIF）LIF与普通荧光检测器的主要区别是其以激光器做为光源。

因此，其单色性好，谱带宽度可达10-8nm以下，使溶剂的瑞利散射光和拉曼散射光的带宽为1.0nm，因而可选择地消除对荧光性号的干扰；聚光性好，聚光点直径几微米，可减小流通池体积，适用于微型和毛细管液相色谱；具有最高的灵敏度（10-9mol/L～10-12mol/L），对一些荧光效率高的物质可达到单分子检测。

●电化学检测器（ECD）ECD是根据物质的电还原性和电氧化性来进行检测的，应用于对紫外光没有吸收或不能发出荧光，但具有电活性的物质测定。

若结合衍生技术，也可应用于非电活性物质的检测。

安培检测器和电导检测器在生化、医学、食品和环境分析中获得广泛的应