基因工程大题.docx

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基因工程大题

基因工程重要特征：

l供体基因转移至受体细胞，改造生物遗传性，创造出新性状。

2DNA分子在受体细胞内复制，为大量纯化DNA片段提供了可能。

基因工程理论依据（特点）

①基因有共同的物质基础：

有遗传功能的特定核酸序列：

DNA片段或RNA。

②基因可切割：

存在间隔序列（重叠序列的基因也可切出）。

③基因可转移：

可在染色体DNA或不同染色体之间跳跃，基因组也可重组。

④多肽与基因之间存在对应关系

一种多肽对应一种基因。

根据表达产物的性质可

检查基因的转移或重组。

⑤遗传密码通用

三联密码子（少数除外）与氨基酸相对应，所有物都相同，只要具备转录翻译条件均能转译出原样的氨基酸。

基因可人工合成。

⑥基因可复制传递遗传信息

重组基因可传代，获得相对稳定的转基因生物。

※基因工程基本操作过程

分分离目的基因

切限制酶切目的基因与载体接目的基因和载体DNA在体外连接

转将重组DNA分子转入合适的宿主细胞,进行扩增培养

筛选择、筛选含目的基因的克隆

表培养、观察目的基因的表达

基因工程技术的意义

大规模生产生物分子。

设计构建新物种。

搜寻、分离和鉴定生物体尤其是人体内的遗传信息资源。

限制性核酸内切酶的命名原则

①限制性核酸内切酶第一个字母（大写，斜体）代表该酶的宿主菌属名（genus）;第二、三个字母（小写，斜体）代表宿主菌种名（species）。

②第四个字母代表宿主菌的株或型（strain）。

③若从一种菌株中发现了几种限制性核酸内切酶，即根据发现和分离的先后顺序用罗马字母表示。

I和III类限制修饰酶的基本特征

Ⅰ型：

能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。

Ⅲ型：

也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序,在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。

但这几个核苷酸对不是特异性的。

Ⅱ型：

能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。

这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。

Ⅱ限制性核酸内切酶的功能

1.识别双链DNA分子中4-6对碱基的特定序列

2.大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧

3.识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构

回文结构（palindrome）：

序列正读和反读是一样的，即有一个中心对称轴，从这个轴朝两个方向读序列是完全一样的。

※II型限制性核酸内切酶的3大特点

识别位点的特异性：

每种酶都有其特定的DNA识别位点，通常是由4、5或6核苷酸组成的特定序列（靶序列）。

识别序列的对称性：

靶序列通常具有双重旋转对称的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。

切割位点的规范性：

双链DNA被酶切后，分布在两条链上的切割位点旋转对称（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。

※星活性产生的原因：

（1）高甘油含量（>5％,v／v）。

（2）限制性内切核酸酶用量过高（>100U／ugDNA）。

（3）低离子强度（<25mmol／L）。

（4）高pH（8.0以上）。

（5）含有有机溶剂，如DMSO，乙醇等。

（6）有非Mg2+的二价阳离子存在（如Mn2+，Cu2+，C02+，Zn2+等。

以上因素的影响程度因酶的不同而有所不同。

例如EcoRI比PstI对甘油浓度

更敏感，而后者则对高pH值更敏感一些。

常发生星活性的内切酶有：

EcoRI、HindⅢ、KpnI、PstI、SalI、HinfI等。

※抑制星号活性的方法：

1.尽量用较少的酶进行完全消化反应。

这样可以避免过度消化以及过

高的甘油浓度。

2.尽量避免有机溶剂（如制备DNA时引入的乙醇）的污染。

3.将离子浓度提高到100-150mM（若酶活性不受离子强度影响）。

4.将反应缓冲液的pH值降到7.0。

5.二价离子用Mg2+。

影响限制性核酸内切酶活性的因素

①DNA样品的纯度

可采用以下方法，提高酶活性：

加大酶的用量，1μgDNA用10U酶

加大反应总体积

延长反应时间

②DNA样品的甲基化程度

③酶切反应的温度

④DNA分子结构

⑤核酸内切酶的缓冲液

Ⅱ限制性核酸内切酶操作的注意事项

①商品化的限制性核酸内切酶均为浓缩液，每次操作时应使用新的吸头去取酶，加入酶的体积应不超过总体积的

10%，否则酶液中的甘油浓度超过5%时将会抑制酶的活性。

②整个操作应在0℃进行，即在冰浴中进行，而且是在加入其它试剂之后，最后加入酶。

③当切割大量DNA时，通常采用延长反应时间，减少酶的用量。

④当DNA需2种或以上酶切时，应用通用缓冲液，若没有通用缓冲液时，只有用1种酶切完后，纯化酶切产物，再

进行下一个酶切反应。

※连接酶的主要类型

T4DNA连接酶

大肠杆菌DNA连接酶（E.Coli）

T4DNA连接酶的作用机制：

①ATP+DNAligase（E）→E-AMP+PPi。

②E-AMP上的AMP转移到DNA的5’磷酸根上使其活化，释放出酶。

③活化的5’磷酸根与相邻的3’羟基形成3’，5’-磷酸二酯键，并释放出AMP。

※DNA连接酶连接作用的特点:

①DNA连接酶需要一条DNA链的3’末端有一个游离的羟基（-OH），另一条DNA链的5’末端有一个磷酸基（-P）的情况下，只有在这种情况下，才能发挥连接DNA分子的作用。

②只有当3’－OH和5’－P彼此相邻，并且各自位于与互补链上的互补碱基配对的两个脱氧核苷酸末端时，DNA连接酶才能将它们连接成磷酸二酯键。

③DNA连接酶不能连接两条单链的DNA分子或环化的单链DNA分子，被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。

④DNA连接酶只能封闭双螺旋DNA上失去一个磷酸二酯键所出现的单链缺口（nick），而不能封闭双链DNA的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的单链裂口（gap）。

⑤由于在羟基和磷酸基团之间形成磷酸二酯键是一种吸能反应，因此，DNA连接酶在进行连接反应时，还需要提供一种能源分子（NAD＋或ATP）

提高平头末端连接效率的方法包括：

1.加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）。

2.加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会。

3.加入10%PEG8000，促进大分子之间的有效作用。

4.加入单价阳离子（NaCl）,最终浓度150-200mmol/L。

大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenowfragment）

Klenow酶的基本性质：

大肠杆菌DNA聚合酶I经胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶部分水解生成的C末端604个氨基酸残基片段,即Klenow酶。

分子量为76kDa。

Klenow酶仍拥有5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性，但失去了5’→3’的核酸外切酶活性。

Klenow酶的基本用途：

1.修复由限制性核酸内切酶造成的3’凹端，使之成为平头末端。

2.以含有同位素的脱氧核苷酸为底物，对DNA片段进行标记。

3.用于催化cDNA第二链的合成。

4.用于双脱氧末端终止法测定DNA的序列。

Klenow酶的基本用途：

补平由核酸内切酶产生的5’粘性末端

DNA片段的同位素末端标记

※反转录酶活性：

①DNA聚合酶活性：

以RNA为模板，催化dNTP聚合成DNA的过程。

此酶需要RNA为引物。

反转录酶中不具有3’→5’外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高。

②RNaseH活性（5’→3’及3’→5’核酸外切酶活性）：

由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子，将由RNaseH从RNA5’端水解掉RNA分子。

③DNA指导的DNA聚合酶活性：

以反转录合成的第一条DNA单链为模板，以dNTP为底物，再合成第二条DNA分子。

反转录酶的发现对于遗传工程技术起了很大的推动作用，目前它已成为一种重要的工具酶。

用组织细胞提取mRNA并以它为模板，在反转录酶的作用下，合成出互补的DNA（cDNA），由此可构建出cDNA文库（cDNAlibrary），从中筛选特异的目的基因，这是在基因工程技术中最常用的获得目的基因方法

宿主细胞的限制和修饰作用；

1.两种不同来源的入-噬菌体（入-K，入-B）。

2.能高频感染各自大肠杆菌宿主细胞（K株，B株）。

3.当它们分别与其它宿主菌交叉混合培养时，（入K-B，入B-K）感染下降数千倍。

4.一但入K噬菌体在B株成功，由B株繁殖出入-K后代，能感染B株,不能再感染原来K株.

称为：

宿主细胞的限制和修饰作用

载体（vector）是指将外源DNA或基因携带进入宿主细胞进行扩增或表达的工具。

按工作方式:

质粒载体、噬菌体载体、粘粒载体、病毒载体、人工染色体载体等。

按功能:

克隆载体和表达载体、测序载体、穿梭载体。

表达载体又分胞内表达和分泌表达载体。

按受体细胞:

原核细胞载体和真核细胞载体。

载体的功能

1.载体的本质是DNA复制子，为外源基因提供进入受体细胞的转移能力。

2.为外源基因提供在受体细胞中的复制能力或整合能力。

3.为外源基因提供在受体细胞中的扩增和表达能力。

载体应具备的条件

1.具有对受体细胞的可转移性或亲和性。

2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。

3.具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点。

4.具有合适的筛选标记。

5.分子量小，拷贝数多。

6.具有较小的分子量。

7.具有较高的遗传稳定性。

8.具有安全性。

克隆载体具备的条件

①载体都能携带外源DNA片段（基因）进入受体细胞，或停留在细胞质中自我复制，或整合到染色体DNA上

随着染色体DNA的复制而同步复制。

②载体都具有供外源基因插入的限制性核酸内切酶位点，即多克隆位点。

③载体都具有合适的遗传标记基因。

④载体都必须是安全的，不应含有对受体细胞有害的基因，并且不会任意转入除受体细胞以外的其他生物

细胞，尤其是人的细胞。

⑤载体本身的分子量都比较小，可容纳较大的外源基因片段。

⑥载体在细胞内的拷贝数要高，方便外源基因在细胞内大量扩增。

⑦载体在细胞内稳定性要高，保证重组体稳定传代而不易丢失。

⑧载体的特征都是充分掌握的，包括它的全部核苷酸序列。

质粒克隆载体构建原则

过程：

严密的实验设计→构建（切割、修饰和连接重组）

1、选用合适的出发质粒：

含必备的元件，如ori、选择标记、克隆位点、启动子和终止子

2、正确获得构建质粒克隆载体的元件

3、组装合适的选择标记基因

4、选用合适的启动子

5、构建过程力求简单

标记基因按其用途分为2类：

选择标记基因:

用于鉴别目的载体的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来。

筛选标记基因:

用于区别重组质粒与非重组质粒，可将携带了外源DNA片段的重组质粒挑选出来。

质粒载体的不稳定性

1、质粒稳定遗传必须的两个条件：

每个世代、每个质粒至少要复制一次

在细胞分裂时，复制过的质粒必须分配到两个子细胞中

2、质粒分配方式

有主动分配和随机分配两种假说。

主动分配：

天然质粒：

具有一个控制质粒拷贝分配的功能区（Par）能以主动分配的方式确保质粒能正确分配到两个子细胞中

随机分配：

人工质粒：

人工构建的质粒载体缺失了par区，只能以随机分配方式分到子细胞中。

一般情况下也能保证质粒的稳定遗传，但在一定条件下会出现质粒丢失的现象。

3、分离的不稳定性

没有获得质粒拷贝的细胞，最终繁殖成无质粒的优势群体。

4、结构的不稳定性

寄主基因组的IS序列插入质粒、质粒间的同源重组等都会使质粒发生插入或缺失。

5、影响质粒载体稳定性的主要因素

新陈代谢负荷

1）复制负荷

2）转录和翻译负荷

使寄主细胞生长减缓：

质粒载体使寄主的世代时间延长约15%。

减缓的程度与质粒的分子量成正比。

丢失质粒的细胞反而会成为优势群体！

质粒克隆载体的用途

用于保存和扩增片段小于2kb的目的基因。

构建基因组文库和cDNA文库。

可用于目的基因的测序。

作为核酸杂交时探针的来源。

λ-DNA载体的构建：

构建依据

λ噬菌体是一种温和噬菌体

能承载较大的外源DNA片段：

λ-DNA头部可包装约36.4～51kb（自身的75%～105%），且约有20kbλ-DNA可缺失（生长非必需）

在λ-DNA上有多种限制性内切酶位点

构建的基本策略与技术路线

策略:

切去部分非必需区，删掉多余的限制性内切酶位点，插入选择性标记基因，建立体外包装系统。

λ-DNA作为载体的优点

λ-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌。

λ-DNA载体的装载能力为25kb，远远大于质粒的装载量。

重组λ-DNA分子的筛选较为方便。

重组λ-DNA分子的提取较为简便。

λ-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达外源基因。

大肠杆菌基因表达载体的构建时包括的基因元件：

复制子、启动子、终止子、核糖体结合位点、翻译的起始密码子和终止密码子、选择标记等。

常见大肠杆菌基因表达系统：

Lac和Tac表达系统、PL和PR表达系统、T7表达系统等。

载体pET-28a的主要构成元件

T7噬菌体启动子、乳糖操纵子、核糖体结合位点、His6标签序列、凝血酶切割位点、多克隆位点、T7噬菌体终止子及乳糖阻遏子序列（lacI）、pBR322复制子、f1噬菌体复制子、卡那霉素选择标记序列等。

载体pET-28a主要构成元件的功能

乳糖操纵子和乳糖阻遏子序列（lacI）的功能：

当目的蛋白对大肠杆菌有毒性时，可能通过添加阻遏物，控制目的蛋白以较低水平表达。

His6标签序列和凝血酶切割位点的功能：

方便利用针对His6的螯合层析（His·BindTM）分离纯化蛋白，然后利用凝血酶切割去除标签蛋白。

多克隆位点处的限制性核酸内切酶在该载体上只有单一切点，方便用作目的基因的插入位点。

T7噬菌体启动子、、核糖体结合位点、T7噬菌体终止子及、pBR322复制子、f1噬菌体复制子、卡那霉素选择标记序列等。

基因融合表达外源蛋白的优点

①外源蛋白通常易被宿主的蛋白水解酶降解，有时可以通过产生融合蛋白避免目标基因产物被快速降解，从而稳定表达产物的产率，特别是表达一些小肽基因时，这是一种好的策略。

②通过与一特异性的蛋白质或其特异的结构域形成融合蛋白，可使表达产物得到快速、有效的回收、纯化

③通过与特定的肽段进行融合表达，可以将表达的外源蛋白质定向地定位在宿主细胞的不同区位。

④通过与特定的蛋白质形成融合蛋白，使外源蛋白在细胞内进行可溶性表达，防止包涵体的形成。

⑤通过同特定蛋白先形成融合蛋白，然后再通过体外切割去除融合部分，是获得天然蛋白一种可靠和可重复性方法。

⑥通过构建融合基因，表达的融合蛋白可以获得2种或2种以上蛋白的免疫原性，便于构建多价基因工程亚单位疫苗。

外源蛋白在E.coli中的分泌表达的优点

①便于简化发酵后处理的纯化工艺。

②保证表达外源蛋白具有正确天然一级结构。

③外源蛋白生物活性高低，依赖于蛋白正确折叠，而分泌表达设计，有利于正确构象形成。

④分泌蛋白减少了重组蛋白受到蛋白水解酶降解的机会，提高蛋白回收率。

天然DNA的来源:

①染色体DNA。

②病毒和噬菌体DNA。

③质粒DNA。

④线粒体和叶绿体DNA。

DNA的提取与纯化主要技术为碱抽提法（碱变性抽提法）、煮沸法、氯化铯超离心法、柱层析法等，因方法的简繁、费用的高低、对设备的要求及产物质量的严格程度而各具优缺点。

碱变性抽提法提取质粒DNA

碱变性抽提法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。

在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。

当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。

通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

碱抽提法所用试剂的生化作用

提取过程中所用的材料有LB培养基、葡萄糖/Tris/EDTA溶液（5Ommol/L葡萄糖；25mmol/LTris•HCl；pH8.0，lOmmol/LEDTA）、TE缓冲液、3mol/L乙酸钠溶液、NaOH-SDS溶液、溶菌酶液、异丙醇、100%乙醇和70%乙醇等。

碱抽提法提取DNA过程中应注意的问题

①碱抽提法成功的标志是把染色体DNA、蛋白质与RNA去除干净，获得一定得率的质粒DNA。

去掉染色体DNA最为重要，也较困难，因为在全部提取过程中，只有一次机会去除染色体DNA，其关键步骤是加入NaOH-SDS溶液与3mol/LNaCl（pH=4.8）溶液时控制好变性与复性操作时机，既要使试剂与染色体DNA充分作用使之变性，又要使染色体DNA不断裂成小片段，且能与质粒DNA相分离。

这就要求试剂与溶菌液充分摇匀，摇动时用力适当，一般来说当溶菌液加入时可用力振荡几次，因为此时细菌还没有与溶菌酶完全作用，染色体DNA尚未释放，不必担心其分子断裂，加SDS以后，则要注意不能过分用力振荡，但又必须让它反应充分，这是一对矛盾，要处理适当。

②加NaOH-SDS溶液5min后，没有看到溶液变粘稠时，不能进行下一步实验。

要检查所用的试剂是否正确?

质量是否符合实验要求,待找出原因补救后才可继续做下去，不然，提取到最后，将得不到质粒DNA或收得率极低。

③在提取时使用的试剂，除了要用重蒸水配外，所用器皿必须严格清洗，最后要用重蒸水冲洗3次，凡可以进行灭菌的试剂与用具都要进行高压蒸气灭菌，防止其他杂质或酚对DNA的降解。

对Eppendorf管子、Tip或非玻璃离心管等只能湿热灭菌，然后放置在50℃温箱中烘干使用（不要放在烘箱中烘干，由于烘箱温度不稳定，经常发生塑料制品融化事故）。

④加乙醇沉淀DNA时，要把离心管加盖颠倒摇动4～5次，注意观察水相与乙醇之间没有分层现象之后，才可以放入冰箱中去沉淀DNA。

⑤乙醇沉淀DNA离心后，要把离心管内壁的上清液抽干或自然挥发，不然，用TE缓冲液溶解DNA时，既困难又不完全。

⑥最后一次沉淀DNA用的离心管应是干净、灭过菌、最好是经过硅化的管子（极少量的TE缓冲液不会因吸附在壁上不能完全收集而损失质粒DNA）。

DNA样品的浓度的测定方法：

一般采用紫外光谱分析、EB荧光分析、水平式琼脂糖凝胶电泳法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法等。

上样缓冲液作用：

①增加样品密度，增加其比重，确保DNA沉入加样孔。

②在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置。

③使样品着色，加样更方便。

寡核苷酸探针的用途：

1.筛选文库。

2.通过Southern、Northern印迹或斑点印迹等杂交技术检测特定DNA序列。

3.通过杂交检测已知序列中的定点突变。

4.检测在克隆化基因中通过定点诱变技术产生的突变。

5.通过引物延伸法确定mRNA分子5′端在基因中的相对位置。

原位杂交操作步骤：

①菌落生长

②转移到NC膜上

③DNA释放和变性

（变成单链DNA）：

10％SDS0.5MNaOH

④中和0.5MTris-HCl

pH8.0

⑤固定80℃120’

⑥杂交（包括预杂交，

加探针DNA杂交）

⑦放射自显影

⑧对照比较，选出重组克隆

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

SDS:

是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持线性状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上负电荷。

在电场的作用下线性蛋白质链在聚丙烯酰胺凝胶介质中向正极移动，移动的速率主要取决于其分子量大小（链的长短），从而把不同分子量的肽链分开。

Southern杂交的操作步骤

1.酶切DNA,凝胶电泳分离各酶切片段，然后使DNA原位变性。

2.将DNA片段转移到固体支持物（硝酸纤维素滤膜或尼龙膜）上。

3.与杂交滤膜，掩盖滤膜上的非特异位点。

4.让探针与同源DNA片段杂交，然后漂洗除去非特异性结合探针。

5.通过X-光片放射自显影或磷屏扫描获取目的DNA所在的位置。

PCR的基本原理

类似于DNA的体内复制。

首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。

这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。

PCR促进剂

助溶剂：

甲酰胺、二甲基亚砜、甘油。

添加剂：

氯化四甲基铵、谷氨酸钾、硫酸铵、离子化及非离子化的除垢剂。

促进剂作用

促进剂有利于消除引物和模板的二级结构，降低DNA的解链温度使DNA变性完全。

增进DNA复性时的特异性配对，增加或改变DNA聚合酶的稳定性。

提高PCR扩展效率。

PCR引物的设计一般原则

引物是PCR特异性反应的关键。

PCR产物的特异性取决于引物与模板脱氧核糖核酸互补的程度。

人工合成的寡聚核苷酸引物需经离子交换HPLC进行纯化。

引物在反应中的浓度要一致。

如果引物浓度较大，在PCR产物检测时，在溴酚兰前面可以看到1条引物带；如果引物太少，使得非特异性扩增发生，从而出现杂带。

不同试验对引物浓度的要求也不一样。

引物浓度不宜偏高，浓度过高有两个弊端：

一是容易形成引物二聚体，二是当扩增微量靶序列并且起始材料又比较粗时，容易产生非特异性产物。

一般说来，用低浓度引物不仅经济，而且反应特异性也较好。

原则：

引物长度一般以15～30bp为宜,过短则降低特异性，过长则会引起引物间退火而影响有效扩增。

避免引物内部出现二级结构，避免序列内有较长的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构。

G/C和A/T碱基均匀分布，G/C含量在45～55%之间，引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶连续排列。

G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。

ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

要避免两个引物间特别是3′末端碱基序列互补以及同一引物自身3′末端碱基序列互补的，使它们不能形成引物二聚体或发卡结构。

引物3′末端碱基一般应与模板DNA严格配对，并且3′末端为G、C或T时引发效率较高。

引物5`末端碱基可不与模板DNA匹配，可添加与模板无关的序列（如限制性核酸内切酶的识别序列、ATG起始密码子或启动子序列等），便于克隆和表达，但其保护碱基有一定的要求。

引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。

PCR反应体系

缓冲溶液（Mg2+是DNA聚合酶的激活剂）

耐热DNA聚合酶

脱氧核糖三磷酸核苷酸（dNTPs）

模板DNA

上游引物、下游引物

在进行PCR时，遇到一些问题时的解决办法：

1．没有得到所希望的PCR产物

①确证是否加入酶，检查酶是否有活性；

②DNA解链是否充分；

③人工合成的引物是否正确；

④在未加TaqDNA聚合酶以前，将反应系统在95℃保温5～10分钟，使蛋白酶及核酸酶失活。

2．PCR产物在凝胶电泳中呈片状

①减少TaqDNA聚合酶的浓度；

②增加退火温度；

③降低Mg2+浓度；

④减少退火时间及延伸时间；

⑤减少周期次数；

⑥从凝胶中回收与所希望的DNA片段大小相同的DNA，进行再次PCR扩增。

3．凝胶电泳中出现引物二聚体区带

①检查引物的3’端是否互补；

②设计较长的引物；

③增加靶目标DNA的量；

④降低引物浓度；

⑤减少周期次数；

③增加退火温度；

4．PCR产物特异性不够