心脏β肾上腺素受体信号转导研究与相关药物研发.docx

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心脏β肾上腺素受体信号转导研究与相关药物研发

心脏β肾上腺素受体信号转导研究与相关药物研发

心血管疾病已经成为威胁人类健康的第一大杀手，也是威胁我国人民健康的重大公共医学问题。

根据《中国心血管病报告2015》，中国人的心血管疾病发病率和死亡率自2002年有记录开始一直呈现上升趋势。

心力衰竭（heartfailure）是众多心血管疾病的终末表现形式，衰竭的心脏逐渐丧失对全身的供血能力，5年死亡率高达50%。

冠心病、心率失常、高血压和糖尿病是心衰的重要诱因。

G蛋白偶联受体（GPCRs），具有七次跨膜结构，因此也称为七次跨膜受体。

GPCRs是已知最大的受体家族，在人类基因组中有大约800个成员，在细胞膜上分布广泛，参与许多重要的生理过程。

GPCRs已成为当前最重要的药物靶点，占所有药物靶点的36.2%；在心血管药物治疗中尤为重要，占心血管系统中所有受体的72.9%，心血管治疗药物中有大约52个作用于GPCRs。

其中，β肾上腺素受体阻断剂、血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素受体阻断剂直接或间接作用于相应的GPCR，已成为治疗包括心力衰竭在内的多种心血管疾病的基本药物。

因此，以GPCR作为主要靶点研发新一代心血管药物仍然是药物开发者的首选。

β肾上腺素受体是GPCR家族的典型成员，是心脏中表达量最丰富的受体[4]，心脏的β肾上腺素受体包括3个亚型：

β1、β2和β3肾上腺素受体。

其中，β1和β2肾上腺素受体在心肌细胞兴奋收缩偶联中发挥重要的调节作用，β3肾上腺素受体在不同物种中差异表达，虽然在人和犬的心脏中都能检测到β3肾上腺素受体，但大鼠中却表达缺失。

心脏的功能受神经内分泌调控，其中，交感神经系统兴奋时释放的儿茶酚胺作用于β肾上腺素受体是机体激活心脏的最强大机制。

心肌细胞中的β肾上腺素受体能够响应儿茶酚胺的激活，增加心肌收缩力。

窦房结和房室结的自律细胞中的β肾上腺素受体也能够响应儿茶酚胺的激活，提高自律性和房室传导，从而加快心率。

由于心脏的做功增加，心输出量（每搏排出量×心率）亦随之增加。

相较心脏而言，α肾上腺素受体在血管系统中表达更多。

在血管平滑肌中，儿茶酚胺激活α肾上腺素受体，导致血管收缩；激活β2肾上腺素受体，导致血管扩张。

由于血管的阻力和心输出量均增加，交感神经系统激活一般能使血压上升；但是，α和β肾上腺素受体在不同血管的表达量不同，血管直径会在儿茶酚胺的作用下发生变化，从而达到调节脏器供血的作用，比如，心脏和骨骼肌的供血会增加，而胃肠道的供血则减少。

心力衰竭是继发于各种原因导致的心脏结构与功能损害。

交感神经系统和肾素-血管紧张素系统的激活在心力衰竭的病理过程中发挥至关重要的作用[6-8]，而β肾上腺素受体阻断剂、血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素受体阻断剂的单独或联合使用，则能有效缓解左心室结构和功能退化，改善患者的血液动力学，降低住院率及死亡率[9-12]。

然而，上述药品并非对所有患者均有效，部分患者甚至出现了严重的副作用。

因此，研发治疗心衰的新药靶点迫在眉睫。

本文总结了心脏中β肾上腺素受体信号通路的研究进展，并对相关药物的研发提出了思路。

1心脏中β肾上腺素受体的信号转导

1.1β肾上腺素受体的G蛋白信号通路

β肾上腺素受体通过偶联G蛋白介导信号级联反应，产生特定的胞内效应。

即使在相同的配体刺激下，不同亚型的β肾上腺素受体也能介导不同的生物学反应。

β1肾上腺素受体占心肌细胞中肾上腺素受体总量的70%～80%[13]。

β1肾上腺素受体偶联Gs蛋白,激活腺苷酸环化酶（AC）、cAMP的合成以及蛋白激酶A（PKA）活化。

在心肌细胞中，PKA磷酸化激活多种胞内蛋白，例如受磷蛋白（PLB）、ryanodine受体等来调动细胞内钙含量。

胞浆中的钙离子增加，进一步加强心肌细胞收缩。

虽然β2肾上腺素受体在心室肌的表达丰度仅约为β1肾上腺素受体的1/4，但同样对调节心功能，特别是对于钙环境的调节发挥重要作用[14]。

β2肾上腺素受体在细胞膜上不同区域表达丰度不同，在细胞膜的小窝处尤为富集，而β1肾上腺素受体广泛分布于心肌细胞膜上[15]。

一方面，β2肾上腺素受体与Gs蛋白偶联，激活cAMP-PKA信号级联反应[16]；另一方面，在激活β2肾上腺素受体后，PKA介导β2肾上腺素受体磷酸化，使β2肾上腺素受体与百日咳毒素（PTX）敏感的Gi蛋白偶联[17]，抑制AC活性及其下游的cAMP合成，限制Gs-AC-cAMP信号通路介导的心肌细胞收缩[18-19]。

有趣的是，β2肾上腺素受体转基因小鼠在应对持续性的交感神经刺激时显示出更好的心功能[20]，这让我们对β2肾上腺素受体-Gi偶联信号通路产生浓厚兴趣。

当β2肾上腺素受体的过表达水平大于本底水平60倍时，β2肾上腺素受体转基因小鼠表现出很好的抗心衰能力，而β2肾上腺素受体过表达水平超过本底水平100倍时，则展现出与β1肾上腺素受体过表达相似的心脏毒性，导致纤维化心肌病和心力衰竭[20-21]。

这提示我们，β2肾上腺素受体在细胞膜表面特定区域的富集是其产生心肌细胞保护作用的关键因素。

β2肾上腺素受体-Gi偶联信号通路可以激活蛋白激酶B（AKT），从而减少心肌细胞凋亡[22]。

近期的研究表明，胰岛素可以通过胰岛素受体/β2肾上腺素受体复合物发挥功能，直接影响心脏收缩相关肾上腺素信号通路[23]。

心脏中的β3肾上腺素受体能够与Gs蛋白偶联，表现出增强心肌收缩力；另一方面，β3肾上腺素受体能够通过偶联Gi蛋白激活内皮一氧化氮合成酶（eNOS），产生NO，并通过此途径增强心肌收缩力[24-25]。

1.2β肾上腺素受体的脱敏与内化

持续刺激导致β肾上腺素受体通过一系列调节分子的协同作用改变自身修饰从而降低敏感性，称为脱敏[4,26]。

GPCR激酶（GRKs）是G蛋白偶联受体最重要的下游分子之一，直接参与GPCR的脱敏，其中GRK2在心肌细胞中的表达量最多[27]。

GRKs家族包含7个成员，目前的研究表明GRK2为其中最重要的成员，在心肌梗死[28]、阿尔茨海默病[29]，炎性疼痛[30]等疾病中有重要作用。

GRK2对激活的β肾上腺素受体具有特异性，能把受体碳末端中多个氨基酸磷酸化，影响受体与G蛋白的偶联，从而减弱Gs蛋白信号通路。

另外，磷酸化后的β肾上腺素受体可以通过招募β休止蛋白（一种细胞内的脚手架蛋白）实现受体内化[31]。

内化后的肾上腺素受体一部分去磷酸化，重新循环到细胞膜上发挥作用，另一部分受体则进入降解途径。

GRKs仅能磷酸化激活后的受体，与此不同的是，cAMP依赖的PKA可以磷酸化静息/激活状态下的受体，实现非同源的β肾上腺素受体脱敏[4]。

综上所述，GRKs和β休止蛋白参与的调节机制降低β肾上腺素受体在细胞膜的蛋白含量，抵抗长时间的交感神经刺激。

2病理情况下β肾上腺素受体信号通路的变化

在心衰早期，为了代偿心输出量的减少，交感神经系统和肾素-血管紧张素系统均呈现活跃，以增加的心脏负荷来维持机体的代谢需求。

心衰病理过程中，神经内分泌系统长期处于活跃状态，心脏长时间暴露于高水平的儿茶酚胺和血管紧张素环境中，最终导致心脏重构和心肌细胞死亡[7-8]。

受体作为细胞信号传导的重要环节，在其中起到了极为重要的作用。

2.1β1和β2肾上腺素受体在心肌细胞存活和死亡中的相反效应

β1和β2肾上腺素受体在信号通路上虽有相似之处，但值得注意的是，在心衰等特殊病理情况下，持续性地激活β1与β2肾上腺素受体表现出截然不同的级联反应。

β1肾上腺素受体可以通过Gs-AC-PKA通路调节心肌细胞的收缩，但是，长期激活β1肾上腺素受体时，却会促进细胞凋亡；这可能和钙/钙调素蛋白依赖激酶Ⅱ（CaMKII）信号通路有关。

持续性地激活β1肾上腺素受体会激活导致细胞凋亡的CaMKII信号通路，这并不通过PKA通路[32]。

Mangmool等[33]发现，激活β1肾上腺素受体可以促进β-休止蛋白-CaMKII-Epac1复合物形成，从而激活CaMKII。

进一步的研究发现，β1肾上腺素受体的碳末端具有β-休止蛋白结合功能，β-休止蛋白则进一步募集Epac和CaMKII。

然而，β2肾上腺素受体并没有这种效果[33]。

进一步地，离体情况下儿茶酚胺诱导的心肌细胞肥大与β1肾上腺素受体-CaMKII信号通路有关，且不依赖PKA通路[34]；同样的情况在在体心脏重构模型中得到了验证[35-36]。

另一方面，近期的研究发现，晚期终末糖基化产物受体（RAGE）与β1肾上腺素受体在分子水平上有相互作用，并产生信号的交集（crosstalk），通过CaMKII作为共同中介引起心肌细胞的死亡和心脏重构[37]。

与持续性刺激β1肾上腺素受体导致的心肌毒性作用相反，持续性地激活β2肾上腺素受体具有抗凋亡作用。

这种保护作用与β2肾上腺素受体-Gi蛋白偶联有关，因为其可以进一步激活PI3K（磷酸肌醇3激酶）-AKT细胞生存通路[22,38]。

尽管激活β2肾上腺素受体可以提高心肌细胞的生存力，但不可忽视的是，这种保护作用是以牺牲心肌细胞的收缩力为代价的。

2.2心衰时β肾上腺素受体信号通路的变化

在心衰的发生发展过程中，慢性儿茶酚胺水平的上升促使β肾上腺素受体功能异常，β1肾上腺素受体在心脏中的含量被显著下调[39-41]，细胞膜上的β1肾上腺素受体密度下调50%，而β2肾上腺素受体却没有表现出这种变化[39,42]。

因此，细胞膜上β1和β2肾上腺素受体之比由静息状态时的80∶20调整到心衰时的60∶40。

上述变化提示，β2肾上腺素受体或许在心衰过程中发挥着重要作用。

在心衰时，GRK2的水平上调，GRK2胞内含量的上升也在一定程度上导致了心衰过程中β1肾上腺素受体的脱敏[43]，进一步导致β1肾上腺素受体信号通路被抑制[41]。

另一方面，伴随着β1肾上腺素受体信号通路被抑制，虽然β2肾上腺素受体的含量没有显著变化，Gi蛋白却显著上调，β2肾上腺素受体-Gi信号通路被显著激活[44-45]。

激活的β2肾上腺素受体-Gi信号通路进一步抑制β肾上腺素受体-Gs信号通路导致的细胞持续过度兴奋[46-48]。

β肾上腺素受体信号通路变化的结果可能激活心肌重构相关的信号通路，例如PI3K级联反应等[49]。

上述结论在心衰病人或动物心衰模型中得到进一步验证。

首先，GRK2的上调在心衰相关的β肾上腺素受体信号通路及心脏功能变化中具有中心地位[50-51]。

再者，Gi的上调是心衰发生发展的重要成因[46-47]。

而笔者所在课题组进一步的研究发现，Gi和GRK2在心衰的发展是具有协同作用的，GRK2介导的β2肾上腺素受体磷酸化程度增加能促进Gi偏向性信号转导，从而促成心脏异常重构[52]。

使用PTX抑制Gi信号通路或使用GRK2的抑制剂Bark-ct后，能够重建β肾上腺素受体调控下多种心衰模型中的细胞收缩反应[51-55]。

上述这些研究表明，Gi和GRK2在心脏异常重构及心衰早期都发挥了关键作用。

3基于β肾上腺素受体信号转导的药物研发

在经典的GPCR信号通路中，配体结合导致受体构象变化使其与异元三聚体（由Gα与Gβ、Gγ三种亚基组成）G蛋白结合，进而分别释放Gα亚基与Gβγ二聚体。

不同的亚基分别激活各自的下游效应器，如AC、磷脂酶或离子通道。

因此，受体激活后可以通过G蛋白不同的下游分子发挥多种生物学功能。

激动剂能够全部或部分激活下游分子，而拮抗剂则可以与受体结合但不产生下游信号。

拮抗剂与激动剂根据与受体的亲和力不同，竞争性地结合受体，调节G蛋白介导的下游信号通路。

在过去20年的研究中，越来越多的证据表明，GPCRs的配体能够根据下游信号分子的不同，介导多种生物学功能。

GPCRs可以通过被偏向性配体（biasedligand）激活，特异性地介导下游某一信号通路子集。

人们发现GPCR可以被特异激活介导β休止蛋白依赖、非G蛋白依赖的信号通路，这不同于之前发现的β休止蛋白依赖的受体脱敏。

目前认为β休止蛋白依赖的信号通路会使受体构象不同于静息时的R状态和激活时的R*状态，呈现一种R*’的构象。

在进一步研究中，受体在不同配体刺激下可以呈现出R*1-R*N的不同构象，与不同的下游信号配合行使生物学功能。

近期的研究发现，β肾上腺素受体阻断剂卡维地洛（carvedilol）在心衰发生发展进程中具有心脏保护作用[56]。

其通过抑制β2肾上腺素受体介导的G蛋白依赖信号通路的同时，微弱地激活β休止蛋白信号通路[57]。

提示我们，开发偏向性配体可能为治疗心脏疾病提供新的思路。

上文已经论述过β2肾上腺素受体-Gi蛋白信号通路的过度激活是心力衰竭的致病因素，而心力衰竭的功能损害体现于心肌细胞的β1和β2肾上腺素受体对激动剂的刺激失去敏感性，形成收缩功能障碍[41,58]。

基于GPCR功能选择理论，可以选择偏向激活Gs通路的β2肾上腺素受体激动剂，而非对激活Gs和Gi通路无偏向性的β2肾上腺素受体激动剂，作为治疗心力衰竭的候选药物。

我们从20多个β2肾上腺素受体激动剂中筛选了偏向激活Gs通路的非诺特罗（fenoterol）[58]。

使用非诺特罗处理心力衰竭的大鼠或心肌细胞，观察到非诺特罗不仅增强心肌细胞的收缩功能[58]，并且显著抑制了心肌细胞凋亡[59]。

在扩张型心肌病大鼠模型中，联合使用β2肾上腺素受体激动剂和β1肾上腺素受体阻断剂比单用β1肾上腺素受体阻断剂能够更有效地降低死亡率和梗死面积的扩大[60]；而且，联合使用β2肾上腺素受体激动剂和β1肾上腺素受体阻断剂比联合使用血管紧张素受体阻断剂和β1肾上腺素受体阻断剂治疗心衰的效果更好[61]。

类似的结果在犬心衰模型中得到验证[55]，在没有使用PTX的实验组，非诺特罗可以在本应偏向β2肾上腺素受体-Gi通路的情况下偏向性地激活β肾上腺素受体-Gs通路，增强心肌细胞的收缩功能，凸显非诺特罗的独特药理作用和应用前景[55]。

非诺特罗在心衰治疗中的作用被后续多篇文章报道[59-62]，长时间使用非诺特罗不仅提高了心功能，同时减缓了心脏的异常重构。

总体上讲，非诺特罗在心肌梗死引起的扩张型心肌病的治疗中，表现得比β1肾上腺素受体阻断剂更为有效[59]。

这项研究进一步证明，偏向性激活β2肾上腺素受体-Gs信号通路可能成为治疗充血性心衰的重要手段。

我们有理由相信，如非诺特罗等β2肾上腺素受体-Gs偏向性激动剂在缓解衰竭心脏结构和功能的退化具有重要作用，将可能成为治疗心衰的潜在药物。

GPCR的结构解析是继功能选择性信号转导后GPCR领域中另一个研究热点。

β2肾上腺素受体与拮抗剂的共晶结构及β2肾上腺素受体与激动剂和Gs蛋白复合物的共晶结构已分别于2007年[63]和2011年[64]获得。

随着结构生物学的发展和计算水平的提高，计算机辅助药物设计已成为药物发现的重要手段。

首先，笔者所在课题组合成了非诺特罗的不同空间异构体[65]。

随后，我们改变了非诺特罗的仲胺取代基团，合成了一系列非诺特罗衍生物。

笔者课题组对这些化合物进行定量构效关系分析，利用比较分子力场分析（CoMFA）模型研究并发现了几个具有高β2肾上腺素受体亚型特异性的激动剂[66-68]，其中包括R,R'-4-甲氧基-1-萘基-非诺特罗（R,R'-4-methoxy-1-naphthylfenoterol，1），其对β2和β1的Ki分别为0.28和160.5μmol.L-1。

在心肌细胞实验中，我们研究了这些β2肾上腺素受体激动剂的正性肌力作用及对PTX的敏感度[69-70]，有如下发现。

①R,R'-非诺特罗比消旋非诺特罗药效更高，临床药物制剂含有R,R'-非诺特罗和S,S'-非诺特罗，其中，R,R'-异构体是活性部分，S,S'-异构体基本无活性；

②S,R'-非诺特罗和S,R'-甲氧基非诺特罗能够同时激活Gs和Gi两种G蛋白，R,R'-非诺特罗和R,R'-甲氧基非诺特罗选择性激活β2肾上腺素受体的Gs通路；

③以萘基取代苯基，化合物对β2肾上腺素受体的特异性增加，苯基或萘基如带有4-羟基、4-甲氧基或4-氨基，能增加化合物对β2肾上腺素受体的特异性；

④Gs偏向性β2肾上腺素受体激动剂需要具备R,R'-构型、苯基和4-羟基、4-甲氧基或4-氨基其中之一。

展望未来，我们希望能通过受体的分子模型发现结构全新的Gs偏向性β2肾上腺素受体激动剂，并发现化合物的结构如何影响受体的构象、不同激动剂的受体信号传导，及其与心肌细胞收缩功能和存活的关联[71]。

4结语

综上所述，β1和β2肾上腺素受体在调节心肌细胞存活和心肌重构方面具有不同效果。

β2肾上腺素受体激活具有心肌保护作用，而β1肾上腺素受体激活却有心肌毒性作用。

与β1肾上腺素受体只能偶联Gs通路不同的是，β2肾上腺素受体可以偶联Gs和Gi两种蛋白，而Gi的激活可以负向调节Gs激活引起的心肌收缩反应。

在心力衰竭的心脏中，GRK2和Gi蛋白的上调进一步激活了Gi偏向性β2肾上腺素受体的信号转导。

这些结果表明，β2肾上腺素受体-Gi通路在连接GRK上调和心衰病理过程具有重要作用。

由于GRK2和Gi偏向性的β2肾上腺素受体信号通路是心衰的致病因素，因此，促进Gs偏向性的β2肾上腺素受体激活可能在心衰治疗中具有重要意义。