紫外光度计测苯酚含量方案2.docx
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紫外光度计测苯酚含量方案2
用紫外可见分光光度计
测废水中的苯酚含量
项目实施方案
学校：
绵阳职业技术学院
指导老师：
石建屏
组长：
高晓宇
组员：
刘世樑、汤效飞
刘彦汝、齐丽君
胡楚卿、邓素容
目录
一、仪器工作原理
二、仪器结构
1、光源
2、分光系统
3、吸收池
4、检测显示系统
三、仪器使用方法
四、工作曲线法测苯酚含量
（一）溶液的制备
1、容器的洗涤
2、溶液的配制
（二）样品的测定
1、绘制吸收光谱曲线，确定最大吸收波长
2、绘制苯酚溶液工作曲线，计算未知样品浓度
3、实验完毕
五、结果记录及实验数据处理
一、仪器工作原理
含有苯环和共轭双键的有机化合物在紫外区有特征吸收。
物质结构不同对紫外及可见光的吸收具有选择性。
其中，最大吸收波长λ、摩尔吸收系数ε及吸收曲线的形状不同是进行物质定性分析的依据。
由于在λmax处吸光度A有最大值，在此波长下A随浓度的变化最为明显，方法的灵敏度最大，故在紫外分光光度计上作苯酚水溶液（试液）的吸收光谱曲线，再由曲线上找出λmax，据此对物质进行定量分析。
用紫外分光光度计进行定量分析时，若被分析物质浓度太低或太高，可使透光率的读数扩展10倍或缩小10倍，有利于低浓度或高浓度的分析，其方法原理是依据朗伯-比耳定律：
A=εbc。
二、仪器组成
紫外分光光度计由光源、分光系统、吸收池、检测显示系统等四大部分组成，其组成框图见下图。
1、光源
光源的作用是提供符合要求的入射光。
分光光度计对光源的要求是：
在使用波长范围内提供连续的光谱，光强应足够大，有良好的稳定性，使用寿命长。
紫外光光源多为气体放电光源，如氢，氘，氙放电灯等。
其中应用最多的是氢气灯及同位素氘灯，其使用波长范围为185～357nm。
为了保证发光强度稳定，也要用稳压电源供电。
氘灯的光谱分布与氢灯相同，但光强比同功率氢灯大3～5倍，寿命比氢灯长。
2、分光系统
分光系统是紫外可见分光光度计的核心部分。
它主要由入射狭缝、准直镜、光栅、物镜和出射狭缝组成。
入射狭缝起着限制杂散光进入的作用,它一般处在准直镜的焦点上；准直镜将从入射狭缝射进来的复合光变成平行光；光栅用来分光。
分光系统有三个作用：
①分光,把从入射狭缝进来,投射到光栅上的复合光分成单色光；②转向,把从准直镜射过来的平行光改变方向,投射到物镜上；③能量传递,把从准直镜射过来的平行光的能量改变方向后传递到物镜；如果是Ⅳ型凹面光栅,则还有成像的功能,将从入射狭缝进来射到光栅的发散光会聚并成像到出射狭缝上；出射狭缝起限制光谱带宽的作用。
注意！
仪器的光学系统是仪器的核心部分，切勿轻易拆开，要保持内部干燥、绝缘良好。
3、吸收池
吸收池又叫比色皿，是用于盛放待测液和决定透光液层厚度的器件。
吸收池一般为长方体，其底及两侧为毛玻璃，另两面为光学透光面。
根据光学透光面的材质，吸收池有玻璃吸收池和石英吸收池两种。
玻璃吸收池可用于可见光光区测定，若在紫外光区测定，则必须使用石英吸收池。
吸收池的规格是以光程为标志等，使用时根据实际需要选择。
由于一般商品吸收池的光程精度往往不是很高，与其标示值有微小误差，即使是同一个厂出品的同规格的吸收池也不一定完全能够互换使用。
所以，仪器出厂前吸收池都经过检验配套，在使用时不应混淆其配套关系。
实际工作中，为了消除误差，在测量前还必须对吸收池进行配套性检验，使用吸收池过程中也应特别注意保护两个光学面。
为此，必须做到以下几点：
第一，拿取吸收池时，只能用手指接触两侧的毛玻璃，不可接触光学面；
第二，不能将光学面与硬物或脏物接触，只能用擦镜纸或丝绸擦拭光学面；
第三，凡含有腐蚀玻璃的物质的溶液，不得长时间盛放在吸收池中；
第四，吸收池使用后应立即用水冲洗干净。
有色物污染可以用3mol/L的HCl和等体积乙醇的混合液侵泡洗涤。
生物样品，胶体或其他在吸收池光学面上形成薄膜的物质要用适当的溶剂洗涤；
第五，不得在火焰或电炉上进行加热或烘烤吸收池。
4、检测显示系统
检测器又称接收器，其作用是对透过吸收池的光做出反应，并把它转变为电信号输出，其输出电信号大小与透过光的强度成正比。
常用的检测器有光电池、光电管及光电倍增管等，它们都是基于光电效应原理制成的。
作为检测器，对光电转换器要求是：
光电转换有恒定的函数关系，响应灵敏度要高、速度要快，噪声低、稳定性高，产生的电信号易于检测放大等。
信号显示器，由检测器产生的电信号，经过放大等处理后，用一定方式显示出来，以便于计算和记录。
三、
至电源
仪器使用方法
1、打开计算机的电源开关，进入Windows操作环境。
确认样品室中无挡光物，打开紫外分光光度计电源，单击“开始”选择“程序”→uvwin5紫外软件v5.0.4，进入紫外控制程序，出现紫外初始3画面，计算机对紫外进行自检并初始化，仪器需要加热15~20min。
2、在样品池插入黑色挡板，选择“测量”菜单中的“暗电流校正”项，在整个波长范围内进行暗电流校正并存储数据。
3、选择“应用”菜单的测量模式（光度测量、光谱测量、定量测量和时间扫描四种模式），选择“配置”菜单中的“参数”项，设置测量参数。
3.1光度测量
选择菜单【应用】→【光度测量】项，打开光度测量窗口（如果定量测量窗口已打开则激活该窗口）
3.1.1设定参数：
选择【配置】菜单【参数】项，弹出光度测量参数设置窗口，设置其对应参数。
3.1.2测量
设定完测量参数后，单击命令条【Autozero】按钮对空白样品进行校正。
单击【Read】按钮对待测样品进行测量。
3.2光谱测量
选择菜单【应用】→【光谱测量】项，可打开光谱扫描窗口（如果定量测量窗口已打开则激活该窗口）。
3.2.1设定参数
3.2.1.1扫描参数的设定：
按F6或选择菜单【配置】→【参数】项，弹出光谱测量参数设置对话框。
3.2.1.2颜色设定：
选择菜单【配置】→【颜色】项，弹出颜色设置对话框。
3.2.2基线校正
测量样品应对空白样品进行基线校准以消比色皿之误差。
单击命令条【Baseline】按钮，可以进行基线校正。
3.2.3扫描
按照设定的波长范围、测定方式和采样间隔（在参数设定中设定）进行光谱扫描测量，扫描结果同时显示在屏幕上。
插入样品后，单击【start】开始扫描，单击【stop】停止扫描。
3.3定量测量
准确移取未知液10mL于50mL容量瓶中，用去离子水稀释到刻度，摇匀。
在同样条件下测定其吸光度，根据吸光度在工作曲线上查出苯酚的待测液的浓度，并计算出未知液中苯酚的含量。
定量测定窗口（未知样品测定）：
选择菜单【应用】→【定量分析】项→可打开定量分析窗口（如果定量测量窗口已打开则激活该窗口）。
定量测定-标样测定（标准样品测定）：
单击命令条的【standard】按钮可打开“定量测定-标样测定”窗口。
3.3.1设定参数
在进行定量测定前，首先需要设定操作参数和条件。
按【F6】键或者选择菜单【配置】→【参数选择】功能弹出对话框。
3.3.2标样测定
单击命令条的【standard】按钮打开定量测量-标样测定窗口，单击命令条【Read】按钮弹出紫外窗口对话框，插入待测标样输入编号，单击确认按钮即可测量并显示该标样的测量值。
3.3.3曲线显示
对于K系数法，显示标准曲线公式及系数，对于多点工作曲线分，首先进行拟合运算，然后显示标准曲线及其他数据。
选择菜单【数据处理】→【工作曲线】项即弹出对话框。
3.3.4测量
在定量测定窗口活动时，按【F8】键，系统将按照设定好的定量测定模式，逐个地移到相应波长位置测试并根据标准工作曲线计算出浓度，显示在屏幕上。
3.4时间扫描
选择菜单【应用】→【时间扫描】）可打开时间扫描窗口。
3.4.1设定参数
选择菜单【配置】→【参数】项，弹出时间扫描参数设置对话框。
3.4.2按照使用者设定的波长位置，扫描时间、光度方式和时间间隔进行时间扫描测量，扫描结果同时显示在屏幕上，在样品机参比侧放入空白样品，单击命令条的【Autozero】按钮对空白样品进行校零。
插入样品后，单击命令条【Read】按钮开始时间扫描。
如需中途停止在时间扫描窗口的图谱显示的外侧按鼠标右键，可停止当前操作。
4、光度计调校：
基线校正，为了保证仪器在整个波段范围内基线校正或自动校零。
紫外光区波长准确度检查和校正，在吸收池滴一滴液体苯，盖上吸收池盖，待苯挥发充满整个吸收池后，就可以测绘苯蒸汽的吸收光谱。
若实测结果与苯的标准光谱曲线不一致，表示仪器存在波长误差，必须加以调整。
在样品池和参比池中放入参比溶液，选择“测量”菜单中的“基线较正”项，在整个波长范围内进行基线较正并存储数据。
5、根据参比池在内，样品池在外的原则放入样品，点击“read”（或start）进行测量。
6、保存测量数据。
7、测量结束后，关闭测量窗口，关闭紫外分光光度计主机电源，推出Windows，关闭电脑。
8、取出比色皿，冲洗。
9、注意
在操作时，切忌带电插拔电源线及连接电缆，误操作有可能损坏仪器及计算机。
四、工作曲线法测定废水中的苯酚含量
（一）溶液的制备
1、容器的洗涤
实验中所使用的玻璃器皿清洁与否直接影响实验结果。
由于器皿的不清洁或被污染，往往造成较大的实验误差，甚至会出现相反的实验结果。
因此，玻璃器皿的洗涤清洁工作是非常重要的。
（1）初用玻璃器皿的清洗
新购买的玻璃器皿表面常附着有游离的碱性物质，先用肥皂水（或去污粉）洗刷，再用自来水洗净，然后浸泡在1%~2%盐酸溶液中过夜（不少于4h），再用自来水冲洗，最后用蒸馏水冲洗2~3次，在100~130℃烘箱内烘干备用。
（2）使用过的玻璃器皿的清洗
①一般玻璃器皿如试管、烧杯、锥形瓶等（包括量筒）。
先用自来水洗刷至无污物，再选用大小合适的毛刷蘸取去污粉（掺入肥皂粉）刷洗或浸入肥皂水内。
将器皿内外，特别是内壁，细心刷洗，用自来水冲洗干净后再用蒸馏水洗2~3次，热的肥皂水去污能力更强，可有效地洗去器皿上的油污。
洗衣粉与去污粉较难冲洗干净而常在器壁上附有一层微小粒子，故要用水多次甚至10次以上充分冲洗，或可用稀盐酸摇洗一次，再用水冲洗。
烘干或倒置在清洁处备用。
凡洗净的玻璃器皿，不应在器壁上带有水珠，否则表示尚未洗干净，应再按上述方法重新洗涤。
若发现内壁有难以去掉的污迹，应分别使用下述的各种洗涤剂予以清除，再重新冲洗。
用过的载玻片与盖玻片如滴有香柏油，要先用皱纹纸擦去或浸在二甲苯内摇晃几次，使油垢溶解。
再在肥皂水中煮5~10min，用软布或脱脂棉擦拭，立即用自来水冲洗，然后在稀洗涤液中浸泡0.5~2h，自来水冲去洗涤液，最后用蒸馏水换洗数次，待干后，浸于95%乙醇中保存备用。
使用时在火焰上烧去乙醇。
用此法洗涤和保存的载玻片和盖玻片清洁透亮，没有水珠。
检查过活菌的载玻片或盖玻片应先在2%新洁尔灭溶液中浸泡24h，然后上述方法洗涤与保存。
玻璃器皿经洗涤后，若内壁的水均匀分布成一薄层，表示油垢完全洗净，若挂有水珠，则还需要用洗涤液浸泡数小时，然后用自来水充分冲洗，最后用蒸馏水洗2~3次后备用。
②量器如吸量管、滴定管、量瓶等。
使用后应立即浸泡于凉水中，勿使物质干涸。
工作完毕后用流水冲洗，以除去附着的试剂、蛋白质等物质，晾干后浸泡在铬酸洗液中4~6h（或过夜），再用自来水充分冲洗，最后用蒸馏水冲洗2~4次，风干备用。
③其他具有传染性样品的容器（如分子克隆、病毒玷污过的容器）常规先进行高压灭菌或其他形势的消毒，再进行清洗。
盛过各种毒品（特别是剧毒药品和放射性核素物质的容器）必须经过专门处理，确知没有残余毒物存在时方可进行清洗。
否则使用一次性容器。
装有固体培养基的器皿应先将其刮去，然后洗涤。
带菌的器皿在洗涤前先浸在2%煤酸皂溶液（来苏水）或0.25%新洁尔灭消毒液内24h或煮沸0.5h,再用上述方法洗涤.
（3）洗涤液的种类和配制方法
①铬酸洗液：
（重铬酸钾-硫酸洗液，简称洗液或清洁液）广泛用于玻璃器皿的洗涤，常用的配制方法有4种：
i.取100mL工业浓硫酸置于烧杯内，小心加热，然后慢慢地加入重铬酸钾粉末，边加边搅拌，待全部溶解后冷却，贮于带玻璃塞的细口瓶内。
ii.称取5g重铬酸钾粉末置于250mL烧杯中，加水5mL，尽量使其溶解。
慢慢加入100mL浓硫酸，边加边搅拌，冷却后贮存备用。
iii.称取80g重铬酸钾，溶于1000mL自来水中，慢慢加入工业浓硫酸1000mL，边加边搅拌。
iv.称取200g重铬酸钾，溶于500mL自来水中，慢慢加入工业浓硫酸500mL，边加边搅拌。
2浓盐酸（工业用）：
可洗去水垢或某些无机盐沉淀。
35%草酸溶液：
可洗去高锰酸钾的痕迹。
45%~10%磷酸三钠（Na3PO4·12H2O）溶液：
可洗涤油污物。
530%硝酸溶液：
洗涤CO2测定仪器及微量滴管。
⑥5%~10%乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液：
加热煮沸可洗去玻璃器皿内壁的白色沉淀物。
⑦尿素洗涤液：
为蛋白质的良好溶剂，适用于洗涤盛蛋白质制剂及血样的容器。
⑧酒精与浓硝酸混合液：
最适合于洗净滴定管，在滴定管中加入3mL酒精，然后沿管壁慢慢加入4mL浓硝酸（相对密度1.4），盖住滴定管管口。
利用所产生的氧化氮洗净滴定管。
⑨有机溶液：
如丙酮、乙醇、乙醚等可用于洗脱油脂、脂溶性染料等污痕。
二甲苯可洗去油漆污垢。
⑩氢氧化钾-乙醇溶液和含有高锰酸钾的氢氧化钠溶液：
它是两种强碱性的洗涤液，对玻璃器皿的侵蚀性很强，清除容器内壁污垢，洗涤时间不宜过长。
使用时应小心谨慎。
上述洗涤液可多次使用，但使用前必须将待洗涤的玻璃器皿先用水冲洗多次，除去肥皂液、去污粉或各种废液。
若仪器上有凡士林或羊毛脂时，应先用软纸擦去，然后再用乙醇或乙醚擦净。
否则会使洗涤液迅速失效。
例如肥皂水、有机溶剂（乙醇、甲醛等）及少量油污物均会使重铬酸钾-硫酸液变绿，降低洗涤能力。
（4）细胞培养级玻璃器皿的洗涤处理
1按上述方法对玻璃器皿进行初洗，晾干。
2将玻璃器皿浸泡入洗液中，24~48h。
注意玻璃器皿内应全部充满洗液，操作时小心勿将洗液不溅到衣服及身体各部。
3取出，沥去多余的洗液。
4自来水充分冲洗。
5排列6桶水，前3桶为去离子水，后3桶为去离子双蒸水。
6将玻璃器皿依次过6桶水，玻璃器皿在每桶中过6~8次。
7倒置，60℃烘干。
8用硫酸纸包扎，160℃干烤3h。
2、溶液的配制
1）苯酚标准储备溶液的配制（母液）
称取0.4000g分析纯苯酚，用去离子水溶解后转移到100ml容量瓶中，移取5.00ml于另一个100ml容量瓶中，用去离子水定容，置于冰箱中保存，此溶液含苯酚200μg/ml。
2）苯酚标准系列溶液的配制（操作液）
取7个50mL洗净的容量瓶，先贴上标签，并注明名称、浓度、时间、配制人员，并编号，再分别加入0.00，1.00，2.00，4.00，6.00，8.00，10.00mL的苯酚（200μg/ml）的标准溶液，用去离子水稀释到刻度，摇匀。
3）未知样品的配制
从所选取的监测断面利用采水器采集废水试样，尽快送入实验室进行预处理，处理好后装入试剂瓶，保存备用。
吸取以上处理后的样品溶液10ml，于50ml容量瓶中，用去离子水稀释到刻度，摇匀。
然后贴上标签并注明名称、浓度、时间，配制人员。
（二）样品的测定
1、绘制吸收光谱曲线，确定最大吸收波长
移取苯酚标准溶液2.00ml于50ml容量瓶中，定容，摇匀，取适量倒入石英比色皿中，以去离子水为参比溶液，在一定波长范围内进行扫描，绘制苯酚的吸收曲线，由吸收曲线确定最大波长λmax。
注意！
可见光测定时用玻璃比色皿，紫外光测定时用石英比色皿。
比色皿中切勿承装腐蚀性液体。
取用比色皿时，手不能接触透光面。
2、绘制苯酚溶液工作曲线，计算未知样品浓度
在最大波长处测定不同浓度苯酚的标准样品的吸光值，并绘制标准曲线。
再在相同的条件下测定未知样品的吸光度值用1cm石英比色皿，用去离子水作参比，在测得的最大波长下，分别测定标准系列溶液和未知液的吸光度，以吸光度对浓度作图，作出工作曲线。
根据标准曲线可得出未知样品中苯酚的含量。
3、实验完毕
取出暗箱中的吸收池，关闭暗箱，关闭电源，然后清洗吸收池、容量瓶、烧杯等器具并置于对应置放处，最后整理现场。
五、结果记录及实验数据处理
1.绘制苯酚的吸收光谱曲线图
2.绘制苯酚的A-c工作曲线图
3.利用工作曲线，由试样的测定结果，求出试样中苯酚的含量。
附表
数据记录表
1#
2#
3#
4#
5#
6#
7#
8#
9#
加入量（V/mL）
浓度（mol/L）
吸光度（A）
加入量：
即苯酚标准操作液的加入量
9#为未知样品
升级会员 