分诊思考题567810.docx

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分诊思考题567810

第五章

1.如何理解PCR原理及过程？

该技术基本原理类似于DNA的天然复制过程，是在引物、Dntp和模板DNA存在下，由DNA合成酶催化的DNA合成反应。

DNA聚合酶以单链DNA为模板，通过人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成双链。

在一定的条件下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3’-OH末端，沿模板5’-3’方向延伸，形成一条新的DNA互补链。

过程：

（1）变性，将DNA加热至95℃左右，DNA双链发生解离，形成单链

（2）退火（复性），将温度降到55℃左右，引物与单链DNA中的互补序列配对结合，形成引物-模板的局部单链

（3）延伸，将温度上升到70℃左右，DNA模板-引物结合物在DNA聚合酶的作用下，以四种脱氧核糖核苷酸为反应原料，以靶序列为模板，按照碱基互补配对原则与半保留复制原理，合成一条与模板链互补的新DNA链。

2.PCR反应的五要素有哪些？

PCR反应中五要素如何选择？

五要素：

模板、引物、dNTP、TaqDNA聚合酶和缓冲液

（1）模板（Template）

①可以是基因组DNA和RNA、质粒DNA和线粒体DNA

②模板DNA必须有较高的纯度

③RNA作为模板，须先将RNA逆转为cDNA

④常规PCR的模板DNA量一般仅需50-100ng左右

⑤体系中较低量的模板有利于提高扩增的产量和减少非特异性扩增。

（2）引物

引物是人工合成的一对能与两条模板DNA互补结合的寡核苷酸序列，一条为上游引物，一条为下游引物。

引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补程度。

①设在被扩增目的片段的双侧两端，并分别与模板正负链碱基序列互补。

②长度以15至30个核苷酸为宜。

③两条引物之间（尤其3¢-OH未端）的序列不能互补。

④引物的碱基组成应平衡，避免出现嘌呤、嘧啶碱基堆积。

C+G比例以45%-55%。

引物3¢端尤其要避免重复的CG碱基序列。

⑤PCR扩增的退火温度是根据引物的Tm值而决定的，两条引物的Tm值不能差别太大。

⑥据需要可在5端加修饰成分或标记分子。

⑦保证与其它靶序列无同源性；引物浓度一般为0.1-1µM之间。

（3）TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）

①水栖噬热菌（thermusaquaticus）中提取，热稳定性高。

②以DNA为模板，在引物3`-OH端加上dNTP，在两者间形成3`-5`磷酸二酯键，使DNA链沿5`→3`方向延伸。

③TaqDNA聚合酶缺乏3`→5`核酸外切酶活性。

在每一次循环中产生的移码突变率为1/30000，碱基替换率为1/8000。

④PfuDNA聚合酶,VentDNA聚合酶具有3`→5`核酸外切酶活性，具有较高的保真性，可使碱基错配率降低。

⑤50-100μl的PCR扩增体系一般需1-2.5U酶。

（4）脱氧核苷三磷酸（dNTP）

①dNTP是dATP、dCTP、dGTP和dTTP四种脱氧核苷三磷酸的混合物。

②反应体系中各种核苷酸的浓度必须一致。

③dNTP浓度一般为20-200M。

④降低dNTP的浓度可相应提高反应特异性。

（5）缓冲液Mg2+浓度

①Mg2+是TaqDNApolymerase不可缺少的辅助因子，可稳定扩增体系，提高酶活性。

②Mg2+浓度过低使酶活力降低，过高使酶催化非特异性扩增。

③通过实验优化PCR扩增条件，寻找Mg2+最佳反应浓度。

（6）其他因素

①酶缓冲液pH用10～50mMTris-HCl调整至8.3～8.8。

当温度上升至72℃，体系的pH约在7.2左右，使酶发挥最大酶促活性。

②PCR缓冲液中KCl的浓度为50mM，缓冲液可加BSA、Tween20、DTT等酶保护剂。

③扩增富含CG碱基序列时，可加入DMSO至终浓度为1g/L，利于破坏模板的二级结构。

也可用7-deaza-dGTP代替dGTP，避免二级结构的产生。

3.PCR循环次数是否越多越好？

降低退火温度对PCR反应有何影响？

不是。

循环次数一般为20-40次。

循环次数主要取决于最初靶分子的浓度。

过多的循环次数会增加非特异性产物量及碱基错配数。

退火温度：

保证PCR扩增特异性的前提，一般低于引物Tm5℃。

过低易产生非特异性扩增，提高退火温度可提高扩增的特异性，但也会降低扩增的效率。

4.引物设计原则有哪些？

如何确保设计引物的特异性？

①设在被扩增目的片段的双侧两端，并分别与模板正负链碱基序列互补。

②长度以15至30个核苷酸为宜。

③两条引物之间（尤其3¢-OH未端）的序列不能互补。

④引物的碱基组成应平衡，避免出现嘌呤、嘧啶碱基堆积。

C+G比例以45%-55%。

引物3¢端尤其要避免重复的CG碱基序列。

⑤PCR扩增的退火温度是根据引物的Tm值而决定的，两条引物的Tm值不能差别太大。

⑥据需要可在5端加修饰成分或标记分子。

⑦保证与其它靶序列无同源性；引物浓度一般为0.1-1µM之间。

5.简述荧光定量PCR的原理及方法，并举一实例说明其应用。

实时荧光定量PCR（real-timefluorenscencequantitativePCR）是指在扩增周期每个时间点（通常是每个循环结束后），通过检测荧光强度对PCR过程中产物量进行实时监测，并根据标准曲线算出PCR的初始模板量。

原理：

是在常规PCR基础上加入荧光化合物来实现其定量功能。

这些荧光化合物广义上可分为嵌入型荧光染料（反映核酸总量，非特异性）和特异性荧光探针（包括TaqMan水解探针技术、杂交探针技术、分子信标）两大类。

方法：

应用：

（基因表达水平的定量分析、病原体的检测、基因突变及多态性分析、转基因产品的安全性检测）

6.简述MLPA技术的基本原理。

又称多重连接探针扩增PCR，MLPA技术融合了核酸分子杂交和PCR反应，是一种高通量的定性和定量分析的技术，反应需要一对引物和一对特殊的探针，其反应步骤包括杂交、连接、扩增和电泳检测。

第六章

1.试述核酸分子杂交的基本原理。

具一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA）在一定条件下（适宜的温度和离子强度），遵循碱基互补配对原则形成异质双链（DNA/DNA、DNA/RNA、RNA/RNA）的过程。

2.影响核酸分子杂交的因素有哪些？

（1）核酸探针的浓度和长度

（2）杂交的温度

（3）杂交液的离子强度

（4）杂交液中甲酰胺的浓度。

使Tm降低

（5）核酸分子的复杂性

（6）洗脱条件。

浓度、温度、时间和次数等

（7）促进试剂。

硫酸葡萄糖、聚丙烯酸、聚乙二醇等

3.一个良好的固相支持物应具备哪些特性？

（1）较强的核酸结合能力，

（2）与核酸结合后不影响探针分子的杂交。

（3）结合稳定、牢固，经杂交操作后不脱落或脱落较少。

（4）对探针非特异性吸附较少。

（5）具有良好的柔韧性，易于操作。

4.膜印迹杂交主要包括哪几种？

其检测目的各是什么？

Southern印迹杂交：

检测经凝胶电泳分离后转印至膜上的待测DNA分子

Northern印迹杂交：

检测经凝胶电泳分离后转印至膜上的待测RNA分子

斑点/狭缝杂交：

检测固定在膜上的DNA或RNA分子

菌落原位杂交：

检测固定在膜上，经裂解由菌落释放出的DNA分子

5.试述Southern印迹杂交的基本步骤。

将待检测的DNA通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到固相载体上，固定后再与标记的DNA或RNA探针进行反应。

如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。

基本过程：

（1）限制性核酸内切酶消化待测DNA

（2）琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段（3）DNA变性、中和并转印至固相支持物（4）预杂交（封闭非特异性杂交位点）（5）特异DNA片段的分子杂交（6）杂交信号的检测及结果分析

6.试述核酸探针的种类及其制备。

核酸探针：

指能与特定核苷酸序列发生特异互补杂交，杂交后又能被特殊方法检出的已知被标记的核苷酸链。

（1）基因组DNA探针：

一般从基因文库中选取某一基因片段与载体连接，克隆后酶切得到。

制备方法简单，不易降解，标记方法成熟。

（2）cDNA探针：

它是以mRNA为模板,经逆转录酶催化而成。

不含内含子及高度重复序列,但不易获得。

适用于基因表达研究。

（3）RNA探针：

通常采用含T7或SP6启动子的表达载体来克隆、制备RNA探针。

杂交效率高，稳定性高，非特异性,未杂交探针可用RNase降解，减少本底的干扰。

易降解，标记方法复杂。

（4）寡核苷酸探针：

根据已知的靶序列，设计一段与靶序列特异性互补的序列，利用DNA合成仪人工合成。

可根据需要合成相应序列；探针短,序列复杂性低,分子量小，因此杂交时间短；能该识别序列内1个碱基的变化，可明显降低杂交Tm值。

制备方法简单，易标记。

7.核酸探针的标记方法有哪些？

其原理各是什么？

（了解）

（1）缺口平移法：

双链DNA在DNA内切酶，Mg2+存在下，将DNA一条链上随机切开若干个切口，切口处为3'末端。

DNA聚合酶I在3'末端逐个加入标记核苷酸，由于该酶具有5'-3'外内切酶作用，故同时在5’端的核苷酸逐个切除。

这样3'端和5'端同时进行，导致切口沿着DNA链移动而为缺口平移。

（2）随机引物法：

随机引物能与各种单链DNA模板结合，作为合成新链的引物，在DNA聚合酶的催化下，按5’-3’方向合成一新的DNA链，其核苷酸序列与模板DNA完全互补。

另一单链DNA模板同样合成一条新的完全互补的DNA链。

合成时，带放标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中。

（3）末端标记法：

末端标记只是对核酸序列一端（5’或3’端）进行标记。

特点是可得到全长DNA片段，但标记活性不高

（4）体外转录法：

以DNA为模板，利用体外转录系统进行RNA探针的制备和标记。

体外转录系统利用的是人工构建的质粒载体，含有RNA聚合酶识别的启动子。

（5）PCR标记法：

在PCR反应体系中，将其中一种标记了的dNTP加入。

经过扩增，标记的核苷酸掺入到DNA片断。

重复性，标记率高，简便快速大量制备。

8.试述非放射性探针的检测方法。

（1）荧光标记探针：

荧光显微镜观察

（2）酶标记探针：

直接底物显色（ALP显色体系—紫色，HRP显色体系，DAB-棕色）

（3）半抗原探针：

偶联反应+显色反应

9.试述荧光原位杂交探针的种类及其来源。

（上课没讲）

（1）染色体特异的重复序列探针

（2）染色体位点特异的单拷贝探针（3）染色体涂染探针

10.试述荧光原位杂交的基本过程。

（上课没讲）

（1）FISH标本制备

（2）探针的制备与标记（3）探针与样品核酸的变性（4）预复性与杂交（5）杂交结果的检测（6）荧光显微镜观察

第七章

1.试述DNA芯片的工作原理及制备。

原理：

又称基因芯片,是根据核酸杂交的原理，将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布来进行分析。

制备：

（1）载体选择与预处理

（2）探针制备（3）探针的打印（4）探针的固化

2.试述蛋白质芯片的工作原理及制备。

蛋白质芯片：

又称蛋白质微阵列，是指以蛋白质或多肽作为配基,将其有序地固定在固相载体的表面形成微阵列；用标记了荧光的蛋白质或其它分子与之作用，洗去未结合的成分，经荧光扫描等检测方式测定芯片上各点的荧光强度，来分析蛋白质之间或蛋白质与其它分子之间的相互作用关系。

3.生物芯片是如何分类的？

生物芯片：

（1）基因芯片（表达芯片、芯片实验室、测序芯片）

（2）蛋白质芯片（3）细胞芯片（4）组织芯片

4.什么是载片，一个理想的载片应具备哪些条件？

载片又称片基，是指用于连接、吸附或包埋各种生物分子并使其固相化并进行反应的固相材料。

一种理想的载片应该能够有效地固定探针，允许探针在载片表面与目标分子稳定地进行杂交反应，而且不会引起试验中信号的增强或损失。

5.DNA芯片的制备包括哪几个步骤？

制备：

（1）载体选择与预处理

（2）探针制备（3）探针的打印（4）探针的固化

6.SNP检测芯片技术的应用有哪些？

（没讲）

（1）病因探索

（2）个体化医疗

7.表达谱芯片、甲基化芯片、miRNA芯片的应用有哪些？

（没讲）

表达谱芯片：

（1）个体化医疗

（2）疾病的诊断（3）疾病发生机制的研究（4）耐药性分析（5）药物筛选及新药的研发

甲基化芯片：

对临床肿瘤发病的分子机制的研究具有重大意义。

miRNA芯片：

筛选肿瘤特异性miRNA、基因相关miRNA、表观遗传相关RNA、肿瘤耐药相关RNA及肿瘤治疗性相关miRNA上作出了巨大贡献。

8.目前，DNA芯片技术有哪些局限性？

（没讲）

9.什么是蛋白质芯片？

蛋白质芯片的分类及其应用有哪些？

蛋白质芯片：

又称蛋白质微阵列，是指以蛋白质或多肽作为配基,将其有序地固定在固相载体的表面形成微阵列；用标记了荧光的蛋白质或其它分子与之作用，洗去未结合的成分，经荧光扫描等检测方式测定芯片上各点的荧光强度，来分析蛋白质之间或蛋白质与其它分子之间的相互作用关系。

蛋白质芯片的分类：

（1）功能研究型蛋白质芯片，主要用于天然蛋白质活性以及分子亲和性的高通量平行研究

（2）蛋白质检测芯片（正相：

载片上是探针，反相：

载片上是样品）

10.什么是芯片实验室？

其有哪些优点？

是指把生物和化学等领域中所涉及的样品制备、生物与化学反应、分离检测等基本操作单位集成或基本集成于一块几平方厘米的芯片上，用以完成不同的生物或化学反应过程，并对其产物进行分析的一种技术。

第八章（不考问答啊）

1.双脱氧末端终止法的原理

将被荧光标记的ddNTP掺入到dNTP中，由于ddNTP随机掺入，PCR产物从引物之后的第一个碱基开始，每一个位置都有可能是ddNTP。

由于ddNTP缺乏链延伸所需要的3'-OH，链的延伸就选择性地在G、A、T或C处终止。

这样的PCR产物与普通PCR不一样，不能形成一条电泳带，而是一组长度相差一个碱基的成百上千种片段。

它们具有共同的起始点，终止在不同的的核苷酸上，每一个碱基都有相同的概率被终止。

将得到的不同大小的片段进行毛细管电泳，通过对荧光信号的采集和拼接，最终获得目的片段的序列

2.核酸测序技术临床应用

（1）人类基因组计划

（2）病原微生物鉴定

（3）药物筛选的应用：

指导肿瘤的个体化治疗、HBV耐药突变基因检测

（4）科研实验设计

（5）为第二代测序和芯片测序验证

（6）亲子鉴定或法医鉴定技术的基础

第十章

1.简述HBV核酸检测的常用技术。

（1）普通PCR技术

传统PCR方法检测HBVDNA的灵敏度可以达到ng级水平，检测结果能直接反应HBV病毒的复制程度，为临床提供从分子水平上对病原体进行诊断提供依据

（2）荧光定量PCR技术

荧光定量PCR法的应用，可以在在进行HBVDNA检测的同时使其进行相对的量化，这对于乙肝患者体内HBV的复制及传染性有更直接的了解，能准确地反映HBVDNA的复制水平、病程变化和治疗恢复情况等。

其特异性高，灵敏度可达0.01fg

2.HBV耐药性分析的临床意义是什么？

乙型肝炎病毒的耐药性分析在指导临床用药和监测病情等方面都具有重要意义。

3.HCV基因型检测的方法有哪些？

（上课没讲）

4.简述结核分枝杆菌的分子生物学检验与传统检验的区别，有何优点？

长期以来，结核病的实验室诊断主要依赖直接涂片抗酸染色镜检和罗氏培养检查。

图片染色镜检法具有简便、快速、成本低等优点，但其敏感性较低，受痰中细菌数量影响较大，且容易受到人为等外界因素的干扰。

培养法是结核病病原学诊断的“金标准”，精确可靠，特异性高，但所需时间较长，一般为4-8周，还需要培养箱等设备，且耗费的人力资源较多。

分子生物学检验方法有聚合酶链反应（PCR）、Real-timePCR、染色体核酸指纹法、线性探针杂交法、16s～23srDNA（rRNA）序列法、基因芯片技术，均具有快速、特异性强和灵敏度高的特点。

5.沙眼衣原体的分子生物学检验与传统检验的区别，有何优点？

（上课没讲）

6.HPV分型的分子生物学检验方法和种类有哪些？

（1）核酸杂交 

采用核酸杂交技术检测HPVDNA，具有较强的特异性，并可以分型。

目前常采用HCII技术、核酸杂交技术与PCR相结合的方法，能获得最佳检测结果。

①HC-II检验系统：

原理是利用对抗体捕获信号的放大和化学发光信号的检测。

②核酸杂交技术与PCR结合法：

常用通用引物-PCR（GP-PCR）反向线性杂交技术、分子导流杂交技术和PCR酶标微孔板杂交技术。

③侵染检测技术

（2）PCR技术

①GP-PCR法

②实时定量PCR法

（3）基因芯片技术

（4）流式荧光液芯技术

（5）飞行时间质谱技术