中国科学院大学生物单分子技术张竹青考试总结.docx

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中国科学院大学生物单分子技术张竹青考试总结

一.单分子技术

单分子技术是指在单分子水平上对生物大分子的行为（包括构象变化、相互作用、相互识别等）进行实时﹑动态检测以及在此基础上的操纵﹑调控等，是纳米技术和分子生物物理学的自然延伸和必然趋势。

生命单元的基本功能主要取决于单个大分子，单分子操纵方法在研究单个生物分子的性质上有着独特的优势。

与测量分子集合体整体性质的传统方法（如光散射，光偏振，粘滞性等）相比，单分子技术具有直接，准确，实时等优点。

主要的研究手段有两种：

1。

单分子光谱学（Single-moleculespectroscopy和Single-moleculeFRET）

2。

单分子力谱（AFM和光镊）

二荧光光谱

荧光光谱先要知道荧光，荧光是物质吸收电磁辐射后受到激发，受激发原子或分子在去激发过程中再发射波长与激发辐射波长相同或不同的辐射。

当激发光源停止辐照试样以后，再发射过程立刻停止，这种再发射的光称为荧光。

1荧光光谱

物体经过较短波长的光照，把能量储存起来，然后缓慢放出较长波长的光，放出的这种光就叫荧光。

如果把荧光的能量--波长关系图作出来，那么这个关系图就是荧光光谱。

荧光光谱当然要靠光谱检测才能获得。

荧光光谱。

高强度激光能够使吸收物种中相当数量的分子提升到激发量子态。

因此极大地提高了荧光光谱的灵敏度。

以激光为光源的荧光光谱适用于超低浓度样品的检测，例如用氮分子激光泵浦的可调染料激光器对荧光素钠的单脉冲检测限已达到10-10摩尔/升，比用普通光源得到的最高灵敏度提高了一个数量级。

荧光光谱有很多，如原子光谱1905年，Wood首先报道了用含有NaCl的火焰来激发盛有钠蒸气的玻璃管，并得到了D线的荧光，被Wood称为共振荧光。

在Mitchell及Zemansky和Pringsheim的著作里讨论了某些挥发性元素的原子荧光。

火焰中的原子荧光则是Nichols和Howes于1923年最先报道的，他们在Bunsen焰中做了Ca、Sr、Ba、Li及Na的原子荧光测定。

从1956年开始，Alkenmade利用原子荧光量子效率和原子荧光辐射强度的测定方法，以及用于测量不同火焰中钠D双线共阵荧光量子效率的装置，预言原子荧光可用于化学分析。

1964年，美国的Winefordner和Vickers提出并论证了原子荧光火焰光谱法可作为一种新的分析方法，同年，Winefordner等首次成功地用原子荧光光谱测定了Zn、Cd、Hg。

有色散原子荧光仪和无色散原子荧光仪的商品化，极大地推动了原子荧光分析的应用和发展，使其进入一个快速发展时期。

荧光光谱包括激发谱和发射谱两种。

激发谱是荧光物质在不同波长的激发光作用下测得的某一波长处的荧光强度的变化情况，也就是不同波长的激发光的相对效率；发射谱则是某一固定波长的激发光作用下荧光强度在不同波长处的分布情况，也就是荧光中不同波长的光成分的相对强度。

2原子荧光光谱的产生

气态自由原子吸收光源的特征辐射后，原子的外层电子跃迁到较高能级，然后又跃迁返回基态或较低能级，同时发射出与原激发波长相同或不同的发射即为原子荧光。

原子荧光是光致发光，也是二次发光。

当激发光源停止照射之后，再发射过程立即停止。

3原子荧光光谱的分类

原子荧光可分为3类：

即共振荧光、非共振荧光和敏化荧光，其中以共振原子荧光最强，在分析中应用最广。

共振荧光是所发射的荧光和吸收的辐射波长相同。

只有当基态是单一态，不存在中间能级，才能产生共振荧光。

非共振荧光是激发态原子发射的荧光波长和吸收的辐射波长不相同。

非共振荧光又可分为直跃线荧光、阶跃线荧光和反斯托克斯荧光。

直跃线荧光是激发态原子由高能级跃迁到高于基态的亚稳能级所产生的荧光。

阶跃线荧光是激发态原子先以非辐射方式去活化损失部分能量，回到较低的激发态，再以辐射方式去活化跃迁到基态所发射的荧光。

直跃线和阶跃线荧光的波长都是比吸收辐射的波长要长。

反斯托克斯荧光的特点是荧光波长比吸收光辐射的波长要短。

敏化原子荧光是激发态原子通过碰撞将激发能转移给另一个原子使其激发，后者再以辐射方式去活化而发射的荧光。

激光扫描共聚焦显微镜

1激光扫描共聚焦显微镜简介

仪器名称（中文）：

激光共聚焦显微成象系统

激光共聚焦扫描显微镜（Confocallaserscanningmicroscope，CLSM）用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。

系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。

调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。

激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量,配合焦点稳定系统可以实现长时间活细胞动态观察。

2用途和信息

主要用途：

1．细胞及生物荧光样品观察分析。

2．绿荧光蛋白分析。

3．荧光原位杂交分析。

4．光切片扫描。

5．3D图像处理。

6.时间序列拍摄成像.

仪器类别：

0304010104/仪器仪表/光学仪器/显微镜/研究生物显微镜

指标信息：

1．共聚焦2．多通道激光检测：

例如氩离子激光器488nm，HeNe（G）激光器543nm，HeNe（R）激光器633nm等。

3．点扫描。

4．高分辨率。

5．高清晰图像可达4096X4096Pixel。

激光扫描共聚焦显微镜（Confocallaserscanningmicroscope，CLSM）是近代最先进的细胞生物医学分析仪器之一。

它是在荧光显微镜成像的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光或可见光激光荧光探针，利用计算机进行图像处理，不仅可观察固定的细胞、组织切片，还可对活细胞的结构、分子、离子进行实时动态地观察和检测。

目前，激光扫描共聚焦显微技术已用于细胞形态定位、立体结构重组、动态变化过程等研究，并提供定量荧光测定、定量图像分析等实用研究手段，结合其他相关生物技术，在形态学、生理学、免疫学、遗传学等分子细胞生物学领域得到广泛应用。

3激光共聚焦显微镜的应用领域

多重荧光影像（Multi-ColorFluorescenceImaging）

3D立体影像重建（3DReconstruction）

3D动态影像获取与分析（Dynamic3Dimaging）

神经立体分布影像（3DNeuronimaging）

形态与动态分析（Morphology）

次微米单晶荧光影像技术（Nano-crystal）

多重荧光蛋白影像技术（Multi-ColorGFPImaging）

荧光共振能量转移（FRETorFLIM,FRAP））

细胞离子流定量分析（CellularIonConcentrationandRatioImaging）

长时间影像记录（Time-LapseRecording）

Z轴扫描与测量（Z-sectionandmeasurement）

基因影像分析（GeneticFISHimagingandquantification）

染色体多重荧光原色表现（Chromosomespectralanalysis）

活体胚胎研究（Embryo,Zebrafish/Drosophilaembryo）

穿透光影像/反射光影像

材料表面分析（Surfaceandroughnessanalysis）

材料显微硬度分析（Micro-Hardnessanalysis）

晶园分析（Waferanalysis）

薄膜分析（Thinlayeranalysis）

4.共聚焦扫描显微镜的成像原理

采用点光源照射标本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜收集，并沿原照射光路回送到由双向色镜构成的分光器。

分光器将荧光直接送到探测器。

光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。

两者的几何尺寸一致，约100-200nm；相对于焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点通过一系列的透镜，最终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔。

这样，来自焦平面的光，可以会聚在探测孔范围之内，而来自焦平面上方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像。

以激光逐点扫描样品，探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，转为数字信号传输至计算机，最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面的共聚焦图像。

每一幅焦平面图像实际上是标本的光学横切面，这个光学横切面总是有一定厚度的，又称为光学薄片。

由于焦点处的光强远大于非焦点处的光强，而且非焦平面光被针孔滤去，因此共聚焦系统的景深近似为零，沿Z轴方向的扫描可以实现光学断层扫描，形成待观察样品聚焦光斑处二维的光学切片。

把X-Y平面（焦平面）扫描与Z轴（光轴）扫描相结合，通过累加连续层次的二维图像，经过专门的计算机软件处理，可以获得样品的三维图像。

即检测针孔和光源针孔始终聚焦于同一点，使聚焦平面以外被激发的荧光不能进入检测针孔。

激光共聚焦的工作原理简单表达就是它采用激光为光源，在传统荧光显微镜成像的基础上，附加了激光扫描装置和共轭聚焦装置，通过计算机控制来进行数字化图像采集和处理的系统。

全内反射荧光显微镜

1概念

全内角反射荧光显微镜（totalinternalreflectionfluorescencemicroscope，TIRFM），利用光线全反射后在介质另一面产生衰逝波的特性，激发荧光分子以观察荧光标定样品的极薄区域，观测的动态范围通常在200nm以下。

因为激发光呈指数衰减的特性，只有极靠近全反射面的样本区域会产生荧光反射，大大降低了背景光噪声干扰观测标的，能帮助研究者获得高质量的成像质量和可靠的观测数据。

故此项技术广泛应用于细胞表面物质的动态观察。

2光学原理

当一束光从光密介质进入光疏介质时，根据斯涅耳定律一部分光会发生折射，

而一部分光会发生反射，当入射角度不断增大，折射角也会不断增大，当折射角刚好达到90度时，就发生了全反射现象。

全反射发生后，折射光有一个临界状态沿着折射面传播，这部分光我们称之为隐失波，其能量在Z轴上呈现指数衰减。

3技术分类

TIRFM的实现是通过改变激光的入射角来实现的，按技术TIRF显微镜分为两种：

棱镜型和物镜型。

棱镜型TIRF显微镜采用棱镜产生衰逝波，并用物镜收集荧光成像。

物镜型TIRF显微镜采用大数字孔径物镜产生衰逝波，同时采用物镜收集荧光成像。

与棱镜型TIRF显微镜相比，物镜型TIRF的应用更为广泛。

4优势

将高清晰图像与使用简便的系统，以及广泛的宽视野显微镜应用相结合。

研究者使用该显微镜除了可以完成从高速成像到TIRF的日常试验之外，还可以获得超清的影像。

独特的全内反射荧光功能

独特的全内反射荧光功能可在多色实验过程中，通过改变波长以智能方式弥补穿透深度，对消散的视野方向进行全自动校准和选择，以确保获得质量最佳的全内反射荧光图像与可靠的实验数据。

动态扫描仪

动态扫描仪可精确定位激光束，并决定消散视野的准确穿透深度。

缩短培训时间

使用一些特殊的荧光软件如徕卡AF7000荧光软件可全面控制全内反射荧光系统，包括校准与所有显微镜功能，确保减少培训的时间以尽快投入到科学研究中。

高级荧光工作站

完全集成的全内反射荧光系统可与徕卡显微系统有限公司的高级荧光工作站结合使用，以在有多位用户的实验室中，满足各种成像需要。

高质量图像

联合全内反射荧光（TIRF）与快速荧光共振能量转移（FRET）分析技术，适用于细胞膜分析或单分子结构分析；小泡跟踪、荧光活细胞成像或延时成像与其它功能确保生成高质量的图像，从而显著提高了科学研究的结果。

近场光学显微镜

近场光学显微镜是采用亚波长尺度的探针在距离样品表面几个纳米的近场范围进行扫描成像的技术。

如利用孔径在20-90nm的近场探针在样品上进行扫描而同时得到分辨率高于衍射极限的形貌像和光学像的显微镜。

传统光学显微镜的分辨率受到光学衍射极限影响，分辨率不超过该波长尺度范围。

与传统光学显微镜不同的是，近场光学显微镜利用亚波长尺度探针，可以得到更小分辨率。

荧光共振能量转移

当一个荧光分子（又称为供体分子）的荧光光谱与另一个荧光分子（又称为受体分子）的激发光谱相重叠时，供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光，同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减。

FRET程度与供、受体分子的空间距离紧密相关，一般为7～10nm时即可发生FRET;随着距离延长，FRET呈显著减弱。

供体和受体之间FRET的效率，可以由E=1/1+（R/R0）exp6反映，其中R表示供体和受体之间的距离，R0表示福氏半径，依赖供体发射谱和受体激发谱的重叠程度，以及供体和受体能量转移的偶极子的相对方位。

1发生原理

荧光共振能量转移是指在两个不同的荧光基团中，如果一个荧光基团（供体Donor）的发射光谱与另一个基团（受体Acceptor）的吸收光谱有一定的重叠，当这两个荧光基团间的距离合适时（一般小于100Å），就可观察到荧光能量由供体向受体转移的现象，即以前一种基团的激发波长激发时，可观察到后一个基团发射的荧光。

简单地说，就是在供体基团的激发状态下由一对偶极子介导的能量从供体向受体转移的过程，此过程没有光子的参与，所以是非辐射的，供体分子被激发后，当受体分子与供体分子相距一定距离，且供体和受体的基态及第一电子激发态两者的振动能级间的能量差相互适应时，处于激发态的供体将把一部分或全部能量转移给受体，使受体被激发，在整个能量转移过程中，不涉及光子的发射和重新吸收。

如果受体荧光量子产率为零，则发生能量转移荧光熄灭；如果受体也是一种荧光发射体，则呈现出受体的荧光，并造成次级荧光光谱的红移。

2发生条件

能量供给体－接受体（D–A）对之间发生有效能量转移的条件是苛刻的，主要包括：

（1）能量供体的发射光谱与能量受体的吸收光谱必须重叠；

（2）能量供体与能量受体的荧光生色团必须以适当的方式排列；（3）能量供体、能量受体之间必须足够接近，这样发生能量转移的几率才会高。

此外，对于合适的供体、受体分子在量子产率、消光系数、水溶性、抗干扰能力等方面还有众多的要求。

可见，要找到一个合适的D–A对是很不容易的。

衍射极限

衍射极限是指一个理想点物经光学系统成像，由于衍射的限制，不可能得到理想像点，而是得到一个夫朗和费衍射像。

因为一般光学系统的口径都是圆形，夫朗和费衍射像就是所谓的艾里斑。

这样每个物点的像就是一个弥散斑，两个弥散斑靠近后就不好区分，这样就限制了系统的分辨率，这个斑越大，分辨率越低。

这个限制是物理光学的限制，是光的衍射造成的。

点列图是指在几何光学的成像过程中，由一点发出的许多条光线经光学系统成像后，由于像差的存在，使其与像面的交点不再集中于一点，而是形成一个分布在一定范围内的弥散图形。

在点列图中利用这些点的密集程度来衡量光学系统的成像质量的方法称之为点列图法。

利用点列图法来评价照相物镜等的成像质量时，通常是利用集中30%以上的点或光线所构成的图形区域作为其实际有效弥散斑，弥散斑直径的倒数为系统的分辨率。

这个分辨率是由几何光学的像差限制的，没有考虑衍射效应。

衍射极限公式是sinθ=1.22λ/D。

其中θ是角分辨率，λ是波长，D是光圈直径。

当θ很小时，sinθ约等于tagθ，约等于d/f，其中d是最小分辨尺寸，f是焦距。

推导出d/f=1.22λ/D。

A=d/（1.22λ）。

A是光圈f/值。

当d等于成像元件像素点尺寸p时，A就是衍射极限光圈。

DLA=p/（1.22λ），也就是：

衍射极限光圈=像素尺寸/（1.22x光波波长）

PALM和STORM

如上所述，尽管单分子的定位精度可以达到纳米级，但它并不能提高光学显微镜在分辨两个或者多个点光源时的分辨率．2002年，Patterson和Lippincott-Schwartz[14]首次利用一种绿色荧光蛋白（GFP）的变种（PA-GFP）来观察特定蛋白质在细胞内的运动轨迹．这种荧光蛋白PA-GFP在未激活之前不发光，用405nm的激光激活一段时间后才可以观察到488nm激光激发出来的绿色荧光．德国科学家EricBetzig敏锐地认识到，应用单分子荧光成像的定位精度，结合这种荧光蛋白的发光特性，可以来突破光学分辨率的极限．2006年9月，Betzig和Lippincott-Schwartz等[2]首次在Science上提出了光激活定位显微技术（photoactivatedlocalizationmicroscopy,PALM）的概念．其基本原理是用PA-GFP来标记蛋白质，通过调节405nm激光器的能量，低能量照射细胞表面，一次仅激活出视野下稀疏分布的几个荧光分子，然后用488nm激光照射，通过高斯拟合来精确定位这些荧光单分子．在确定这些分子的位置后，再长时间使用488nm激光照射来漂白这些已经定位正确的荧光分子，使它们不能够被下一轮的激光再激活出来．之后，分别用405nm和488nm激光来激活和漂白其他的荧光分子，进入下一次循环．这个循环持续上百次后，我们将得到细胞内所有荧光分子的精确定位．将这些分子的图像合成到一张图上，最后得到了一种比传统光学显微镜至少高10倍以上分辨率的显微技术，如图1所示．PALM显微镜的分辨率仅仅受限于单分子成像的定位精度，理论上来说可以达到1nm的数量级．2007年，Betzig的研究小组更进一步将PALM技术应用在记录两种蛋白质的相对位置[15]，并于次年开发出可应用于活细胞上的PALM成像技术来记录细胞黏附蛋白的动力学过程[16]．

PALM的成像方法只能用来观察外源表达的蛋白质，而对于分辨细胞内源蛋白质的定位无能为力．2006年底，美国霍华德-休斯研究所的华裔科学家庄晓薇实验组开发出来一种类似于PALM的方法，可以用来研究细胞内源蛋白的超分辨率定位．他们发现，不同的波长可以控制化学荧光分子Cy5在荧光激发态和暗态之间切换，例如红色561nm的激光可以激活Cy5发射荧光，同时长时间照射可以将Cy5分子转换成暗态不发光．之后，用绿色的488nm激光照射Cy5分子时，可以将其从暗态转换成荧光态，而此过程的长短依赖于第二个荧光分子Cy3与Cy5之间的距离．因此，当Cy3和Cy5交联成分子对时，具备了特定的激发光转换荧光分子发射波长的特性．将Cy3和Cy5分子对胶联到特异的蛋白质抗体上，就可以用抗体来标记细胞的内源蛋白．应用特定波长的激光来激活探针，然后应用另一个波长激光来观察、精确定位以及漂白荧光分子，此过程循环上百次后就可以得到最后的内源蛋白的高分辨率影像，被他们命名为随机光学重构显微技术（stochasticopticalreconstructionmicroscopy,STORM）[3]．2007年，他们进一步改进STORM技术，发展了不同颜色的变色荧光分子对，可以同时记录两种甚至多种蛋白质的空间相对定位，从而阐明笼形蛋白clathrin形成的内吞小泡与细胞骨架蛋白之间的精确空间位置关系，两种颜色的分辨率都可以达到20～30nm[17]．但是，STORM方法也存在缺陷，由于用抗体来标记内源蛋白并非一对一的关系，所以STORM不能量化胞内蛋白质分子的数量，同时也不能用于活细胞测量．

STORM成像基础

1．1单分子定位

对物体成像虽然受限于显微镜分辨能力，但对于荧光分子定位分析只要有足够的光子数（N）被接收，分析荧光激发光子光强分布的中心可以实现高精度的粒子定位［11］。

粒子中心在适当条件下，相当于单个染料分子的位置，能够以超过光学分辩能力的精度定位。

主要的方法就是曲线拟合成高斯函数，也就是点扩散函数（PSF），基本目的就是寻找这个曲线分布的中心或平均值μ=（x0，y0）以及它的精度，即平均标准偏差σμ。

每个染料粒子的中心可式中C（x，y）是CCD探测器像元间互相关函数;α，β是接收光子的帧频数;I为（x，y）位置的光强度;K（i，j）为光强分布的内核部分;s是内核像素的平均强度;T为分析重心位置的阈值。

粒子中心的定位精度，即平均标准偏差σμ与接收光子数量N﹑图像探测器像元尺寸a﹑背景的标准差b（包括背景荧光噪声和探测器噪声）和PSF的分布宽度（thefull-widthathalfmaximum，FWHF）si（标准差，k为方向x或y）之间的关系，由Thompson等人［13］给出了二维定位精度的结果，公式（3）为定位精度表达式。

存在的问题和解决的途径

目前，STORM技术在成像上的横向分辨率可达20nm左右，虽然其分辨率已经远超过目前商用的各种显微成像系统，但还没有达到完美状态，即使对固定样本成像其分辨率也没有达到与电子显微镜相媲美的几个纳米的分辨能力。

为了进一步提高STORM成像的分辨率，一方面要开发出量子效率更高、荧光更稳定、颜色不同的荧光蛋白或荧光染料。

此外，由于STORM显微镜每次定位一个荧光分子，即在采集一幅图像时只有一个荧光位置被采集，而且为了保证足够高的定位精度，要收集足够的光子数量，所以要对衍射极限内所有荧光都按照这样的程序成像后重建出一幅完整的衍射极限内的图像，所需时间较长，大约要几分钟，只能研究固定的或时间分辨率要求不高的生物样品。

由于生命现象是非静止的活动的本质，STORM成像的时间分辨率是对细胞生物学的研究最大的障碍。

因此，当前的研究热点集中在通过改变荧光探针和成像模式来进一步提高超分辨成像的时空分辨率，以便用于活细胞的研究。

要解决这个问题还有较长的路要走。

在目前的技术手段下，为了提高时间分辨率，一方面可以采用时分复用技术即在相同时刻，同时定位不同位置的荧光分子。

另一方面，为了解决收集足够多的光子数量的问题，要开发新型的、高通亮的光可控开关荧光分子，使单位时间内激发地荧光光子数量大幅度提高，缩短光子采集时间，还可以采用光中继来实现提高光子接收数量的问题［24］，具体方法如下:

因为荧光信号具有一定的光谱宽度，而且波段大多集中在可见光和近红外波段，采用具有全谱带放大能力的拉曼放大对荧光光子进行放大比较理想，光纤拉曼放大器基于受激拉曼散射机制，以传输光纤作为增益介质，具有增益波长由抽运波长决定，噪声系数低，良好的宽带放大特性，可以对弱荧光进行放大提高光子输出的数量，消除了高帧频下接收光子数量少的问题，可以实现高时空分辨的成像。

STORM成像技术

单分子定位为获得亚衍射极限的空间分辨率提供可能，只要收集足够多的光子数量，一个单发射体（荧光分子）可以高精度地决定其中心位置。

基于这个理论，在室温下获得1nm精度的荧光成像技术已经被证明。

但1nm定位精度不是直接转换为成像分辨率，因为多个靠近的发射体仍很难区分，这个问题可以用光可控开关技术来区分他们各自的信号［18］，但这些手段也只能在衍射极限范围内分辨2～5个荧光分子。

若要分辨更多的荧光分子依然存在一定的挑战。

Zhuang等人开发了一种新型的高分辨成像技术，随机光重建显微镜（STORM），使用不同颜色的光开关高精度的独立荧光分子重建得到荧光图像。

STORM成像过程包括一系列的成像循环，在每个循环中视场中只有一部分荧光分子被激发，产生荧光发光，这个激活的荧光分子可以从其他未被激活的荧光分子中分辨出来，这些图像不重叠，这就可以使得这些荧光分子被高精度地定位。

重复多次这样的循环，每个荧光分子都随机地被激发，记录，所有的荧光分子位置信息再通过光学重建出来。

STED

不管是PALM还是STORM的超分辨率成像方法，其点扩散函数成像仍然与传统显微成像一致．由于需要反复激活-猝灭荧光分子，所以使得实验大多数在固定的细胞上完成．即使是在活细胞上进行的实验，其时间分