菠萝蛋白酶的提取纯化与化学修饰对其活性的影响.docx
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菠萝蛋白酶的提取纯化与化学修饰对其活性的影响
菠萝蛋白酶的提取纯化及化学修饰对其活性的影响
一、实验目的
1、掌握从原料物中提取活化分离菠萝蛋白酶的方法。
2、学习酶活力测定的方法。
3、了解某些因素对菠萝中菠萝蛋白酶热稳定性的影响。
4、掌握用聚乙二醇对菠萝蛋白酶进行化学修饰的原理。
5、比较修饰酶与未修饰酶的活力。
二、实验原理
菠萝蛋白酶（Bromelain，简称菠萝酶，亦称为凤梨酶或凤梨酵素）是从菠萝果茎、叶、皮提取出来，经精制、提纯、浓缩、酶固定化、冷冻干燥而得到的一种纯天然植物蛋白酶。
分子量为33000,等电点为9.55，白色至浅棕黄色无定形粉末，溶于水。
水溶液无色至淡黄色，有时有乳白光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚。
属糖蛋白，能分解蛋白质、脂类和酰胺等。
品质最佳的菠萝蛋白酶是利用菠萝的中茎加工,采用超滤方法进行过滤浓缩,低温冷冻干燥而得的。
它作为一种食品添加剂可用于肉质嫩化、啤酒澄清.还用于明胶、水解蛋白的生产,在医药上它可在生物体内溶解纤维蛋白及血凝块。
因此可以治疗水肿及多种炎症,它能迅速溶痂。
对正常组织无害,不影响植皮,适用于中小面积深度烧伤的治疗。
1、本实验先从新鲜的菠萝汁中使用单宁沉淀法提取出菠萝蛋白酶，菠萝蛋白酶将酪蛋白水解产生酪氨酸，通过测定吸光度的变化，可以测得菠萝蛋白酶的活力。
2、本实验采用离子交换技术纯化菠萝蛋白酶。
与化学方法相比，它分离条件温和，不引起分子结构的变化。
它用于纯化菠萝蛋白酶的关键问题是选择合适的交换树脂及相应的交换条件。
3、菠萝蛋白酶活性单位的定义：
一个酶活力单位（U）定义为特定条件下[pH7.0，（37±1℃）]酶作用于干酪素底物1min产生1μg酪氨酸所需的酶量。
菠萝蛋白酶将酪蛋白分解，生成在三氯乙酸溶液中不沉淀的多肽，并在275nm处有吸收峰，除去未被消化的酪蛋白，用分光光度计（275nm）测定溶液中所含肽的数量。
菠萝蛋白酶酶活计算公式参照何铁剑的方法[91]。
每毫升酶液活性单位（U/ml）=A-A0/Aw×M标×V/t×样品稀释倍数/供测体积式中：
（A-A0）为275nm波长下待测酶液与对照的光密度差值；Aw指以水为对照，275nm波长下50μg/mL标准酪氨酸光密度值；M标为标准酪氨酸溶液浓度；V为反应体系总体积（mL）；t为反应时间10min。
4、修饰的菠萝蛋白酶对温度和pH值的稳定性均比天然酶有很大程度的提高。
菠萝蛋白酶是一种巯基蛋白酶,但它的稳定性较差,影响了它的应用。
此外,菠萝蛋白酶易受有关因素的影响而失活。
聚乙二醇（PEG）为一种无毒且具亲水性的免疫惰性大分子，本实验采用聚乙二醇对菠萝蛋白酶进行修饰,提高了其对环境的稳定性,使其半衰期延长。
三、实验材料
（一）试剂和材料
1、新鲜菠萝（0.735kg）
2、0.1mg/ml牛血清蛋白柠檬酸钠、单宁、0.1%EDTA溶液、1.5%氯化钠溶液、1%酪蛋白溶液、1mol/L氢氧化钠溶液、0.05mol/L磷酸缓冲液、激活剂、考马斯亮蓝、Brolain试剂、0.1mol/L柠檬酸盐缓冲液、PEG活性酯、50%乙二醇、50%甘露醇、50%葡萄糖溶液、50%甘油溶液
（二）实验仪器
榨汁机；离心机；紫外可见分光光度计（1cm石英比色皿）；恒温水浴锅（37℃）；试管、试管架；烧杯、容量瓶；移液管；离子交换柱（250×10mm）；蠕动泵；自动部分收集器
四、实验方法
（一）从菠萝中提取、纯化菠萝蛋白酶
操作步骤：
将菠萝切碎→加柠檬酸钠，榨汁→菠萝汁→纱布过滤→澄清液→2000r/min，7min离心→上清液→加Vc,0.2%单宁溶液搅拌15min,静置40min4200r/min,5min离心→沉淀物→加100ml0.1%EDTA溶液，200ml1.5%氯化钠液→4200r/min,5min离心→酶复合物→加适量1.5%氯化钠溶液，4000r/min,7min离心→酶复合物沉淀→冻存备用
经预处理的强酸型阳离子树脂和经组氨酸修饰后的强碱型阴离子树脂分别装入250mm×10mm的离子交换柱和离子交换层析柱，柱的长径比为20∶1，将两柱串联。
在常温下依次操作：
加样：
略微增大层析柱出口的流速，排除凝胶床表面缓冲液。
打开层析柱顶塞，用移液管量取菠萝蛋白酶粗品溶液，从交换柱顶部加入，使其沿管壁从凝胶床表面上数毫米处缓慢流下。
加样时应先沿柱内壁转动一周，然后移至中心缓慢小心地将样品溶液加到凝胶表面，最好避免破坏凝胶，以保持凝胶表面平坦。
打开层析柱出口，让蛋白质样品溶液进入凝胶柱床内，待液面重合时，可用少许起始缓冲液洗柱内壁和床表面，关上层析柱出口。
洗脱：
加样后用足够量的起始缓冲液淋洗，使未吸附的物质被洗出，并达到充分平衡，在凝胶表面缓慢滴加洗脱液，加至洗脱液表面与柱口形成凸面，加入1MNaCl~20mMpH4.0醋酸缓冲液（含0.01%EDTA）以1mL/min流速，开始洗脱
部分收集：
用自动部分收集器收集部分洗脱流出液。
将洗脱液按一定的体积分别收集于试管中，收集各洗脱液，然后逐管进行分析。
检测：
洗脱流出液连续通过紫外检测仪，在选定波长下测定其吸光度A，并自动绘制洗脱曲线。
洗脱流出液经沉淀、干燥，得到菠萝蛋白酶精品。
（二）菠萝蛋白酶活力的测定
精确移取pH7.0的干酪素溶液5mL于15mL具塞的试管中，置于37℃恒温水浴中保温10min，准确取一定量的供试菠萝蛋白酶液，用酶液激活液（pH4.5用L-cys和EDTA-2Na配制）稀释至1mL，加入上述底物溶液中，摇匀，立即置入37℃恒温水浴中，准确反应10min，加入5mL三氯乙酸溶液，终止反应，用力混匀，在37℃恒温水浴中静置保温30min，待蛋白凝聚沉淀，然后冷却至室温，于3500rpm离心10min，取上清液于275nm波长下测其吸光度值A。
另取等体积的供试酶液，按上述步骤操作，对换酶液和三氯乙酸的加入顺序，测得的吸光度记为A0。
（3）物理及化学因素对菠萝蛋白酶稳定性的影响
菠萝蛋白酶酶活力测定采用连续测定法，以酪蛋白为底物，经菠萝蛋白酶水解后用紫外分
光光度计测定吸光值，每五分钟测定一次，大致表示为酶活性。
3.1、不同温度下的酶活性变化：
温度（℃）
15
25
40
50
60
70
吸光度值
3.2、不同PH值下得酶活性
PH值
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
吸光度值
3.3、在以上实验的相同条件下，在测定所用的酶试剂中分别加入1-2滴50%甘油溶液，然后与之前相同进行测定酶活性变化情况。
50%乙二醇、50%甘露醇、50%葡萄糖溶液之后与50%甘油溶液相同处理进行实验。
试剂
50%甘油溶液
50%乙二醇溶液
50%甘露醇溶液
50%葡萄糖溶液
吸光度值
（4）NEM修饰及修饰与未修饰酶的活性比较：
4.1修饰酶的制备
60gNEM溶于40ml干燥吡啶，加入1.01g琥珀酸酐，60度保温2h，在60度减压蒸馏除去溶剂。
加入苯至残余物溶解，再加100ml冷己烷，4度振荡2h。
过滤，残渣溶于蒸馏水后透析，冻干。
将其与菠萝蛋白酶按配比投料，加入0.1mol/L柠檬酸缓冲液（PH3.0），4度反应4h。
产物在PH4.6柠檬酸缓冲液中透析，冻干后得NEM-菠萝蛋白酶（修饰酶）。
4.2修饰与未修饰酶的活性比较
（1）分别取修饰酶与未修饰酶，溶解于0.05mol/L磷酸缓冲液中（PH7.0）至10ml，离心得上清液
（2）取15支试管，分为三组，每组5支，分别按下表操作：
组1：
试管号
1
2
3
4
5
所加试剂
未修饰酶（ml）
1
1
1
1
1
激活剂（ml）
0.9
0.9
0.9
0.9
0.9
1%酪蛋白（ml）
0.2
0.4
0.6
0.7
0.8
组2：
试管号
1
2
3
4
5
所加试剂
修饰酶（ml）
1
1
1
1
1
激活剂（ml）
0.9
0.9
0.9
0.9
0.9
1%酪蛋白（ml）
0.2
0.4
0.6
0.7
0.8
组3：
试管号
1
2
3
4
5
所加试剂
缓冲液（ml）
1
1
1
1
1
激活剂（ml）
0.9
0.9
0.9
0.9
0.9
1%酪蛋白（ml）
0.2
0.4
0.6
0.7
0.8
（3）混匀后，在37度水浴下反应10min，向15支试管中各加入8ml的1mol/L氢氧化钠溶液，摇匀，室温放置30min；
（4）分别取15支试管中溶液，在275nm波长下测定吸光度；
（5）数据处理
（5）结果
1、在酶试剂中加入甘油、乙二醇、甘露醇及葡萄糖等稳定剂后，酶变性速率减慢，酶活性下降趋势减缓。
未修饰酶的活力大于修饰酶的活力
2、在提取菠萝蛋白酶时,添加单宁溶液的浓度为0.2%沉淀蛋白的效果最好,同时果汁的总酸度不大,糖酸比合适,菠萝汁中菠萝蛋白酶的沉淀率达到72%。
菠萝蛋白酶提取时,pH值为6.5～8.5左右,温度为60℃,菠萝蛋白酶的活性最强,可作为最佳提取条件。
3、温度对浸提液中菠萝蛋白酶活性的影响较大，当浸提液温度超过50℃，浸提液中菠萝蛋白酶将明显失活．浸提液的pH对浸提液中菠萝蛋白酶活性有影响，在浸提液原始pH条件下，浸提液中菠萝蛋白酶稳定性最好．
4、理化因素影响的列表
（六）讨论
1、菠萝蛋白酶在提取分离和干燥过程中，酶的活性中心巯基易被氧化而使酶活性降低。
在提取过程中适当加入某些抗氧化剂，对阻止酶被氧化失活有良好作用。
作为菠萝蛋白酶活性保护剂，硫代硫酸钠与半胱氨酸组合使用，可获较好的效果。
2、维系酶分子三维构象的作用力包括:
氢键、疏水相互作用、静电相互作用、范德华力，有些还包括共价二硫键，蛋白质分子不管是变性、还是增强稳定性，都是通过影响这些作用力来实现的。
但总的来看，氢键、疏水相互作用在增强酶的稳定性方面起着主要作用。
3、TNBS法测定修饰率
取1mL蛋白酶溶液（1mgPmL）,加入1mL4%的碳酸氢钠溶液,1mL10%的十二烷基磺酸钠溶液,20min后加入1mL0.1%的TNBS溶液,40℃保温2h,用0.5mL1mol/L的盐酸终止反应。
325nm测光吸收值。
同样浓度蛋白酶溶液在修饰后与修饰前的光吸收值之比即为残留氨基率。
修饰率=1-残留氨基率=1-修饰后的光吸收值P修饰前的光吸收值
4若菠萝蛋白酶的比活力较低，可能的原因有：
（1）、所加入的有机酸单宁的量对菠萝蛋白酶沉淀有的影响；
（2）、在实验中是否把单宁溶液弄混而导致菠萝蛋白酶很少沉淀析出；
（3）、菠萝蛋白酶对热不稳定，试验中温度的控制是否合理；
（4）、在活力测定的步骤中所加入的酪蛋白的量不足，导致结果偏低；
（5）、在活力的测定步骤中，设置了几个梯度，最后的结果中应该有至少两支试管中的溶液的吸光度的值相同，但本组实验没有得到这种结果。
（6）、活力测定中，由于操作不当，导致部分沉淀溶解在了上清液中，溶液微浑浊，对吸光度的测定有影响。
5、糖类、多元醇一般被称为蛋白质的共溶剂．共溶剂的加入可改变溶液的热力学性质，使得酶的稳定性得到增强u引．上述结果表明，在实验范围内，甘油和葡萄糖对浸提液中菠萝蛋白酶具有较好的稳定作用．因此，在浸提操作时可适当添加入甘油和葡萄糖作为菠萝蛋白酶的稳定剂．
6、菠萝蛋白酶是巯基蛋白，依靠巯基维持活性，NEM可修饰巯基，使巯基被覆盖，因此NEM-菠萝蛋白酶的活性下降。
7、菠萝蛋白酶的各种提取方法的比较：
7.1高岭土吸附法
高岭土吸附法提取菠萝蛋白酶的主要工艺操作包括：
①压榨。
将菠萝下脚料洗净，用压榨机压出汁液，加入0.05％苯甲酸钠防腐，迅速过滤除杂质。
②吸附。
将汁液移入吸附槽中搅拌，同时加入4％的高岭土，搅拌约20min，在10℃吸附30~60min，用虹吸排掉上清液收集高岭土吸附物。
③洗脱。
用16％的NaOH溶液调节吸附物的pH值至7.0左右，再加入吸附质量为7~9％的食盐，搅拌30min，进行洗脱，然后迅速压滤，收集滤液。
④盐析。
将压滤液收集在盐析槽中，用1：
3的盐酸调节pH值至5.0左右，搅拌加入压滤液质量25％的硫酸铵，待完全溶解后，4℃下存放过夜；然后离心，收集沉淀盐析物，即粗酶。
⑤溶解。
将粗酶放入溶解罐中，加入10倍水，用NaOH溶液调pH值至7.0~7.5，搅拌使其溶解，过滤除
杂，收集滤液。
⑥沉淀、干燥。
在搅拌下用1:
3的盐酸调节上述滤液的pH值至4.0，静置1h使酶析出，用离心机分离出沉淀物，冷冻真空干燥或减压干燥即得菠萝蛋白酶精品。
工艺流程如图1所示。
高岭土吸附法生产工艺和操作都比较复杂，原材料消耗多，所需设备也多，酶活总回收率低，但产品质量较好，纯度较高，产品酶活可达4.0×106u/g上。
7.2单宁沉淀法
具体操作方法见实验方法
单宁沉淀法工艺和操作比高岭土法简单，原材料消耗少，所需设备少。
但酶活回收率较低，产品酶活力在3.5~4.0×106u/g之间。
7.3超滤法
超滤法提取菠萝蛋白酶的主要工艺操作包括：
①压榨。
将菠萝下脚料洗净，用压榨机压出汁液，加入0.05％苯甲酸钠防腐，迅速过滤除杂质。
可采用压滤法或离心法去杂质。
②超滤浓缩。
将澄清液在管式超滤设备中进行浓缩，使体积浓缩至原体积的1/5。
③沉淀。
将浓缩液降温至0~4℃，边搅拌边加入-20℃的95％乙醇，直至混合液中乙醇浓度为50％，静置，使酶沉淀，移出上清液，即得湿酶。
④干燥。
将湿酶在0℃下减压干燥或冷冻真空干燥即得菠萝蛋白酶精品。
工艺流程如图3所示。
超滤法生产工艺和操作比较复杂，且设备一次性投资大。
超滤浓缩后的浓缩液若再用高岭土吸附法或者单宁沉淀法提取，可大大节约其他辅助原料的用量，总生产成本减少，且产品质量好，纯度高，酶活力高，酶活总回收率高，经济效益明显比传统工艺好。
超滤浓缩后的浓缩液用有机溶剂沉淀法提取精酶，由于需要低温使生产成本上升，但产品质量、纯度、酶活都优于前者，是菠萝蛋白酶升级换代的新工艺。
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