分子平台项目书V.docx
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分子平台项目书V
食品药品检验检测中心
分子生物学平台建设项目书
尊敬的领导：
感谢贵单位给我机会向你们介绍分子生物学平台建设方案，该分子平台包含PCR电泳成像系统、荧光定量PCR仪、微滴式数字PCR系统、全自动病原微生物检测系统、脉冲场电泳系统，以及酶标仪洗板机、蛋白纯化系统、细胞分选系统等，通过有机结合，技术互补，实现目前行业内最领先最专业的分子检测技术，为食品药品安全提供整体的解决方案。
该分子平台可开展的应用与研究方向包括但不限于：
1、病原微生物快速检测、活菌定量检测、致病菌溯源
2、动物源性成分的定性与定量分析
3、转基因成分的定性与定量分析
4、中药材的真伪鉴别
5、生物制品的检测
6、药物安全评价
7、检测新技术的研究及试剂盒的开发等
一、分子平台应用实例3
1、食源性致病菌快速检测3
2、致病菌活菌定量检测7
3、致病菌溯源10
4、动物源性成分检测14
5、肉类及肉类制品中的成分掺假和虚标19
6、转基因成分定性与定量检测23
7、中药真伪鉴别32
8、生物制品检测37
9、药物安全评价43
二、主要仪器介绍44
1、PCR电泳成像系统44
2、CFX96Touch型荧光定量PCR系统45
3、QX200微滴式数字PCR系统46
4、iQ-Check全自动病原微生物检测系统47
5、脉冲场电泳系统48
6、蛋白纯化系统49
7、细胞分选系统50
三、分子平台推荐规划51
四、分子平台推荐配置52
一、分子平台应用实例
1、食源性致病菌快速检测
背景介绍
民以食为天，食品作为人们日常生活中不可或缺的一部分，它的安全关系到人类的生命安全和生存发展，而食源性致病菌是威胁到当前食品安全的重要因素之一。
虽然近年来由食源性致病菌引起食物中毒事件的报道数量有所减少，但是据美国CDC公布的检测报告显示，实验室检出食源性菌如沙门氏菌的概率并没有降低，因此食源性致病菌对公共健康的威胁仍不容小觑[1]。
传统检测方法虽然是食源性致病菌检测的“金标准”，但因其操作繁琐，需要耗费大量的人力、物力和时间，很难满足基层日常检测和执法需求。
特别在我国，一方面食品需求数量巨大，另一方面食品的加工生产却呈规模小、零散等特点，因此要保证我国民众的食品安全，提高抽样覆盖率是十分必要的。
如果使用传统的检测方法，无论从时间上还是经费上都无法满足食品抽检的需求。
因此，有必要研发和普及一些检测速度快、费用低、灵敏度高的快检技术来更好地应对和控制食源性疾病的爆发。
检测技术
目前，文献报道的食源性致病菌快检技术有很多，例如：
免疫学检测技术、代谢学检测技术、分子生物学检测技术、生物传感器检测技术等。
不同的检测技术各有特点，但是能满足检测速度快、费用低、灵敏度高、操作简单等特点，并适用于基层执法和检测需求的技术主要为免疫学检测技术和分子生物学检测技术。
其中，免疫学检测技术具有较好的特异性、灵敏性，检测效率高、费用低，对人员要求较低且不需要大型仪器等特点，因此目前应用得最为广泛。
但是免疫学检测技术也具有一定的局限性：
例如当待测样品中含有目标物的竞争性物质时，很可能会出现假阳性的检测结果；免疫学检测对反应体系环境要求较高，错误的选用试剂会直接造成检测失败等。
随着分子生物学技术的飞速发展，目前已经可以实现在分子水平上对食源性致病菌的鉴定。
其中最为便捷、快速和适用广泛的鉴定技术要数聚合酶链式反应技术（polymerasechainreaction，PCR）。
PCR技术起源于20世纪80年代，由美国的KaryMullis发明。
PCR技术主要是在体外合适条件下，以DNA（或RNA）为模板，以一对人工合成的寡核苷酸为引物在耐热DNA聚合酶作用下特异性扩增目的DNA片段的技术。
整个反应由20-45个循环组成，每个循环均包括高温变性、低温退火和适温延伸3个步骤。
近年来，用PCR技术检测食品中食源性致病菌的方法有很多种，如常规PCR、不对称PCR、免疫PCR、套式PCR、荧光实时定量PCR（qPCR）、多重PCR、逆转录PCR等。
2005年，范宏英等[2]运用多重PCR技术成功的将沙门氏菌、志贺氏菌、肠出血性大肠杆菌O157、绿脓杆菌和副溶血弧菌5种饮用水不得检出的致病菌同时快速检出。
2010年，程晓燕等[3]建立的SYBRGreenI实时荧光定量PCR检测对虾白斑综合征病毒的方法，取得了较好的实现效果。
目前，基于Taqman探针的荧光实时定量PCR检测技术已经被广泛应用于食品性致病菌的检测中，并制订了相应的检验标准。
在2016年新发布的《食品安全国家标准鲜（冻）畜、禽产品》（GB2707-2016）等127项食品安全国家标准中，同样涉及到了PCR及qPCR的检测技术。
因此，在前增菌和选择性增菌后，应用PCR技术可以对样品中是否含有食源性致病菌进行检测，这种检测技术的优势在于检测效率高、特异性好以及灵敏度高等。
标准编号
标准名称
SN/T1059.7-2010
进出口食品中沙门氏菌检测方法实时荧光PCR法
SN/T1870-2007
食品中致病菌检测方法实时荧光PCR法
SN/T2415-2010
进出口乳及乳制品中沙门氏菌快速检测方法实时荧光PCR法
GB4789.6-2016
食品安全国家标准食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验
GB4789.12-2016
食品安全国家标准食品微生物学检验肉毒梭菌及肉毒毒素检验
GB4789.42-2016
食品安全国家标准食品微生物学检验诺如病毒检验
表1.基于PCR技术进行食品致病菌检测的部分行标和国标
伯乐解决方案
美国伯乐（Bio-Rad）公司作为生命科学领域的领先者，一直致力为众多科学家解决实际科研应用问题，提供全套解决方案。
所推出的iQ-Check全自动病原微生物检测系统，包括核酸提取及经过认证的定量检测试剂盒、自动化工作站（可选）、定量PCR仪器和专业的分析软件，仅需一步增菌，在8-24小时内获得结果，为致病菌快速、准确检测提供了最佳解决方案，其具体特点如下：
1）检测项目：
配套18种常见的致病菌检测，包括：
沙门氏菌、大肠杆菌O157:
H7、产志贺毒素大肠杆菌、对O族的大肠杆菌进行确认和鉴定（检测7个主要的血清型：
O157:
H7，O111，O26，O103，O145，O45，O121）、单增李斯特氏菌、李斯特菌属、弯曲菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌、阪崎肠杆菌、军团菌、嗜肺军团菌和酒香酵母菌；其中军团菌、嗜肺军团菌和酒香酵母可进行定性和定量检测；对市面上其他厂家各种致病菌检测试剂盒兼容性好；
2）检测兼容性：
多种致病菌和检测项目可同时同机进行；
3）检测性能：
检测中含内标质控和阳性对照，内部质控指示没有假阴性反应，有效避免检测的假阴性，所有检测项目都为Taqman探针；
4）病原菌DNA提取：
专利的提取流程至少提取100ul增菌液，无需离心，一步即可提取DNA，提取时间15分至30分钟。
且可整合最新的FreeDNA去除处理方案，有效去除食品中死菌DNA干扰，尤其适合经过辐照、巴氏消毒处理或以噬菌体作为加工助剂等类型的食品样本；
5）仪器开放性：
此检测仪为开放性操作平台，厂家配备的检测试剂盒在2-24小时检测目标菌；非厂家配备试剂检测时间可能会有所延长；
6）检测灵敏度：
检测食品仅需一步增菌，检出限≤１CFU/25g；
7）检测通量：
94个样本加上2个对照；
8）定量PCR仪特点：
6通道检测，配备触控屏，可单机操作；
9）定量PCR仪温度控制：
具有动态温度梯度功能，可以同时运行8个不同的温度；
10）定量PCR仪温控准确度：
±0.2℃；温度均一性：
±0.4℃；
11）定量PCR仪最高升降温速率：
2.5℃/秒；
12）认证认可：
软件分析系统及试剂获得AOAC、AFNOR等国内、国际认证，结果自动判读：
直接读取“有”或“无”的结果；
13）扩展使用：
除可用于致病菌检测外，本系统还可应用于核酸定量、基因表达水平分析、基因突变检测、GMO检测及产物特异性分析、流行病学试验等多种检测、研究领域；
14）数据分析：
可以对病原微生物进行定性和定量检测，并可进行标准曲线的绘制，并有中文软件及免费升级；
15）质控功能：
每份测试的试剂内均自带质控功能，仪器能直接确认每一份测试的试剂质量
图1.Bio-RadiQ-Check全自动病原微生物检测系统
图2.iQ-Check手动及自动病原微生物快速检测流程
Reference
[1]BakthavathsalamP,RajendranVK,SaranU,etal.ImmunomagneticnanoparticlebasedquantitativePCRforrapiddetectionofSalmonella[J].MicrochimActa,2013,180:
1241-1248.
[2]范宏英,吴清,吴若菁,等.饮用水中5种致病菌多重PCR技术检测研究[J].微生物学通报,2005,32（3）:
102-107.
[3]程晓燕,刘庆慧,黄捷.实时荧光定量PCR检测对虾白斑综合征病毒方法的建立[J].安徽农业科学,2010,38（26）:
14265-14267.
2、致病菌活菌定量检测
背景介绍
从前面我们知道，食源性致病菌检测对于食品安全检测的重要性，而对于食品中活菌的定量检测才能真实反映出该样品的污染水平，因此如何避免一些经过辐照、巴氏消毒等处理后的样品中死菌的干扰而仅定量检测活菌含量就显得至关重要。
传统方法如分离培养法等不能满足快速检测的目的，而现有的致病菌基因检测方法如普通PCR、qPCR等常常无法有效识别食品中的活菌和死菌，导致假阳性的结果。
因此开发快速、准确的定量检测活菌的方法很有必要。
检测技术
目前，研究者们利用活菌和死菌细胞膜完整性不同，开发了EMA-qPCR/PCR和PMA-qPCR/PCR法。
其中，叠氮溴化乙锭（EMA）和叠氮溴化丙锭（PMA）是一种结合能和DNA共价交联的光敏材料，光照可以使EMA/PMA的光敏基团转化为氮宾自由基，其可以和DNA发生共价交联，进而阻断DNA分子的PCR扩增，并且这种染料只能选择性的渗透死菌的细胞膜，因此可被用于和PCR技术相结合定量检测活菌。
但是有研究发现，EMA具有细胞毒性，可进入部分活性细胞内影响检测结果，其应用受到限制，所以目前研究中更多采用无细胞毒性的PMA染料结合qPCR法定量检测食品中的活菌含量[1,2]。
除了qPCR技术外，数字PCR技术（digitalpolymerasechainreaction，dPCR）是近两年来新兴的生物分子检测技术，以一种全新的方法进行核酸分子的灵敏检测和绝对定量，与传统PCR、定量PCR相比，其结果的精确度、准确性和灵敏度均有大幅度提升，被称为“第三代PCR”技术，标志着PCR技术未来发展的方向。
伯乐解决方案：
结合PMA处理的微滴式数字PCR法
美国伯乐公司作为数字PCR技术的开拓者和领导者，开发和研制了最新型的QX200微滴式数字PCR（dropletdigitalPCR，ddPCR）系统，其技术原理是可将核酸模板、引物/探针等组成的荧光PCR反应体系均一等分为近2万份纳升级稳定的“油包水”微滴（微反应单元），等于将有限的目的模板进行近似于无限的稀释分开，在经过PCR扩增之后，含有模板的微滴会检测到荧光信号，其余微滴无阳性信号。
依据阳性液滴与液滴总数的比值，可按泊松分布规律推算出反应液中目的模板浓度，实现核酸检测的绝对定量。
数字PCR技术以其准确性好、灵敏度高、无需任何外参校准物质、可对样品核酸进行绝对定量等优势，已经在临床诊断、单细胞基因表达、环境微生物检测、二代测序结果验证和食品安全定量检测等方面得到了广泛的研究和应用。
图1.Bio-RadQX200微滴式数字PCR系统
商业化数字PCR仪的出现，克服了研究者们各自研究工作中操作复杂、重复性差、通量低等困难，实现了自动化和高通量的应用，从而进一步的推动和扩大了数字PCR技术的发展和应用范围，在食品安全检测领域获得了广泛的关注、引起了极大的研究热情并已经取得了可喜的成果。
董莲华等[3]用ddPCR建立了大肠杆菌O157:
H7的定量检测方法，定量检测限为4copies/20ul，定性检测限为3copies/20ul。
Rothrock等[4]将ddPCR与禽类加工行业现有常规两种检测方法qPCR和传统培养鉴定方法进行了比较，研究了在采用不同取样时间和取样方法时这三种检测方法得到的禽类加工设备中主要传染性致病微生物检测结果的差别。
结果表明，ddPCR能够从更早的从样本中，也能够更多的从不同的生产加工设备中检出病原菌的特异性基因，且定量检测结果与传统的病原菌培养鉴定检测方法一致。
在食品致病菌活菌检测中，威海及山东出入境检验检疫局的王静等[5,6]首次将PMA与ddPCR技术相结合，开发了高灵敏、高选择性的检测食源性致病菌的新方法。
可以在死菌存在的条件下定量检测沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏菌活菌，消除了“假阳性”结果的出现，利用脱氧胆酸钠（SD）对样品预处理，使得PMA更容易穿过死菌细胞膜。
SD-PMA-ddPCR整个过程快速简便，成功检测鸡肉等样品中沙门氏菌及单核细胞增生李斯特氏菌的含量（最低检出限为2copies/20ul体系）。
与基于qPCR的方法相比，具有准确度高、灵敏度高、不需要建立标准曲线等优点。
伯乐解决方案：
iQ-CheckFreeDNA去除方案
另外一种活菌检测的解决方法就是前面提到的iQ-Check食源性致病菌检测方案中采用的死菌FreeDNA去除方案，其原理是试剂盒中有一种可选择性识别游离DNA并将之降解的酶，只需在裂解细胞提取DNA前用此酶和相应缓冲液于37℃处理样品15-30分钟即可极大消除死菌DNA干扰，随后加入裂解液可失活此酶，不影响后续活菌DNA的提取。
较之PMA处理法，该方法能够极大地简化操作，提高效率，且易于整合进iQ-Check病原微生物检测流程中。
采用此方法处理后平均可降低源自死菌游离DNA的2-3个数量级（约6个Cq值）的结果干扰，极大地降低了假阳性结果的出现，为食源性致病菌活菌检测提供了便捷而有效的解决途径。
图2.iQ-CheckFreeDNA去除方案原理及流程
表1.比较不同含量李斯特死菌在经iQ-CheckFreeDNA去除处理前后的检测结果差异
Reference
[1]於颖,王文静,陆晔.PMA-qPCR定量检测畜禽肉类中沙门菌活菌的研究[J].检验医学,2015,30（5）:
500-506.
[2]徐义刚,李淑云,鞠文东,等.PMA结合定量PCR方法检测食品中活性志贺菌的研究[J].黑龙江畜牧兽医,2014,07:
206-208.
[3]董莲华,张玲,姜君,等.大肠杆菌O157:
H7微滴数字PCR定量方法的建立[J].分析化学,2015,43（3）:
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[4]RothrockMJ,HiettKL,KiepperBH,etal.QuantificationofZoonoticBacterialPathogenswithinCommercialPoultryProcessingWaterSamplesUsingDropletDigitalPCR[J].AdvancesinMicrobiology,2013,03（05）:
403-411.
[5]王静,张慧敏,魏玮,等.SD-PMA-ddPCR检测食品中沙门氏菌的研究[J].食品工业科技,2016,37（10）:
67-71.
[6]王静,刘玉敏,李春喜,等.SD-PMA-ddPCR检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌[J].微生物学通报,2016（10）.
3、致病菌溯源
背景介绍
由细菌、病毒、真菌等通过食物、环境接触等方式传播引起的感染性疾病，是食源性疾病中最重要的组成部分，每年在全世界爆发的食源性疾病中，由细菌等导致的感染占90％以上，严重影响、危害公众健康。
并且，随着全球贸易往来、旅游等活动日益频繁，该种感染经常呈现出跨国家、跨地域、跨省市的多地点、大范围的爆发，成为一种世界范围内的公共卫生问题。
因此，在快速确认致病菌种类的同时，及时对致病菌进行溯源分析是一项非常迫切而重要的任务。
只有找到了致病菌的来源，相关部门才能在源头上进行部署和控制，才能避免感染或中毒事件的进一步爆发和扩散。
针对上述问题，美国CDC于1996年开始建立PulseNet系统并成功应用。
该系统在暴发流行病的识别、分析、预警和改善加强控制措施中发挥了重要作用。
在2006年美国毒菠菜事件中爆发的大规模O157：
H7型致病病菌感染，就是利用了PulseNet快速鉴定和溯源的。
美国PulseNet在2008-2009年花生酱污染鼠伤寒沙门菌暴发疫情中，迅速查明传染源，召回问题食品，有效控制疫情蔓延
（1），PulseNet因此被列为21世纪公共卫生领域最具影响力的创新之一，获得美国科技创新奖
（2）。
我国在2004年9月正式启动了PulseNETChina。
在2003年C群流脑暴发处置和2005年猪链球菌感染暴发处置的过程中，PulseNetChina都起到了非常大的作用。
技术原理与实验流程
PulseNet系统利用标准化的PFGE（Pulsed-FieldGelElectrophoresis脉冲场电泳）技术，在实验室即可得到某种菌株或其亚型的分子分型的图谱，比如大肠杆菌O157、沙门氏菌、志贺氏菌、李斯特菌、弯曲杆菌和霍乱弧菌等，该图谱可以以图片的形式上传和分享，通过图谱中显示的差异条带与特异条带，就可以与PulseNET数据库中成千上万个类似的图谱进行比对。
通过分布在各地的网络实验室的实际检测结果，建立网络平台及时交流和比对数据，这样就可以对不同时间、地点爆发的疫情中得到的不同的分离株同时进行分析，从而评估食源性传染病发生的关联以及调查和快速鉴定暴发的来源（图1）。
图1，致病菌溯源分析示意图
PFGE技术是用于分离大分子量DNA片段的一种电泳方法。
仪器交替改变电场方向，大片段DNA在凝胶中不断重新定向，DNA分子越大，重排所需要的时间越长，DNA分子越小，所需时间越短，据此就可以按其大小分开（图2）。
图2，脉冲场电泳原理示意图
利用限制性核酸内切酶，将基因组DNA酶切成有限数目（10～20）的大分子量限制性片段之后，通过PFGE使这些限制性片段彼此分离，形成电泳图谱。
由于不同菌株的电泳图谱具有高度特异性，从而识别特异的菌株。
PFGE检测技术具有敏感、特异、分辨率高等特点，并且在实验操作中结果稳定、重复性好、已易于标准化，所以被称为细菌分子分型的金标准，也是目前世界上最为成功推广的技术。
世界各国的疾控系统在建立和使用PFGE技术的过程中，绝大部分都是使用BIORAD公司的脉冲场电泳设备和成像系统。
CHEFMapperXA系统是市面上最先进的脉冲场凝胶电泳系统，可以用在所有PFGE相关应用领域中。
它将CHEF、PACE、DR、FIGE和AFGE多种技术结合在一起，还能够提供“多矢量”功能和“二次脉冲”程序，使我们研究的所有片段大小范围的DNA分子都能得到最佳分离。
PFGE的实验流程如下（图3）：
菌株分离和接种。
在实验前一天做好菌株的平板培养，备用。
制备小胶块Plug。
挑取适量的菌体，用细胞悬浮液进行悬浮，同提前配置好的胶溶解在一起，利用模具进行灌胶，待胶凝固后，取出小胶块。
细菌裂解。
将小胶块放入提前配置好的裂解液中，在摇床上进行细菌的DNA裂解过程。
胶块清洗。
利用灭菌水将胶块反复清洗。
胶块内DNA的酶切。
选取特定的内切酶，对胶块进行酶切。
电泳。
先将小胶块切成合适大小后贴在电泳梳底端边缘，然后进行灌胶，胶凝固后将梳子拔出即可。
在电泳设备上设置好电泳的程序，将胶放入电泳槽，即可进行电泳实验。
图像获取。
电泳结束后利用成像设备对电泳结果进行拍照保存。
利用数据分析软件进行胶图的进一步分析。
图3，脉冲场电泳实验流程
电泳结束后，通过成像设备，我们可以得到检测样本的胶图（图4左），将该胶图导入数据分析软件之后，可以同其他样本的胶图进行分析比对，得到聚类分析的结果（图4右），进行溯源分析，确认该次致病菌的爆发源头。
图4，脉冲场电泳实验流程
案例
（1）2008年，黑龙江完达山药业的刺五加注射液由于细菌污染，导致3人死亡，多人出现严重不良反应，PFGE的方法在该起事件溯源调查中发挥了重要的作用。
（2）2011年，德国爆发了由肠出血性大肠杆菌O104:
H4感染的“毒黄瓜”事件，后蔓延至16个国家，50人死亡，4000多人受感染，PFGE分型对该事件的溯源分析提供了最可靠的实验室证据。
（3）2006年10月，美国爆发“毒菠菜”事件，共有26个州199人感染，其中102例（51%）住院，31例（16%）发展为肾衰竭，3例死亡。
通过PFGE的方法最终确定“自然选择”食品公司袋装菠菜中的O157：
H7为此次大肠杆菌感染事件的元凶。
Reference
（1）PezzoliL,ElsonR,LittleCetal.,InternationaloutbreakofSalmonellaSenftenbergin2007.EuroSurveill.2007;12（24）:
pii=3218.31July2008.
（2）LieftuchtA,ReacherM.CasecontrolstudyofSalmonellaparatyphiBinfectionassociatedwithtraveltoAlanya,Turkey:
update.EuroSurveill.1999;3（44）:
pii=1307.1August2008.
4、动物源性成分分析
背景介绍
“动物源性成分”的检测一直以来都是检验检疫部门的重点检测项目，直接关系到饲料安全、食品安全等公众健康热点问题。
动物源性副产品因富含蛋白质、钙等营养成分而被应用于畜禽饲料中，但现有证据表明，在动物饲料中添加未经加热处理牛源性饲料或感染过痒病因子的牛羊肉/肉骨粉后能够引发和传播疯牛病（BSE）,我国已经制定了多个对于动物源性饲料生产管理的相关条例。
另外，在食品领域，对于动物源成分的检测也是必不可少的。
古有“挂羊头卖狗肉”，而今，食品掺假、肉类掺假等丑闻在世界范围内层出不穷，比如2013年欧洲发生的“马肉风波”震惊全球，而在中国，各种肉类造假的新闻更是不绝于耳，屡见不鲜，“牛肉膏”制造假牛肉，鸭肉制成“涮羊肉和烤羊肉”，还有“假肉丸鱼丸”，遍布大小集贸市场、餐饮饭馆，乃至深受消费者信赖的知名超市，“掺杂使假”可谓无孔不入。
综上所述，对动物源性成分的检测是关系到食品安全、民众健康的重点检测项目，必须严加执行。
依据当前实施的国家标准、出入境检验检疫行业标准，利用PCR技术、电泳、成像系统，以及荧光定量PCR系统，可实现食品及饲料中多种常见动物源性的快速检测（如表1）。
近些年，随着技术的不断更新，一些新的检测方法如微滴式数字PCR技术也越来越多的被应用于动物源成分的检测项目中来，其检测结果及发表文献受到了多方关注，正逐渐成为检验检疫部门的“新宠”。
动物源性成分分析的经典检测方法
定性PCR法平台的主要组成：
•热循环扩增仪
•电泳仪
•凝胶成像系统
定性PCR法用于源性成分的分
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