高效液相色谱法测定奶粉中主要磷脂组分的含量.docx

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高效液相色谱法测定奶粉中主要磷脂组分的含量

高效液相色谱法测定奶粉中主要磷脂组分的含量

李鹤丹;张咚咚;牟光庆;姜铁民;陈历俊

【摘要】本研究以奶粉为试验材料，建立了一种简便、快速同时测定奶粉中主要磷脂组分磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、神经鞘磷脂（SM）的高效液相色谱分析方法，优化后的色谱条件为：

VensilXBPSilica（5μm，250×4.6mm，150A）色谱柱，正己烷-异丙醇-0.05%乙酸（6：

8：

1.38，v/v/v）流动相体系，等度洗脱，流速1mL/min，柱温30℃，检测波长206nm，柱温30℃，进样量10μL；采用外标法定量。

试验结果表明：

PC、PE、SM的线性范围分别为0.05~3mg/mL（R2=0.9992），0.01~2mg/mL（R2=0.9993），0.01~1mg/mL（R2=0.9995），检测限分别为0.002mg/mL、0.005mg/mL、0.001mg/mL。

样品平均回收率在80.7%~108.6%之间，精密度试验和重复性试验RSD值均小于3%。

本试验方法简便、分析速度快、检测灵敏度高、重复性好、结果准确可靠，适用于奶粉等乳制品中磷脂主要组分PC、PE和SM含量的测定。

【期刊名称】《中国奶牛》

【年（卷）,期】2015（000）011

【总页数】6页（P33-38）

【关键词】磷脂酰胆碱;磷脂酰乙醇胺;神经鞘磷脂;高效液相色谱;奶粉

【作者】李鹤丹;张咚咚;牟光庆;姜铁民;陈历俊

【作者单位】大连工业大学食品学院，大连116034;国家母婴乳品健康工程技术研究中心筹，北京市乳品工程技术研究中心，北京三元食品股份有限公司，北京100163;国家母婴乳品健康工程技术研究中心筹，北京市乳品工程技术研究中心，北京三元食品股份有限公司，北京100163;大连工业大学食品学院，大连116034;国家母婴乳品健康工程技术研究中心筹，北京市乳品工程技术研究中心，北京三元食品股份有限公司，北京100163;国家母婴乳品健康工程技术研究中心筹，北京市乳品工程技术研究中心，北京三元食品股份有限公司，北京100163

【正文语种】中文

【中图分类】农业科学

33MILKANDMILKPRODUCT乳与乳制品2015·11/12高效液相色谱法测定奶粉中主要磷脂组分的含量李鹤丹1,2，张咚咚2，牟光庆1，姜铁民2，陈历俊2（1.大连工业大学食品学院，大连116034；2.国家母婴乳品健康工程技术研究中心（筹），北京市乳品工程技术研究中心，北京三元食品股份有限公司，北京100163）中图分类号：

TS252.1文献标识码：

A文章编号：

1004-4264（2015）11/12-0033-06摘要：

本研究以奶粉为试验材料，建立了一种简便、快速同时测定奶粉中主要磷脂组分磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、神经鞘磷脂（SM）的高效液相色谱分析方法，优化后的色谱条件为：

VensilXBPSilica（5μm，250×4．6mm，150A）色谱柱，正己烷-异丙醇-0．05%乙酸（6:

8:

1．38，v/v/v）流动相体系，等度洗脱，流速1mL/min，柱温30℃，检测波长206nm，柱温30℃，进样量10μL；采用外标法定量。

试验结果表明：

PC、PE、SM的线性范围分别为0．05～3mg/mL（R2=0．9992），0．01～2mg/mL（R2=0．9993），0．01～1mg/mL（R2=0．9995），检测限分别为0．002mg/mL、0．005mg/mL、0．001mg/mL。

样品平均回收率在80．7%～108．6%之间，精密度试验和重复性试验RSD值均小于3%。

本试验方法简便、分析速度快、检测灵敏度高、重复性好、结果准确可靠，适用于奶粉等乳制品中磷脂主要组分PC、PE和SM含量的测定。

关键词：

磷脂酰胆碱；磷脂酰乙醇胺；神经鞘磷脂；高效液相色谱；奶粉收稿日期：

2014-01-19基金项目：

北京市科技计划D141100004814001；国家“十二五”支撑计划（2012BAD12B06）。

作者简介：

李鹤丹（1990-），女，硕士，研究方向乳制品检测。

通讯作者：

陈历俊。

磷脂是一类含有磷酸基团脂质的总称，由一些具有表面活性物质的混合物组成[1]，是细胞膜的主要构成物质，在自然界中广泛存在，起着代谢调节和结构形成作用，具有降低胆固醇、保护肝脏、美容养颜等多种生理功能。

因此，磷脂在食品、化妆品以及医药行业应用广泛，被誉为“最伟大的保健食品”。

奶粉等乳制品通常以牛乳为主要的原料来源，而乳制品中磷脂含量仅为牛乳脂肪的0.2%～1%[2]。

牛乳中磷脂主要包括磷脂酰乙醇胺（PE），磷脂酰胆碱（PC）和鞘磷脂（SM），以及少量的磷脂酰肌醇（PI）和磷脂酰丝氨酸（PS），溶血磷脂酰胆碱（LPC）和溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）含量非常少。

其中PE、PC和SM为重要组成成分，所以三者也成为磷脂质量的重要指标。

目前，对磷脂总含量的测定主要采用称重法[3～9]、比色法[10～13]、紫外分光光度[14～17]和红外光谱（FTIR）法[8,18]等，而对于磷脂不同组分的分离和测定，由于31P核磁共振法（31P-NMR）[20,21]仍有一定的缺陷，其主要分析方法仍是薄层扫描色谱法（TLC）[22,25]和高效液相色谱法（HPLC）[26,27]。

薄层色谱法虽有设备简单、操作方便等特点，但需要较高的点样技术，且分析过程繁琐，易造成磷脂各组分的交叉污染，结果重现性差[28]。

高效液相色谱法能使非挥发性的、热敏感的磷脂在常温MILKANDMILKPRODUCT乳与乳制品2015·11/12（1.大连工业大学食品学院，大连116034；2.国家母婴乳品健康工程技术研究中心（筹），北京市乳品工程技术研究中心，北京三元食品股份有限公司，北京100163）中图分类号：

TS252.1文献标识码：

A文章编号：

1004-4264（2015）11/12-0033-06要：

本研究以奶粉为试验材料，建立了一种简便、快速同时测定奶粉中主要磷脂组分磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、神经鞘磷脂（SM）的高效液相色谱分析方法，优化后的色谱条件为：

VensilXBPSilica（5μm，250×4．6mm，150A）色谱柱，正己烷-异丙醇-0．05%乙酸（6:

8:

1．38，v/v/v）流动相体系，等度洗脱，流速1mL/min，柱温30℃，检测波长206nm，柱温30℃，进样量10μL；采用外标法定量。

试验结果表明：

PC、PE、SM的线性范围分别为0．05～3mg/mL（R2=0．9992），0．01～2mg/mL（R2=0．9993），0．01～1mg/mL（R2=0．9995），检测限分别为0．002mg/mL、0．005mg/mL、0．001mg/mL。

样品平均回收率在80．7%～108．6%之间，精密度试验和重复性试验RSD值均小于3%。

本试验方法简便、分析速度快、检测灵敏度高、重复性好、结果准确可靠，适用于奶粉等乳制品中磷脂主要组分PC、PE和SM含量的测定。

磷脂是一类含有磷酸基团脂质的总称，由一些具有表面活性物质的混合物组成[1]，是细胞膜的主要构成物质，在自然界中广泛存在，起着代谢调节和结构形成作用，具有降低胆固醇、保护肝脏、美容养颜等多种生理功能。

因此，磷脂在食品、化妆品以及医药行业应用广泛，被誉为“最伟大的保健食品”。

奶粉等乳制品通常以牛乳为主要的原料来源，而乳制品中磷脂含量仅为牛乳脂肪的0.2%～1%[2]。

牛乳中磷脂主要包括磷脂酰乙醇胺（PE），磷脂酰胆碱（PC）和鞘磷脂（SM），以及少量的磷脂酰肌醇（PI）和磷脂酰丝氨酸（PS），溶血磷脂酰胆碱（LPC）和溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）含量非常少。

其中PE、PC和SM为重要组成成分，所以三者也成为磷脂质量的重要指标。

目前，对磷脂总含量的测定主要采用称重法[3～9]、比色法[10～13]、紫外分光光度[14～17]和红外光谱（FTIR）法[8,18]等，而对于磷脂不同组分的分离和测定，由于31P核磁共振法（31P-NMR）[20,21]仍有一定的缺陷，其主要分析方法仍是薄层扫描色谱法（TLC）[22,25]和高效液相色谱法（HPLC）[26,27]。

薄层色谱法虽有设备简单、操作方便等特点，但需要较高的点样技术，且分析过程繁琐，易造成磷脂各组分的交叉污染，结果重现性差[28]。

高效液相色谱法能使非挥发性的、热敏感的磷脂在常温34MILKANDMILKPRODUCT得到分离，其封闭系统减少了磷脂在分析过程中被氧化的可能性，可以确保实现磷脂的快速、灵敏、准确的定量分析[19]，因而应用最广。

本文采用的流动相为正己烷、异丙醇和冰乙酸的多元等度洗脱体系，对PC、PE、和SM的分析作了探索，建立了奶粉中磷脂含量的高效液相色谱测定法，可以满足实际样品分析的要求。

1材料与方法1．1材料与试剂婴幼儿配方奶粉1、婴幼儿配方奶粉2，均为北京三元食品股份有限公司提供；PC标准品（纯度≥99.0%）、PE标准品（纯度≥97.0%）、SM标准品（纯度≥98.0%），均购自美国sigma公司；正己烷、异丙醇、乙酸均为色谱纯，购自美国赛默飞世尔科技有限公司；氯仿、甲醇均为分析纯，购自北京化工厂；试验用水均为超纯水，由北京三元食品有限股份公司实验室提供；0.05%乙酸溶液：

准确量取50μL乙酸用超纯水定容至100mL。

1．2仪器与设备LC-10Avp型高效液相色谱仪（配有PDA检测器和CLASS-VP工作站）：

日本岛津公司；Milli-QA10超纯水净化器：

美国MILLIPORE公司；3K-15高速冷冻离心机：

美国Sigma公司；MTN-2800D氮吹浓缩装置：

天津奥特赛恩斯仪器有限公司；RE-52A旋转蒸发器：

上海振捷实验设备有限公司；SHB-III水循环真空泵：

郑州市上街区仪器厂；KQ-500DE医用数控超声清洗器：

昆山市超声仪器有限公司。

1．3样品处理与测定分别准确称取13g奶粉1、奶粉2，各用100mL超纯水搅拌至完全溶解。

各取两种奶粉溶液10mL，分别加入30mLFolch试剂（氯仿-甲醇2:

1，v/v），漩涡振荡混匀后，30℃超声溶解30min，10000r/min离心10min，取下层溶液，并将上层溶液和中间层反复用Folch试剂超声提取，离心分离，重复三次。

合并有机层，转移至旋转蒸发器中真空旋转蒸发，30℃浓缩至5mL左右，再用氮气吹干，所得为磷脂提取物，用1mL正己烷-异丙醇-0.05%乙酸（6:

8:

1.38，v/v/v）混合溶剂溶解，配制成磷脂提取液，提取液经过0.22μm尼龙膜过滤器，进行高效液相色谱系统分析。

1．4色谱条件色谱柱：

VensilXBPSilica（5μm，250×4.6mm，150A）；流动相：

正己烷-异丙醇-0.05%乙酸（6:

8:

1.38，v/v/v）；流速：

1mL/min；检测波长：

206nm；柱温：

30℃；进样量：

10μL。

1．5标准溶液的配制标准储备液：

分别精确称取30mg磷脂酰胆碱标准品、20mg磷脂酰乙醇胺标准品、10mg鞘磷脂标准品于10mL容量瓶中，分别用流动相溶解定容至刻度，配制成质量浓度分别为3mg/mL、2mg/mL和1mg/mL的磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂的标准储备液，于-20℃下储存备用。

标准工作液：

分别取一定体积的标准储备液，用流动相稀释成一定浓度的标准工作液，标准液浓度梯度见表1。

表1标准品溶液质量浓度梯度单位：

mg/mL编号1234567磷脂酰胆碱（PC）0.050.10.51.01.52.03.0磷脂酰乙醇胺（PE）0.010.050.10.51.01.52.0神经鞘磷脂（SM）0.010.050.10.30.50.71.02结果与讨论2．1色谱条件的选择2.1.1色谱柱和检测波长的选择磷脂成分复杂，由一系列极性各异的磷脂组分组成，而每种组分由不同长度的脂肪酸链同系物混合而成，因此磷脂的定量分析难度较大。

分析磷脂中不同种类脂肪酸的组成时以C8和C18的反相柱为多，而分析磷脂各组分含量及纯度时多采用以硅胶为固定相的正相柱。

综合国内外文献[28～33]，本试验选用天津AgelaTechnologies公司的VensilXBPSilica（5μm，250×4.6mm，150A）硅胶柱。

本试验选用PDA检测器，在190～290nm波长范围内扫描样品溶液时发现，在201～210nm之间有一个最大吸收峰（图1），为此，测定相同样品在203nm、206nm、207nm、210nm下的吸光度，结果表明206nm磷脂组分的吸收最强。

因此，选用206nm作为检测波长。

MILKANDMILKPRODUCT得到分离，其封闭系统减少了磷脂在分析过程中被氧化的可能性，可以确保实现磷脂的快速、灵敏、准确的定量分析[19]，因而应用最广。

本文采用的流动相为正己烷、异丙醇和冰乙酸的多元等度洗脱体系，对PC、PE、和SM的分析作了探索，建立了奶粉中磷脂含量的高效液相色谱测定法，可以满足实际样品分析的要求。

1材料与方法1．1材料与试剂婴幼儿配方奶粉1、婴幼儿配方奶粉2，均为北京三元食品股份有限公司提供；PC标准品（纯度≥99.0%）、PE标准品（纯度≥97.0%）、SM标准品（纯度≥98.0%），均购自美国sigma公司；正己烷、异丙醇、乙酸均为色谱纯，购自美国赛默飞世尔科技有限公司；氯仿、甲醇均为分析纯，购自北京化工厂；试验用水均为超纯水，由北京三元食品有限股份公司实验室提供；0.05%乙酸溶液：

准确量取50μL乙酸用超纯水定容至100mL。

1．2仪器与设备LC-10Avp型高效液相色谱仪（配有PDA检测器和CLASS-VP工作站）：

日本岛津公司；Milli-QA10超纯水净化器：

美国MILLIPORE公司；3K-15高速冷冻离心机：

美国Sigma公司；MTN-2800D氮吹浓缩装置：

天津奥特赛恩斯仪器有限公司；RE-52A旋转蒸发器：

上海振捷实验设备有限公司；SHB-III水循环真空泵：

郑州市上街区仪器厂；KQ-500DE医用数控超声清洗器：

昆山市超声仪器有限公司。

分别准确称取13g奶粉1、奶粉2，各用100mL超纯水搅拌至完全溶解。

各取两种奶粉溶液10mL，分别加入30mLFolch试剂（氯仿-甲醇2:

1，v/v），漩涡振荡混匀后，30℃超声溶解30min，10000r/min离心10min，取下层溶液，并将上层溶液和中间层反复用Folch试剂超声提取，离心分离，重复三次。

合并有机层，转移至旋转蒸发器中真空旋转蒸发，30℃浓缩至5mL左右，再用氮气吹干，所得为磷脂提取物，用1mL正己烷-异丙醇-0.05%乙酸（6:

8:

1.38，v/v/v）混合溶剂溶解，配制成磷脂提取液，提取液经过0.22μm尼龙膜过滤器，进行高效液相色谱系统分析。

1．4色谱条件色谱柱：

VensilXBPSilica（5μm，250×4.6mm，150A）；流动相：

正己烷-异丙醇-0.05%乙酸（6:

8:

1.38，v/v/v）；流速：

1mL/min；检测波长：

206nm；柱温：

30℃；进样量：

10μL。

标准储备液：

分别精确称取30mg磷脂酰胆碱标准品、20mg磷脂酰乙醇胺标准品、10mg鞘磷脂标准品于10mL容量瓶中，分别用流动相溶解定容至刻度，配制成质量浓度分别为3mg/mL、2mg/mL和1mg/mL的磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂的标准储备液，于-20℃下储存备用。

标准工作液：

分别取一定体积的标准储备液，用流动相稀释成一定浓度的标准工作液，标准液浓度梯度见表1。

1234560.050.10.51.01.52.03.00.010.30.72结果与讨论2．1色谱条件的选择磷脂成分复杂，由一系列极性各异的磷脂组分组成，而每种组分由不同长度的脂肪酸链同系物混合而成，因此磷脂的定量分析难度较大。

分析磷脂中不同种类脂肪酸的组成时以C8和C18的反相柱为多，而分析磷脂各组分含量及纯度时多采用以硅胶为固定相的正相柱。

综合国内外文献[28～33]，本试验选用天津AgelaTechnologies公司的VensilXBPSilica（5μm，250×4.6mm，150A）硅胶柱。

本试验选用PDA检测器，在190～290nm波长范围内扫描样品溶液时发现，在201～210nm之间有一个最大吸收峰（图1），为此，测定相同样品在203nm、206nm、207nm、210nm下的吸光度，结果表明206nm磷脂组分的吸收最强。

因此，选用206nm作为检测波长。

35MILKANDMILKPRODUCT图1样品紫外吸收波长扫描图2.1.2流动相的选择高效液相色谱法测定磷脂类化合物所用流动相主要有以下三个体系：

氯仿-甲醇-水/氨水；正己烷-异丙醇-水；乙睛-甲醇-水。

在磷脂类化合物的分离和测定中，第二类流动相使用较多，这是由于该流动相体系具有溶剂不易挥发、色谱分离效果良好、操作简易和更适合于PDA检测器的优点，所以本试验在定量分析中采用该体系为流动相。

经过多次的试验研究发现，流动相条件的改变对于各类磷脂组分的分离具有以下影响：

（1）正己烷/异丙醇比例的影响改变正己烷/异丙醇的比例，对磷脂各组分的峰形和出峰时间都有一定影响。

加大异丙醇的比例可以改善峰形，但使分析时间延长。

试验表明，采用正己烷:

异丙醇为3:

4（v/v）最为合适。

（2）水含量的影响水的加入量主要影响磷脂的出峰时间。

水在正相洗脱模式中，是强极性洗脱剂，增加水的含量，流动相的洗脱能力增强，致使整体出峰时间提前。

但是若出峰时间太早，磷脂各组分的峰和杂质分离度降低，不利于定量分析。

试验表明，水的比例在9%效果最好。

（3）酸的影响酸的加入主要是抑制色谱峰的拖尾，并且对PE的保留时间有较大影响，加入酸后，PE出峰时间延后，与溶剂峰分离较好，文献[29,34]中多使用酸的水溶液浓度为1%，试验中随着酸浓度的降低，PE的峰形变好，所以酸的水溶液浓度采用0.05%即可。

经试验最终确定流动相条件为：

正己烷-异丙醇-0.05%乙酸（6:

8:

1.38，v/v/v）。

在此色谱条件下，图2为磷脂混合标准品的高效液相色谱图，图3和图4分别是奶粉1和奶粉2样品的高效液相色谱图，从图中可以看出三种磷脂组分在硅胶柱上分离度适宜、峰形较好，适于定量分析。

图2PC、PE、SM混合标准品的高效液相色谱图图3奶粉1样品的高效液相色谱图图4奶粉2样品的高效液相色谱图2.1.3柱温和流速的选择在上述色谱条件下，改变色谱柱的温度发现，在20～40℃之间对PE、PC和SM的分离影响不大，而流动相中异丙醇的存在使黏度增加，适当提高温度可以降低流动相的黏度，但温度过高磷脂易发生变性，故综合考虑，本试验选择的柱温为30℃。

在柱子和系统所能承受的压力范围内，提高流速可以缩短分离时间，但流速过高会使相邻组分的分离度降低，最终确定流速为1mL/min。

2．2PE、PC、SM的定量分析MILKANDMILKPRODUCT2.1.2流动相的选择高效液相色谱法测定磷脂类化合物所用流动相主要有以下三个体系：

氯仿-甲醇-水/氨水；正己烷-异丙醇-水；乙睛-甲醇-水。

在磷脂类化合物的分离和测定中，第二类流动相使用较多，这是由于该流动相体系具有溶剂不易挥发、色谱分离效果良好、操作简易和更适合于PDA检测器的优点，所以本试验在定量分析中采用该体系为流动相。

经过多次的试验研究发现，流动相条件的改变对于各类磷脂组分的分离具有以下影响：

（1）正己烷/异丙醇比例的影响改变正己烷/异丙醇的比例，对磷脂各组分的峰形和出峰时间都有一定影响。

加大异丙醇的比例可以改善峰形，但使分析时间延长。

试验表明，采用正己烷:

异丙醇为3:

4（v/v）最为合适。

水的加入量主要影响磷脂的出峰时间。

水在正相洗脱模式中，是强极性洗脱剂，增加水的含量，流动相的洗脱能力增强，致使整体出峰时间提前。

但是若出峰时间太早，磷脂各组分的峰和杂质分离度降低，不利于定量分析。

试验表明，水的比例在9%效果最好。

（3）酸的影响酸的加入主要是抑制色谱峰的拖尾，并且对PE的保留时间有较大影响，加入酸后，PE出峰时间延后，与溶剂峰分离较好，文献[29,34]中多使用酸的水溶液浓度为1%，试验中随着酸浓度的降低，PE的峰形变好，所以酸的水溶液浓度采用0.05%即可。

经试验最终确定流动相条件为：

正己烷-异丙醇-0.05%乙酸（6:

8:

1.38，v/v/v）。

在此色谱条件下，图2为磷脂混合标准品的高效液相色谱图，图3和图4分别是奶粉1和奶粉2样品的高效液相色谱图，从图中在上述色谱条件下，改变色谱柱的温度发现，在20～40℃之间对PE、PC和SM的分离影响不大，而流动相中异丙醇的存在使黏度增加，适当提高温度可以降低流动相的黏度，但温度过高磷脂易发生变性，故综合考虑，本试验选择的柱温为30℃。

在柱子和系统所能承受的压力范围内，提高流速可以缩短分离时间，但流速过高会使相邻组分的分离度降低，最终确定流速为1mL/min。

36MILKANDMILKPRODUCT2.2.1线性范围与检出限在优化的色谱条件下，将配制好的PE、PC、SM不同浓度标准工作液进行高效液相色谱分析，以工作液的浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，作标准曲线，得到各磷脂化合物的线性方程及相关系数（见表2）。

以信噪比S/N=3测定的结果计算各磷脂组分的检测限。

表2PC、PE、SM的回归方程和线性范围、相关系数及检出限标准品名称回归方程线性范围（mg/mL）相关系数检出限（mg/mL）磷脂酰胆碱（PC）y=1770085.0605x-93544.16390.05-30.99920.002磷脂酰乙醇胺（PE）y=2215558.6371x+18767.46420.01-20.99930.005鞘磷脂（SM）y=1683062.4248x+63433.94360.01-10.99950.0012.2.2精密度试验表3精密度试验结果（n=6）组分名称浓度（mg/mL）峰面积（%）RSD平均值（%）PC69679.1.51778.81.770.10145817.82923.20.20301434.71970.7PE0.0297112.02233.01.38148276.11344.3232225.21677.2SM40846.671259.71.3163619.01255.0129991.3995.6注：

n为每种浓度下的标准溶液平行测定次数。

取步骤1.5中的高、中、低三种浓度PC、PE、SM标准试样溶液，每种浓度的试样溶液取6个平行样，测定试样溶液中的PC、PE、SM的峰面积，考察仪器的精密度。

试验中PC、PE、SM三个浓度的相对偏差小于3%（见表3），说明该仪器精密度较高，仪器误差小，能满足定量分析的要求。

2.2.3重复性试验分别取6份步骤1.3中的两种奶粉样品，在已优化的色谱条件下分别测定，结果见表4。

试验显示，奶粉1中PC、PE、SM峰面积值的相对标准偏差（RSD）分别为1.00%、1.37%、2.16%；奶粉2中PC、PE、SM峰面积值的相对标准偏差（RSD）分别为1.53%、1.95%、2.50%，两种奶粉中磷脂主要组分的峰面积测定值的RSD值均小于3%，说明该方法的重复性较好。

2.2.4加标回收率试验精确称取10mL已知磷脂组分含量的两种奶粉溶液各6份，按照步骤1.3的方法处理样品，同时做试剂空白。

在已优化的色谱条件下，同时加入本底平均值50%～150%的标准品做回收率试