A549DDP细胞凋亡与其机制的研究.docx

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A549DDP细胞凋亡与其机制的研究

A549/DDP细胞凋亡及其机制的研究

1材料

1.1主要仪器荧光显微镜及照相系统：

Olympus公司垂直电泳槽：

Bio-Rad公司电转移槽：

Bio-Rad公司恒温摇床：

江苏太仓仪器公司分光光度仪：

Bio-Rad公司遥控酶标仪：

TECAN公司台式高速离心机：

eppendorf公司其余同前两部分

1.2普通耗材

50mL/250mL细胞培养瓶：

Nunc公司

6孔细胞培养板：

Costar公司

60mm细胞培养皿：

Costar公司细胞刮刀：

Nunc公司

1.3主要试剂

Hoechst33258染色试剂盒：

碧云天公司

PI和AnnexinV-FITC:

美国BD公司

TUNEL试剂盒：

罗氏公司鼠抗人Caspase-8p1（单抗：

CellSignaling

HRP标记羊抗鼠二抗：

武汉博士德公司

BCA法蛋白定量试剂盒：

Pierce公司

ECL发光检测试剂盒：

Pierce公司

硝酸纤维素转移膜（0.22卩m）Amersham公司

DAB北京中杉公司其余试剂同前两部分

1.4常用缓冲液及培养基结合缓冲液（X10）：

100mmol/LHEPES（PH7.5）1.4moLNaCl25mmol/LCaCl2

单去圬剂裂解液：

50mmol/LTris-HCl（PH8.0）150mmol/LNaCl1%TritonX-100100g/mLPMSF5XSDS蛋白上样缓冲液：

250mmol/LTris-HCl（PH6.8）10%SDS50%甘油0.5%溴酚蓝500mmol/LDTT（临用前现加）

电泳缓冲液：

25mmol/LTris-HCl（PH7.4）250mmol/L甘氨酸（PH8.3）0.1%SDS

转移缓冲液：

5.6mmol/LTris-HCl（PH7.4）120mmol/L甘氨酸

0.1%SDS20%甲醇（V/V）储存于4C备用

PBS缓冲液137mmol/LNaCl2.7mmol/LKCl10.0mmol/LNa2HPO42.0mmol/LKH2PO4

调节至PH=7.4

洗涤缓冲液（PBS-Tween-20）：

1000mLPBS（PH7.4,0.01M）500aLTwe620

封闭缓冲液：

5g脱脂奶粉

100mLPBST1.5细胞系

同第一部分

2方法2.1A549/DDP细胞凋亡的检测

2.1.1细胞凋亡形态学观察将A549/DDP细胞分别加入到含盖玻片的6孔细胞培养板中，每孔细胞数为1X104个，培养过夜后，去培养液，加入含姜黄素终浓度为0、5、10、20、30、40amol/L的培养液继续培养24h后终止培养,

取出细胞爬片，按照Hoechst33258染色试剂盒说明书进行染色。

1在细胞爬片上，轻轻滴加约500aL固定液，以刚覆盖爬片为宜,

固定10分钟。

2去固定液，用PBS洗两遍，每次

3分钟，吸尽液体，洗涤时用手

晃动数次。

③加入0.5mLHoechst33258染色液,

染色5分钟，用手晃动数次。

④去染色液，用PBS洗两遍，每次

3分钟，吸尽液体，洗涤时用手

晃动数次。

⑤滴加一滴抗荧光淬灭封片剂于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片,让细胞接触封片剂，避免气泡。

⑥上荧光显微镜观察，激发波长350nm,发射波长460nm。

2.1.2原位末端标记（TUNEL）染色

同上方法制备细胞爬片，PBS洗涤，4%多聚甲醛固定后，按照TUNEL

试剂盒说明书操作。

1在细胞爬片上，轻轻滴加约500aL固定液，以刚覆盖爬片为宜,

固定30分钟。

2PBS洗片两次，每次3分钟，吸尽液体，洗涤时用手晃动数次。

滴加内源性过氧化物酶阻断剂（0.3%H2O2-甲醇溶液），室温孵育30分钟。

③同上用PBS洗片，滴加通透液（0.1%TritonX-100溶于0.1%枸橼酸

钠溶液中），在冰浴中孵育2分钟。

④PBS洗两次,

滴加50卩L的TUNEL反应混合液，湿盒中室温孵育

60分钟。

⑤PBS洗两次,

50卩L的转化剂-POD,湿盒中37C孵育30分

钟。

⑥PBS洗两次,

加入

DAB底物溶液,室温孵育10分钟。

⑦PBS洗两次,

封片

光镜下观察。

⑧结果判定：

细胞核中有棕褐色颗粒者为阳性。

每张片至少观察500

个细胞,计算每100个细胞内的阳性细胞,即凋亡指数（apoptoticindex,AI）。

2.1.3流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡

①取对数生长期A549/DDP细胞，常规消化，制备成105/mL细胞悬液。

②接种于直径60mm培养皿中，每孔4mL,细胞培养箱中过夜培养。

3次日吸弃原细胞培养液,加入含姜黄素终浓度为0、5、l0、20、30、40amol/L的培养液，继续培养24h。

4常规消化，4C离心（800rpm,5min）,收获各组细胞，转移至1.5mL

离心管。

5弃上清，加入预冷的1X结合缓冲液100卩L,重悬细胞，置于冰浴。

⑥加入5卩LAnnexinV-FITC和5卩LPI于细胞悬液中，混匀，4C避

光染色10min。

⑦补加490aL结合缓冲液混悬细胞，立即行FCM分析。

2.2姜黄素对A549/DDP细胞caspase-8的影响

取对数生长期A549/DDP细胞，常规消化，制备成105/mL细胞悬液,

接种于直径60mm培养皿中，每孔4mL，细胞培养箱中过夜培养。

次日吸弃原细胞培养液，加入含姜黄素终浓度为

0、5、l0、20、30、

40amol/L的培养液，继续培养24h。

2.2.1样品制备①提取细胞总蛋白：

a.培养液中悬浮细胞蛋白的提取：

各浓度姜黄素处理细胞24h后，终

止培养。

将培养皿中的培养液转移至15mL塑料离心管中，4C,2500rpm离心10min，弃上清，4C1XPBS洗涤两次，加入单去污剂

裂解液100卩L于冰上裂解30min,将上清转移至1.5mL塑料离心管,备用；

b.贴于培养皿上细胞蛋白的提取：

4C1XPBS洗涤培养皿两遍，加入

单去污剂裂解液300卩L于冰上裂解30min。

裂解完毕后，用细胞刮片将细胞刮于一侧，转移至1.5mL塑料离心管中，4C,12000rpm离

心10min。

C.将离心后的上清液与从a中得到的裂解上清混合，4C,12000rpm

离心5min,取上清分装于0.5mL离心管中，置于—20C备用。

②BCA法蛋白定量。

3取总蛋白含量相等的上清体积，加入1/5体积的5XSDS上样缓冲

液，沸水煮5min,12000rpm离心10min，备用。

2.2.2电泳采用微型垂直蛋白电泳系统进行SDS-变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，缓

冲系统为Tris-甘氨酸电泳缓冲液。

先后配制10%的分离胶及4%的浓缩胶，凝固后用微量加样器向加样槽中加入样品和次高分子量蛋白质

标准，电泳装置与电源相连，凝胶上所加电压120V，当染料前沿进

入分离胶后，把电压提至160V，继续电泳至溴酚蓝到达分离胶的底部，关闭电源。

2.2.3转移将电泳后的SDS-PAGE胶板置于转移缓冲液中平衡15min,再在转移

缓冲液中进行电转移；将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，恒压60V，冷

观察电转

褪去染液

却系统中转移2h。

转移完成后将膜在丽春红染液中染色,结果。

剪下目的蛋白部分,做好标记,放入双蒸水中漂染,颜色。

2.2.4Westernblot

①封闭：

将膜置于平皿中，加入封闭液于室温缓慢摇动

1h。

②与一抗孵育：

将鼠抗人Caspase-8p10单抗及p-actin作为一抗用

PBS稀释（1:

1000），与膜共同封入塑料袋中，4C过夜。

③洗膜：

将膜从塑料袋中取出，PBST振摇漂洗3次，每次10min。

4与二抗孵育：

将HRP标记羊抗鼠抗体作为二抗用PBST稀释（1:

3000），与膜共同封入塑料袋中，室温缓慢摇动1h。

6化学发光：

将膜上液体用滤纸吸干，置于化学发光底物反应系统中反应5min,暗室X-光片1~5min。

显影20sec定影10min.

7扫描后，用LeicaQwin图象分析软件进行吸光度积分值分析。

2.3统计学处理用SPSS11.0统计软件包处理,统计学方法采用单因素方差分析,

SNK-q检验，x2检验，PV0.05认为有统计学意义。

3结果3.1A549/DDP细胞凋亡的检测

3.1.1细胞形态学改变荧光显微镜下观察,姜黄素组部分细胞的细胞核均有破裂,呈大、小不等,被荧光染料着色成致密浓缩发白发亮的细胞核,此为典型的细胞凋亡形态。

其中以40卩mol/L姜黄素组最多，对照组只见很少凋亡形态细胞（附图1）。

3.1.2TUNEL检测细胞凋亡指数

原位DNA缺口末端标记染色,凋亡细胞核呈棕黄色,易于识别（附图2）。

0,5、10、20、30、40amol/L的姜黄素作用于A549/DDP细胞24h

后,凋亡指数分别是（2.6±0.5）%、（10.7±2.3）%、（20.5±3.1）%、（28.6

±3.4）%、（35.7±0.4）%、（49.5±4.4）%,显示出明显的剂量依赖关系

（Pv0.05）。

3.1.3流式细胞仪检测细胞凋亡率不同浓度姜黄素作用于A549/DDP细胞24h后，经Annexin-V和PI

进行染色后，用流式细胞仪分析凋亡细胞。

流式细胞仪分析，获得由四个象限组成的细胞直方图（图5）。

第1象限代表细胞收集过程中出现的损伤细胞（An-PI+），第2象限代表晚期凋亡细胞和坏死细胞

（An+PI+），第3象限代表正常细胞（An-PI-），第4象限代表早期凋亡

细胞（An+PI-）。

本实验主要观察早期凋亡细胞，早期凋亡细胞即

An+PI-细胞所占的百分比分别为2.93%、3.68%、7.71%、20.23%、23.0%、32.15%，显示出明显的剂量依赖关系（Pv0.05）。

3.2Westernblot的结果不同浓度姜黄素处理A549/DDP细胞24h后，出现Caspase8舌性裂

解片段P10的蛋白条带（附图3）,且条带光密度积分值随姜黄素浓度而增强（图6）。

4讨论细胞凋亡是细胞生物体的一种重要的自稳机制，是由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程。

研究表明，肿瘤的发生很可能就是由于细胞增殖和凋亡失衡，导致肿瘤细胞无限无序增殖所致。

诱导肿瘤细胞凋亡是许多抗癌成分十分重要的抗癌机制之一。

肿瘤化疗过程中，凋亡细胞很快被体内的巨噬细胞清除，对周围的炎症反应很少。

因此通过诱导凋亡而杀死肿瘤细胞具有更少的毒副反应，目前通过诱导或促进肿瘤细胞凋亡正成为肿瘤防治的新思路，也是评估抗癌药物作用能力的重要指标。

细胞发生凋亡时，染色质会固缩，Hoechst染色细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染。

本部分实验中，经过不同浓度姜黄素干预24h后的各组细胞，用

Hoechst33258荧光染料染色后，在荧光显微镜下观察，姜黄素干预组

均能找到较多胞核致密浓缩发白发亮的细胞，并随着姜黄素浓度增加而增多，而对照组只见很少呈凋亡形态的细胞，这表明姜黄素可诱导

A549/DDP细胞凋亡。

细胞凋亡时DNA断裂会产生大量游离的3'-羟基末端，利用末端脱

氧核苷酸转移酶（TdT），无需DNA模板即可将生物素或地高辛标记的外源性dUTP直接连接到凋亡细胞核的DNA断链的3'-羟基末端，

通过过氧化物酶标记的链卵白素或抗地高辛抗体与之结合，经DAB

显色，检测细胞细胞是否存在外源性核苷酸掺入的DNA片段，显示凋亡细胞。

利用该技术能较准确地探测到细胞凋亡现象。

本部分实验中，TUNEL结果示5卩mol/L姜黄素作用24h即有被标记染色阳性的细胞出现，凋亡指数为（2.6±0.5）%，与对照组相比有显著性差异。

随

着剂量增大，凋亡指数增多，凋亡细胞占总细胞数的比例升高。

并且阳性细胞数随药物浓度递增。

流式细胞仪检测凋亡的方法有多种，其中磷脂结合蛋白

AnnexinV-FITC/PI双标记染色最为常用。

正常活细胞带负电的磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS定位于细胞膜内侧。

细胞凋亡早期，由

于细胞膜失去对称性，PS从胞膜的内侧暴露于胞膜外，成为巨噬细胞清除凋亡细胞识别的标志。

AnnexinV-FITC是一种标记有荧光素的

钙依赖磷脂结合蛋白，与PS有很强的亲和力，可特异地与PS结合。

凋亡早期细胞仍保持膜的完整性，PI不能进入细胞内，而凋亡晚期和

发生继发坏死的细胞可同时被AnnexinV-FITC/PI着色，利用流式细

胞仪进行双参数分析，即可将凋亡细胞（AnnexinV+细胞）与继发坏死

的细胞（AnnexinV+/PI+细胞）区分开，并能计算出阳性细胞百分率。

本

部分实验中，FCM分析显示姜黄素作用于A549/DDP细胞24h后,

实验组的细胞早期凋亡率即明显高于阴性对照组，且呈剂量依赖性，

这进一步证明姜黄素可以诱导A549/DDP细胞凋亡。

综上，本文从细

胞形态，TUNEL检测，流式细胞仪分析等三个不同层面证实了姜黄

素可以诱导人肺腺癌A549/DDP细胞凋亡，并呈剂量依赖性，该凋亡

的发生应该是姜黄素抗A549/DDP细胞增殖的主要途径。

目前认为细胞凋亡通路主要有：

细胞外（死亡受体）途径、细胞内（线粒

体）途径和内质网途径，而天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（cysteinyl

aspartate-specificprotease,caspaSe的活化是不同细胞凋亡途径中共同

的下游事件，活化后的caspase通过切断与周围细胞的联络、重组细

胞骨架、阻止DNA复制和修复、破坏DNA和核结构、诱导凋亡小

体的形成等调控着细胞的凋亡过程。

其中caspase-8在细胞凋亡中起

着极其重要的作用。

caspase-8在caspase级联反应中属于启动性

caspasescaspase-8的活化是caspase级联反应的第一步。

caspase-8

除了能启动细胞外途径以外，还能启动细胞内途径，因此

caspase-8

也是联系内外源凋亡途径的桥梁。

Karmakar等研究发现，

姜黄素可

通过死亡受体介导途径和线粒体介导途径诱导人恶性胶质瘤

T98G细

胞凋亡，包括caspase8的活化。

caspase8在正常状态下是以酶原

（procaspase8形式存在的，凋亡信号刺激下，被剪切激活释放出活性

片段p18和p10,接着形成有两个大亚基和两个小亚基构成的四聚体,即caspase-8并从死亡信号复合体（DISC）中释放进入胞浆，继而再活化胞浆中的下游caspase形成caspase级联反应，将凋亡信号传至凋亡底物，最终发生凋亡。

本研究中western-blot结果显示在姜黄素处理组，均可见caspase-8p1條带，并随浓度增加条带光密度积分值逐

渐升高。

说明姜黄素诱导A549/DDP细胞凋亡过程中存在caspase8

的活化，但是否存在不依赖caspase的凋亡途径还不得而知。

有研究

表明，A549/DDP细胞之所以耐药，与细胞过度表达bcl-2而下调了

caspase-8和细胞色素C的蛋白表达有关。

因此姜黄素是否是通过抑

制A549/DDP细胞bcl-2过度表达，而上调procaspase-8和细胞色素C蛋白表达，再去激活caspase-8诱导凋亡，还需进一步探讨。