2发酵液的预处理和菌体回收.docx

2发酵液的预处理和菌体回收.docx

《2发酵液的预处理和菌体回收.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《2发酵液的预处理和菌体回收.docx（6页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

2发酵液的预处理和菌体回收

2.发酵液的预处理和菌体回收

第二章发酵液是预处理和菌体的回收1悬浮液的基本特性悬浮液通常是指固体颗粒度在10‐5cm以上的固‐液分散体系，生物细胞培养液基本上也属于悬浮液。

其中大部分是水．其次是微生物或动、植物细胞或碎片及少量未用完的培养基，约占培养液体积的20%左右（对微生物发酵而言），除此以外，尚有一定最的代谢产物。

水的基本性质中与固‐液分离密切相关的有以下几点。

（l）水的极性水分子中裸露的氢原子核能与电负性元素形成氢键，水分子之间由于氧键会发生强烈的缔合作用，如与固体物料表面发生氢键作用，则将强化水分子在物料表面的附着状态而不利于固‐液分离的进行。

（2）水的黏性它是流体反抗变形的一种性质，反映了流体分子间的相互作用，对水的研究结果表明，它是一种牛顿型流体。

水的黏度是温度的函数，改变温度会对分离效率产生显著的影响。

但是由于生物细胞及其产物存在热敏性，所以一般在室温和低温下操作，因而水的黏度可看作常量。

（3）水的表面张力水是除汞以外具有最高表面张力的液体，且其表面张力随温度的升高而降低。

水在固体表面的附着程度及在孔隙内的深入程度都与水的表面张力直接相关。

一般说来，液体介质的表面张力越大，固‐液分离越困难，因此降低水的表面张力是提高固‐液分离效率的有效途径之一，向悬浮液中添加表面活性剂则是目前行之有效的手段。

同相在这里丰要是指培养液巾悬浮的生物体细胞，现在工业生物技术生产过程中典型的生物体的形状和大小见图3.1和表3.1。

这些细胞不仅尺寸小，形态多样，而且是易变性的柔软体，已经压缩就会变形。

由于生物体的特殊性，导致其固液分离与一般情况有所不同（见表3.2）。

2悬浮液的预处理由于所需的产品在培养液和菌体中浓度很低，并与许多杂质夹杂在一起，同时发酵液或生物溶液又属于非牛顿型流体，所以必须进行预处理。

2.1预处理的目的预处理的目的主要有3个：

①改变发酵液的物理性质，提高从悬浮液中分离固形物的速率，提高同一液分离器的效率；②尽可能使产物转入便于后处理的某一相巾（多数是液相）；③去除发酵液中部分杂质，以利于后续各步操作。

2.2预处理方法预处理方法完全取决于可分离物质的性质，如对溶液的pH值和热的稳定性，是蛋白质还是非蛋白质本性，分子的质量和大小等。

具体方法上要有以下几种。

（1）加热法是最简单和价廉的预处理方法。

即把悬浮液加热到所需温度并保温适当时间。

加热可降低悬浮液的黏度，恰当的热量能够加速聚集作用以去除某些杂蛋白等物质，降低悬浮液的最终体积，破坏凝胶状结构、增加滤饼的孔隙度，使固‐液分离变得十分容易。

但此法的关键取决于产品的热稳定性。

（2）调节悬浮液的pH值全细胞的聚集作用高度依赖于pH的大小，恰当的pH值能够促进聚集作用．这个方法也很简便，一般用草酸或无机酸或碱来调节。

（3）凝聚和絮凝凝聚与絮凝都是悬浮液预处理的重要方法，其处理过程就是将化学药剂预先投加到悬浮液中，改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，破坏其稳定性，使它们聚集成可分离的絮凝体，再进行分离。

这两种方法的特点是不仅能使颗粒尺寸有效增加，并且会增大颗粒的沉降和浮选速率，提高滤饼的渗透性或者在深层过滤时产牛较好的颗粒保留作用。

但是应当注意，凝聚和絮凝是两种方法、两个概念，其具体处理过程也是有差别的，应该明确区分开来，不可混淆。

①凝聚指在投加的化学物质（例如水解的凝聚剂，像铝、铁的盐类或石灰等）作用下，胶体脱稳并使粒子相互聚集成1mm大小块状凝聚体的过程。

其中凝聚剂（也称无机絮凝剂）的作用，有些是对初始粒子表面电荷的简单中和，另一些是消除双电荷层（采用中性盐，例如NaCI等）而脱稳，还有一些是通过氢键或其他复杂的形式与粒子相结合而产生凝聚。

②絮凝指使用絮凝剂（通常是天然或合成的大分子量聚电解质以及生物絮凝剂）将胶体粒子交联成网，形成10mm大小的絮凝团的过程，其中絮凝剂主要起架桥作用。

絮凝剂相对凝聚剂而言更为昂贵，因此其剂量必须正确使用并经仔细优化。

使用过量既不经济，还可能会覆盖在颗粒表面，阻止絮凝并导致悬浮液的重新稳定，或者引起分离操作上的困难，例如造成过滤介质的堵塞或者滤泥结球和砂滤器中暗沟的颈缩等。

此外，还会大大增加排污体积。

最佳的使用剂量已经找到，一般为粒子表面积中约有一半被聚合物覆盖时所用的絮凝剂量。

由于粒子的表而电荷还受pH值的影响，所以在预处理时，它的控制也很重要。

③絮凝剂的选择和剂最及处理条件的优化絮凝剂的选择和剂量的最优化，还取决于固体的浓度、粒子的尺寸分布范围、表面化学、电解质的含量等因素，足多种效应的综合结果。

除此以外也取决于后续分离过程对所需絮凝剂类型与特性的要求，例如在旋转真空过滤时，需要的是尺寸均匀、小而坚实的絮凝块，包括能俘获超细粒于到絮凝块内，防止滤布的堵塞和滤液的混浊，并且要求絮凝物在处理槽中不易沉降和被搅拌器打碎，这样的絮凝物就不会造成局部空气穿透、滤饼龟裂及在脱水阶段收缩和缝裂；在过滤操作中，采用压带过滤机时，要求灌注的是大而疏松的絮凝物，这样可产生自然导流沉淀并在一定时间内控制滤饼的断裂，最后再由带间机械挤压使滤饼完全龟裂；在重力增稠时，为了提高沉降速率并在压缩区中快速皱缩，需要的是大而比较脆的絮凝物。

由上可见，凝聚剂和絮凝剂的选择和荆最及处理条件的优化必须进行广泛的试验研究才能确定下来。

④凝聚剂和絮凝剂的种类凝聚剂和絮凝剂种类较多，其中凝聚剂主要足一些无杌类电解质．由于大部分被处理物质的颗粒带负电荷，因此工业上常用的凝聚剂大多为阳离子型，按分子量可分为低分了体系（即普通无机盐，包括硫酸铝、氯化铝、明矾、硫酸铁和硫酸亚铁、氯化铁和氯化诬铁等）和高分子体系（见表3.3）两大类。

其中低分子凝聚剂成本高，腐蚀性大，凝聚效果在某种场合中不够理想，而高分子凝聚剂加入悬浮液后，一定时间内被吸附在颗粒物表面，以其较高的电荷及较大的分子量发挥电中和及黏结架桥作用，可成倍地提高凝聚效能，且价格相对较低，所以有逐步成为主流药剂的趋势。

有机絮凝剂的相对分子质量大、官能团多、具有很强的吸附架桥能力。

与无机絮凝剂相比，具有用量少、絮凝效果好、种类繁多、且产牛的絮体粗大、沉降速率快、处理过程时间短、产生的沉泥容易处理等优点，所以近20年来有机絮凝剂的使用发展迅速。

这类絮凝剂可分为天然高分子改性絮凝剂（淀粉类衍生物、木质素衍生物、甲壳素衍生物、植物胶改性产物等）和人工合成高分子絮凝剂（见袁3.4）以及微生物絮凝剂。

由表3.4可见，人工合成有机高分子絮凝剂按官能团离解后所带电荷的性质不同可分为阴离子、阳离子、非离子和两性等类型，但由于胶体和悬浮颗粒多带负电荷，常使用阳离子中和颗粒所带电倚，使胶体和悬浮物脱稳絮凝，所以，国内外在合成有机高分了絮凝剂方面的研究已经由过去的阴离子、非离子型逐步向阳离子型高分子絮凝剂转化。

人工合成有机高分子絮凝剂的最大特点是可根据使用的需要采用合成的方法对碳氢链的长度进行调节．原材料的成本较低，并且没有天然聚合物易受酶的作用而降解的弱点，所以发展迅猛，但改性后的天然高分子絮凝剂却具有无毒、可生物降解、原材料广等优点，对胶体和悬浮物的处理作用不可忽视。

微生物絮凝剂是一类由微生物产生的具有絮凝功能的高分子有机物，主要包括以下二类：

a.直接利用微生物细胞的絮凝剂，如某些细菌、霉菌、放线菌和酵母，它们大量存在于土壤活性污泥和沉积物中；b．利用微生物细胞壁提取物的絮凝剂，如酵母细胞壁的葡聚糖、甘露聚糖、蛋白质和N‐乙酰葡萄糖胺等成分均可用作絮凝剂；c．利用微生物细胞代谢产物的絮凝剂，其主要成分为多糖，微生物絮凝剂因其具有良好的絮凝沉淀性能，不存在二次污染，使用安全方便，应用前景诱人，但目前停留在实验室研究阶段，还未进行大规模工业应用。

（4）使用惰性助滤剂惰件助滤剂是一种颗粒均匀、质地坚硬、不可压缩的粒状物质，用于扩大过滤表面的适用范围。

使非常稀薄或非常细和小的悬浮液在过滤时发生快速挤压，使介质的堵塞现象得到减轻，易于过滤。

其原因是允当过滤介质的助滤剂表面具有吸附胶体的能力，并且由此助滤剂颗粒形成的滤饼具有格子形结构，不可压缩，滤孔小会被全部堵塞，可以保持良好的渗透性，既能使悬浮液中细小颗粒状胶态物质截留在格子骨架上，义能使清液有流畅的沟道。

所以使用惰性助滤剂能大大提高过滤能力和生产效率，改善滤液澄清度，降低过滤成本。

助滤剂的使用方法有两种：

①在滤布上预涂一层助滤剂，作为过滤介质使用，待滤毕后与滤饼一起除去；②助滤剂按一定比例均匀地混入待滤的悬浮液中，然后一起进入过滤机，使其形成较松的滤饼，降低其可压缩性，让滤液可以顺畅流通。

采用方法①，在一个旋转真空过滤机的转鼓上，预涂上助滤剂，就可以对非常细小或可压缩的低固含量（5%）悬浮液进行过滤。

在改进的旋转真空过滤机上，采用一把缓慢向鼓面移动的刮刀，在操作时，将滤饼连同一层助滤剂一起刮去，使过滤表面不断更新，以维持正常的过滤速率，直到助滤剂被全部移走后，再重新涂层。

采用方法②，则多数是助滤剂与压滤机结合起来使用，对于菌体较细小、黏度较大的发酵液，可加入助滤剂后进行压滤，或者首先将含助滤剂的悬浮液通过压滤机，形成过滤介质，然后对混有助滤剂的料液进行过滤，这样可提高滤饼的渗透性。

对于后一种方法，一般在助滤剂用量等于进料液中固体含量时，滤速最快。

可作为惰性助滤剂的材料很多，如硅藻土、膨胀珍珠岩、石棉、纤维素、未活化的碳、炉渣、重质碳酸钙或这些材料的混合物。

助滤剂的用量须经优化，而优化的标准取决于过滤的目的。

每单位质量助滤剂的滤液最大产量很可能是最常用的判断标准。

但是最长的周期，最快的流速或者滤饼空间的最大利用率，则是另一些判断标准，它们各自要求不同的助滤剂添加速率。

为了优化而进行的试验．通常是利用实验室或中试规模的过滤实验来完成的。

同时还应注意过滤参数如压力和滤饼厚度的变化所带来的影响。

3悬浮液分离方法和分类3.1悬浮液分离过程的基本概念从培养液中分离、去除悬浮的生物物质颗粒，可以利用如下物理、化学性质：

颗粒密度；颗粒的大小；颗粒的表面性质。

按照颗粒的密度与周围溶液的差别分离悬浮体时，可以使用以下的方法。

（1）沉降（沉清）用于分离2.3m～1mm的大颗粒。

（2）水力旋流分离用于分离5～700m的颗粒。

（3）离心用于分离400～900nm的颗粒。

（4）超速离心用于分离10nm～1m的颗粒。

按照颗粒的大小，可以使用以下的方法分离生物悬浮体。

（1）过滤通过以织物为分离介质的过滤机分10m～1mm的颗粒。

（2）微滤用于分离200nm～10m的颗粒。

（3）超滤用于分离10nm～5m的颗粒。

现已知悉的微生物大小有：

病毒大于10nm，细菌是0.3～1.0m（即300～1000nm），酵母是3～5m．霉菌菌丝体和红细胞约10m。

丝状霉菌的微小菌落大小约1mm，可简易地从液体中分离出来，同样，培养基中的不溶解,组分（粉料、酒精生产时的醪）、牛物催化剂微粒大小约1mm，它们也能较易地从溶液中除去。

而所谓大分子，其颗粒大小在10～120nm，微粒在120nm～10m．细粒悬浮体在10～100m，大的悬浮体在100m～1mm。

颗粒的表面性质则在浮选过程中得到利用，在此方法中被使用的原理不是颗粒的大小或尺寸，而是细胞被空气泡沫维持住的能力，被浮选颗粒在1～200Vm变化。

由于被分离颗粒的已知性质会在某种分离方法使用的条件下有所变化，影响其过程的行为，所以某种分离方法的具体选择应取决于试验的结果。

3.2固‐液分离过程的分类固‐液分离过程的常规分类见图3.2．根据颗粒收集的方式不同，可分为两大类型。

在沉降和浮选所组成的第一类中，液体受限于一个固定的或旋转的容器而颗粒在液体里自由移动，分离是由于内或外力场的加速作用产生的质量力施加在颗粒上造成的。

这种力场可能是重力场、离心力场或磁场，其分离过程不以颗粒到达收集表面为结局。

如果这个过程是连续的，被收集的颗粒必须从筛分容器中转送或排放。

如果作用是重力或离心力（除浮选外）．为了进行分离，在固体和悬浮液体之间必须要有密度差，总之，按照这个原理制成的连续操作设备，明显地比过滤过程便宜。

第二类被不严格地统称为过滤，颗粒受到过滤介质的限制，而液体可自由通过介质，在这一类里，固体和悬浮液的密度不一定要有差异，但是一个完全连续的操作实际上是不可能实现的，如若可行则成本或许会很高，图3.2列出了传统的固一液分离过程，也提出了近年来的一些新方法，但是在发酵液或生物培养液的分离过程中，当前用得较多的还是过滤（包括错流膜过滤）和离心两大方法。

本章重点介绍过滤法，离心分离见第4章。

4过滤法过滤是日前上业生产中用于分离细胞和不溶性物质的主要方法，其操作是迫使液体通过固体支承物或过滤介质，把固体截留，从而达到固一液分离的目的。

由于过滤的对象是生物体及其产物，所以又带来了许多特殊的问题，需要认真对待。

4.1过滤的理论基础从化工原理中已经知道，过滤操作理论分析的起点是达西（Darcy）定律：

定义：

利用多孔性介质（如滤布）截留固‐液悬浮液中的固体粒子，进行固‐液分离的方法称为过滤。

4.2过滤的原理固体颗粒被过滤介质截留，在介质表面形成滤饼，滤液则透过过滤介质的微孔。

滤液的透过阻力来自两个方面，即过滤介质和介质表面不断堆积的滤饼。

过滤操作中，滤饼的阻力占主导地位。

在过滤操作中，压力差是非常敏感和重要的操作参数，特别是可压缩性强的滤饼。

一般需要缓慢增大操作压力，最终操作压力差不能超过0.3～0.4MPa。

提高过滤速度和过滤质量是过滤操作的目标。

由于滤饼阻力是影响过滤速度的主要因素，因此在过滤操作以前，一般要对滤液进行絮凝或凝聚等预处理，改变料液的性质，降低滤饼的阻力。

此外，可在料液中加入助滤剂提高过滤速度。

但是，当以菌体细胞的收集为目的时，使用助滤剂会给以后的分离纯化操作带来麻烦，故需要慎重行事。

4.3常用新型过滤器A，真空过滤器：

真空转鼓过滤器，圆盘真空过滤器，水平带式真空过滤器B，压滤器：

板框压滤器，加压叶滤器，气压罐式连续压滤器，带式压滤器4.4错流过滤由于错流过滤中料液流动的方向与过滤介质平行，因此能清除过滤介质表面的滞留物，使滤饼不容易形成，保持较高的滤速。

错流过滤的过滤介质通常为微孔膜或超滤膜。

错流过滤主要适用于十分细小的悬浮固体颗粒（如细菌）、采用常规过滤速度很慢、滤液浑浊的发酵液。

对于细菌悬浮液，错流过滤的滤速可达67‐118L/（m2.h）。

优点：

①过滤回收率高；②滤液质量好；③减少处理步骤；④对染菌罐批易于处理，也容易进行扩大生产。

缺点：

采用这种方式过滤时，液固两相的分离不太完全，固相中约有70%～80%的滞留液体，而用常规过滤或离心分离，固相中只有30%～40%的滞留液体。

作业：

1．悬浮液预处理的方法有哪些？

2．凝集与絮凝过程有何区别？

如何将两者结合使用？

3．错流过滤的定义及其优缺点。