临床微生物检测的基因同源性分析.docx

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临床微生物检测的基因同源性分析

临床微生物检测的基因同源性分析

      医院感染的流行病学研究是临床微生物学工作者的重要课题，在医院感染监测的研究中，一个很重要的问题就是如何确定感染途径和传播途径，以采取有效预防和控制措施，从而防止医院感染或者暴发流行，因此对微生物鉴定和菌株同源性分析提出了更高的要求。

      目前，传统的细菌鉴定和同源性分析技术已不能很好地满足医院感染诊断和流行病学调查的需要，从型、亚型、株，甚至分子水平上去认识细菌变得愈来愈重要了。

近年来分子生物学的理论和技术在细菌感染诊断中的渗透和广泛应用，使得细菌鉴定、耐药基因的检测、分子流行病学调查变得更加准确、简洁和快速。

细菌DNA 同源性分析技术如脉冲场凝胶电泳、聚合酶链反应、DNA 探针杂交以及序列分析等方法是目前在分子水平上分析细菌的主要手段，它在鉴定细菌感染的爆发、确定院内交叉感染、感染病原菌之间的基因同源性等方面有着重要的作用，本文将对常用基因同源性分析方法的机理和过程做简要综述。

 一、质粒分型（Plasmid profile assay）：

1、原理：

     质粒是可移动的染色体外元件，可以自发丢失或者被宿主稳定地获得，因此流行病学上相关的分离菌株有可能表现出不同的质粒图谱。

把质粒提取出来，进行常规的琼脂糖电泳分析，就可以知道分离菌株携带质粒的大小和数目。

2、实验过程：

a.质粒抽提；琼脂糖电泳；染色、凝胶成像。

3、实验方法的评价：

   优势：

         a.步骤比较简单，对实验仪器要求不高。

         b.在评价那些从局限的时间和地点（如一个医院中的急性爆发）分离出来的菌株非常有效。

   缺点：

          a.实验结果的重复性不好。

          b.分辨力不高。

 二、染色体DNA的限制性内切核酸酶分析（Restriction Endonuclease Assay REA）

1、原理：

    限制性内切核酸酶（REA）在特异的核酸识别序列切割DNA，DNA被消化后，所得到的限制性片段的数目和大小是由酶的识别位点和DNA的组成共同决定的。

在传统的限制性内切核酸酶分析中，人们用含有相对多的限制性位点的内切核酸酶消化细菌的DNA，这样就会得到成百上千条长度在范围内的DNA片段。

恒定的电场琼脂糖电泳，可以根据分子质量的大小将这些DNA片段分开，然后通过EB染色并在紫外灯下观察其图谱。

同一种的不同分离菌株的DNA序列的变异可造成限制性位点数目和分布的变化，所以可以导致其REA图谱出现差异。

2、实验流程：

a.染色体DNA抽提；b.限制性内切酶消化DNA（主要是Hind III）；琼脂糖电泳；

染色、凝胶成像。

3、实验方法的评价：

  优势：

       a.实验流程简单。

       b.所有的菌株都可以这个方法来分型。

   缺点：

       图谱包括成百上千条带，一些条带可能不能检测到，一些条带可能会重叠。

       图谱分析复杂。

       c.分辨力不高。

三、染色体DNA的脉冲场凝胶电泳（Pulsed-Field Gel Eelectrophoresis PFGE）

1、原理：

    用识别位点相对多的酶进行REA的一个重要的局限性，是分析那些大量的、重叠的、分辨力较差的限制性酶切片段构成的图谱相当困难。

如果用限制性位点相对少的酶消化细菌的基因组，那么就可以得到数量相当少但更大的限制性片段，这样在电泳中，穿过琼脂糖的电场作周期性的改变，就可以产生一个有5-20条清晰的分辨较好的图谱。

2、实验流程：

a.染色体DNA抽提；b.限制性内切酶消化DNA（主要是XbaI）；c.凝胶电泳（脉冲场；染色、凝胶成像；e.软件分析。

3、实验方法的评价：

      优势：

          方法的分辨力和可重复性都很高，

          方法是肠球菌, 肠杆菌和葡萄球菌基因分型的金标准。

       缺点：

          a.必须使所有的酶和缓冲液都能浸透凝胶块，准备合适的DNA样品需要延长培育时间。

近来也有报道葡萄球菌和肠球菌可以用相当短的时间来进行PFGE分析。

          b.需要昂贵的专业设备。

四、核糖体分型（Ribotyping）

1、原理：

   核糖体操纵子包括编码16SrRNA和25SrRNA以及一种或多种RNA的核苷酸序列。

核糖体序列高度保守，针对

大肠杆菌rRNA 制备的探针，或者是克隆的核糖体操纵子，可与许多细菌的染色体核糖体操纵子杂交，细菌的基因

组中通常有多个核糖体基因，分别存在于不同长度的酶切片段中，因此核糖体分型可以得到类似指纹的结果，因此

是可以分型的。

2、实验流程：

a.碱性磷酸酶脱去 rRNA末端磷酸；b.[γ-32P]ATP末端标记上述 rRNA；c.抽提DN

A,限制性内切酶消化DNA（主要是Hind III）；d.凝胶电泳、转膜；e.用标好的rRNA探针进行souther 印记、放

射性自显影。

3、实验方法的评价：

   优势：

         a.核糖体序列高度保守, 用大肠杆菌rRNA 制备的探针能对所有的细菌进行分型。

   缺点：

        a.分辨力中等。

         b.流行病学上无关的菌株，有可能有相同的核糖体型图谱。

        c.需要用到放射性同位素，成本很高。

        d.实验步骤繁琐。

   五、限制性内切核酸酶片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism RFLP）的核酸杂交分析

1、原理：

    DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。

因此凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变（新

产生和去除酶切位点）和一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可导致RFLP

的产生。

2、实验流程：

a.裂解细菌，抽提基因组DNA、pvuII酶消化；b.凝胶电泳、转膜；c.过氧化物酶标记过的IS110探

针杂交、X-ray 胶片显影；d. 软件分析。

3、实验方法的评价：

    优势：

        a.能对所有携带与探针同源基因的菌株进行分型。

        b.实验的重复性很高。

     缺点：

        a.样品用量大、纯度要求高。

        b.探针设计的难度大。

        c. RFLP分析技术步骤繁琐，工作量大，成本较高。

六、随机扩增多态性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA   RAPD-PCR）

1、原理：

    由于整个基因组存在众多反向重复序列，单一引物与反向重复序列结合。

使重复序列之间的区域得以扩增。

引物结合位点DNA序列的改变以及两扩增位点之间DNA碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异，经聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离后通过EB染色以检测DNA片段的多态性。

2、实验流程：

a.抽提DNA； b.合成引物， c1. 普通PCR，d1. 琼脂糖电泳，e1.凝胶成像；c2. PCR with [α-35

S]dATP，d2. 尿素多聚丙烯酰胺凝胶电泳，e2.干胶 X-ray显影。

3、实验方法的评价：

  优势：

       a.分辨力高。

  缺点：

      a.可重复性差。

      b.图谱很难解释。

      c.实验步骤繁琐，过程中需要用到同位素。

 七、扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism  AFLP-PCR）

1、原理：

    由于不同物种的基因组DNA 大小不同，基因组DNA 经限制性内切酶酶切后，产生分子量大小不同的限制性片段。

使用特定的双链接头与酶切DNA 片段连接作为扩增反应的模板，用含有选择性碱基的引物对模板DNA 进行扩增，选择性碱基的种类、数目和顺序决定了扩增片段的特殊性，只有那些限制性位点侧翼的核苷酸与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可被扩增。

扩增产物经放射性同位素标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后根据凝胶上DNA 指纹的

有无来检出多态性。

2、实验流程：

a.裂解细菌，抽提基因组DNA；b.限制性内切酶消化；扩增；d.毛细管电泳；e.用ABI-310 Genetic Analyzer分析电泳结果。

3、实验方法的评价：

   优势：

        a.分辨力高。

   缺点：

       a.引物需要同位素标记。

       b.对样品DNA质量要求严格。

       c.实验中需要用到毛细管电泳，一般实验室不具备此仪器。

八、重复片段PCR（repetitive extragenic palindromic rep-PCR）

1、原理：

    rep-PCR所使用的引物是以短的基因外重复序列为基础的。

肠杆菌科成员、一些革兰氏阳性菌和真菌中，都有这些序列，一般说来，这种序列在细菌染色体上有许多位点。

当两个序列的距离足够近时，那么位点之间的DNA片段将被有效的复制。

因为重复序列的数目和位点变化很大，所以不同菌株扩增产生重复片段的大小和数目也就相应的不同。

2、实验流程：

a.抽提基因组DNA； b.合成rep引物、PCR；琼脂糖电泳；d.软件分析结果。

3、实验方法的评价：

  优势：

      a.有较好的重复性。

      b.实验步骤比较简单。

  缺点：

       a.中等的分辨力。

       b.该方法的结果分析是基于Dendron software （Solltech, Inc.,Oakdale, Calif.）软件分析，一般实验室很少有此 软件。

九、核苷酸序列分析 （Nucleotide sequence determination）

1、原理：

    在细菌界中，核糖体的某些学列高度保守，人们可以设计几乎从任何细菌都可以扩增到核糖体序列的引物。

通过测定扩增产物以及分析核糖体操纵子相对变化的区域，就可以确定感染性微生物的类型。

2、实验流程：

a.细菌基因组DNA抽提；b. PCR扩增；产物测序；d.测序结果与GeneBank 序列比对，得出鉴

定结果。

3、实验方法的评价：

    优势：

         a.实验步骤比较简单，结果容易分析。

         b.对一些难于分型的菌株也能得到很好的结果。

    缺点：

         a.代测菌株必须有足够的差异序列以保证切实有效。

         b.目前还不清楚单一位点的测序能否提供可靠的鉴定结果。

随着越来越多的分子技术应用到医院感染的病原菌研究中，为流行病学调查和患者的治疗提供了快捷准确的支持。

然而，医院感染病原菌存在广泛而迅速的变异，这些变异使得菌株的基因同源性分析资料的解释变得错综复杂。

在任何一种分析系统中，一个单一遗传事件（如单个代谢酶的变化或者一条电泳条带的变化）组成的改变，不足以得出两个菌株代表不同菌株的结论，也就是说它们不一定在流行病学上无关。

因此，多种分子分析技术的联用，已成为分子流行病学调查和临床微生物诊断的趋势。

脉冲场凝胶电泳

1984年，Schwartz和Centor发明了交变脉冲场（pulsed-fieldgelelectrophoresis，PFGE）技术，与常规的直流单向电场凝胶电泳不同，这项技术采用定时改变电场方向的交变电源，每次电流方向改变后持续1s到5min左右，然后再改变电流方向，反复循环，所以称之为脉冲式交变电场。

   一、PFGE的基本原理

    脉冲电泳分离DNA大分子的介质是琼脂糖，大于20kb的线性DNA双链片段，在琼脂糖凝胶的网孔中的泳动，就像蛇行似的寻找弯曲蜿蜒的孔隙。

普通的单方向恒定电场给DNA分子的泳动动力方向确定且不发生变化，所以严重影响凝胶电泳分离大分子量DNA片段的效果。

   PFGE施加在凝胶上至少有两个电场方向，时间与电流大小也交替改变，使得DNA分子能够不断地调整泳动方向，以适应凝胶中不规则的孔隙变化，达到分离大分子线性DNA的目的，最大分辨率为5000kb大小的线性DNA分子。

在交变脉冲电场中，大分子量线性DNA改变泳动方向所需时间比小分子线性DNA要长，因为前者变形能力低于后者。

当某一线性DNA在脉冲场中改变形状调整方向进行迁移所需的时间大于脉冲场脉冲维持时间时，该DNA的迁移速度将减为最低。

线性分子改变形状和泳动方向所需时间与其分子量大致成正比，PFGE也是基于不同DNA分子量的差异作为分离不同DNA分子的依据。

当DNA分子变形转向所需时间与脉冲时间较接近时，迁移率与DNA分子量成反比。

根据被分离DNA分子的范围选择适当的脉冲时间，经过较长时间不断变形转向泳动，不同大小的DNA就被分离。

DNA分子的净迁移方向与普通电泳一样，垂直于样品孔。

   影响PFGE分辨率的因素包括几方面：

两个脉冲场的均一性；两个脉冲场的脉冲时间以及它们之间的比率；两个脉冲场的强度和方向。

为了增强PFGE对大小差异较大的DNA样品的分辨率，可采用交变脉冲梯度电场，即在电泳过程中，先用较短的交变脉冲时间使较小的DNA分子分离，然后用较长的交变脉冲时间分离较大的DNA分子。

    二、PFGE分类

（一）正交交变电场凝胶电泳

   正交交变电场凝胶电泳（orthogonalfieldalternatinggelelectrophoresis，OFAGE），两交变电场的电流方向相互垂直。

（二）反转电场凝胶电泳

   反转电场凝胶电泳（fieldinversiongelelectrophoresis，FIGE），交变电场均一并且是180’反向的。

    三、PFGE的电泳条件

    凝胶中琼脂糖的浓度一般为o．8％～1．5％，常用1％。

电泳缓冲液为0．5XTBE，也可用TAE缓冲液。

在OFAGE中对于20cm×20cm的凝胶，选择330V以上的电压，在0．5XTBE中的电流为100—200mA，以达到IOV／cm的电压。

在FIGE中，一般选择140V的电压，0．5XTBE中的电流为50～60mA，电压一般为7V／cm。

通常情况下，电泳宜在5～15℃的低温条件下进行；电泳缓冲液应在两极槽之间循环；而且低电压能产生较整齐的条带；交变电场的交叉角度越大分离效果越好。

   电泳后DNA样品染色，采用0．5ug／mlEB浸泡30～45min，紫外灯下观察拍照。

    四、PFGE技术的应用

（一）分离原核生物的染色体。

（二）人类染色体内切酶物理图谱分析，并将大片段DNA分子直接克隆，是人类基因组序列测定工程中有效的方法之一。

   （三）探测细胞染色体上百万碱基对以上的基因组DNA的缺失。

   （四）适于单向电场电泳难以分辨的DNA物理图谱的制作。