学年高中生物 第2章 酶技术 第8课时 固定化酶的制备和应用同步备课教学案 北师大.docx

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学年高中生物第2章酶技术第8课时固定化酶的制备和应用同步备课教学案北师大

第8课时　固定化酶的制备和应用

[学习导航]　1.阅读教材P42内容，了解固定化酶的常用方法。

2.结合教材P40～41内容，学习固定化乳糖酶的制备。

3.结合教材P42～43内容，检测牛奶中乳糖的分解。

[重难点击]　1.尝试制备固定化乳糖酶。

2.利用固定化酶检测乳糖的分解产物。

一、固定化酶及其制备

由于酶的分离与提纯有许多技术性难题，造成酶制剂来源有限、成本高、不利于大规模使用。

利用固定化酶技术可以解决这些难题。

1.固定化酶

（1）概念：

固定化酶又叫固相化酶，是指固定在载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶。

酶的固定化过程是通过化学或物理的手段，将酶束缚在一定的区间内，固定酶分子在此区间内进行催化作用。

（2）酶的固定方法：

根据酶的性质和载体特性需要采用不同的方法，有时还需要将几种方法联合使用：

①是吸附法：

是将酶吸附到载体表面。

②是载体偶联法：

是将酶通过共价键结合到载体的表面。

③是交联法：

通过把酶交互连接、相互结合从而将酶固定。

④是包埋法：

是将酶或者细胞包埋在细微的网格里。

（3）固定化酶技术的优缺点

①优点：

稳定性好，而且与底物和产物容易分离。

②缺点：

一次只能固定一种酶，不利于催化一系列的反应。

2.固定化乳糖酶的制备

（1）实验原理

①乳糖酶学名为βD半乳糖苷水解酶，是工业中应用相当广泛的一种酶，较多地应用于乳制品加工中。

很多人小肠黏膜内的乳糖酶活性严重降低，导致乳糖不耐症。

用乳糖酶处理部分乳糖，分解为葡萄糖和半乳糖，可以减少这种症状。

②固定乳糖酶用的是凝胶包埋法：

凝胶是由丙烯酰胺（Arc）和N，N－甲叉双丙烯酰胺（Bis）形成的三维网状结构的高聚化合物，将酶和凝胶混合，酶即包埋在凝胶内部的微孔中，从而将酶固定。

（2）方法步骤

①乳糖酶的溶解：

准确称取乳糖酶100mg，然后将其溶解在pH7.3的磷酸缓冲液中，其中单体Arc浓度为质量分数20%，交联剂Bis浓度为质量分数5%。

②聚合：

将含有0.6mLN，N，N′，N′－四甲基乙二胺和200mg过硫酸铵的4mL磷酸缓冲液迅速倒入乳糖酶的溶解液中，缓慢搅拌混匀，4℃条件下进行聚合反应30min。

③漂洗：

聚合反应完成后形成凝胶，用小刀切成小块，用缓冲液洗涤4～6次，0～4℃保存备用。

1.固定化酶依据的原理与其优点分别是什么？

答案　将酶固定在不溶于水的载体上，使酶既能与反应物接触，又能与产物分离；同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用。

2.固定化乳糖酶的制备

（1）制备固定化乳糖酶时为什么要用缓冲液配制凝胶单体？

答案　酶活性易受温度和酸碱度的影响，用缓冲液配制凝胶单体能保持溶液中pH的相对稳定，从而保证实验过程中酶的活性。

（2）漂洗凝胶的目的是什么？

答案　将凝胶表面没有固定的乳糖酶冲洗干净。

归纳总结　固定化酶及其制备的2点总结

（1）固定化酶的优点

①同一批固定化酶能在工艺流程中重复多次地使用；

②固定化后，和反应物分开，有利于控制生产过程，同时也省去了热处理使酶失活的步骤；

③稳定性显著提高；

④可长期使用，并可预测衰变的速度；

⑤提供了研究酶动力学的良好模型。

（2）固定化乳糖酶时的注意事项

①乳糖酶溶解时为了保持酶的活性，需使用磷酸缓冲液。

②缓冲液反复冲洗一方面针对形成凝胶后表面还有一些酶没有包埋在凝胶内部的微孔中被冲洗掉，另一方面维持酶的活性。

③Arc和Bis都是神经性毒剂，操作过程中注意不要沾到皮肤上和吸入体内，一旦沾到皮肤上要立即用水冲洗。

④聚合反应和试剂的质量有很大的关系，如果在教材规定的时间内还没有聚合完成，可以适当延长聚合时间。

1.下列关于固定化乳糖酶的制备的说法，不正确的是（　　）

A.在乳糖酶的溶解中加入磷酸缓冲液是为了维持pH相对稳定，保证乳糖酶的活性

B.聚合过程中应将混有各种物质的磷酸缓冲液迅速倒入乳糖酶的溶解液中，缓慢搅拌混匀

C.聚合过程中各种物质就放在40℃进行聚合反应30min

D.漂洗过程中用磷酸缓冲液洗涤4～6次，将其表面没有固定的酶冲洗掉，0～4℃保存备用

答案　C

解析　固定化乳糖酶的制备过程中始终都应该是用缓冲液来维持pH的相对稳定，以保证酶不会变性失活，而对于聚合反应形成凝胶的过程中应该在温度为4℃条件下进行，而不是40℃。

2.下列属于固定化酶应用特点的是（　　）

①可以被反复利用　②有利于酶与产物分离　③能自由出入载体　④一种固定化酶只催化一种酶促反应　⑤酶多用包埋法固定化

A.①②③B.③⑤

C.①②④D.①②⑤

答案　C

解析　酶被固定后可与产物分离，故可反复使用，但不能自由出入依附的载体。

通常情况下固定化酶种类单一，所以不能催化一系列酶促反应，只催化一种或一类酶促反应。

酶分子较小，不适合采用包埋法进行固定化。

一题多变

（1）在实际生产中，固定化酶技术能节约成本的原因是什么？

答案　固定化酶能被反复利用。

（2）写出如图所示固定化酶的方法。

答案　①是交联法，②是吸附法，③是包埋法。

二、固定化酶的应用

固定化酶在工业生产和医学等方面有着重要的用途，下面我们就利用固定化酶来检测牛奶中乳糖的分解。

1.实验原理

乳糖酶可以将牛奶中的乳糖分解为半乳糖和葡萄糖，还原糖可和斐林试剂反应产生砖红色化合物，根据化合物颜色的深浅变化，可以了解乳糖酶的作用活性。

2.方法步骤

（1）鲜牛奶的处理：

取新鲜牛奶0.5kg放入1000mL干净烧杯中，85～90℃巴氏灭菌。

将灭完菌后的牛奶冷却至45～50℃，过滤后平均分为两部分，一部分放入A烧杯，另一部分放到B烧杯内作对照。

（2）加酶分解：

向A烧杯内加入适量的固定化酶制剂，45～50℃条件下保温45min，保温过程中要用预先灭过菌的玻璃棒每隔一段时间轻轻搅拌。

（3）检测乳糖的分解：

保温到时后，将牛奶过滤。

用移液管分别取A烧杯和B烧杯内的牛奶滤液各2mL，放到两支试管中，用移液管取斐林试剂各2mL分别放入被检试管中，然后把试管放入装有热水的烧杯中，摇动试管，观察试管中溶液颜色的变化。

（4）固定化酶的回收：

实验完成后，用缓冲液反复洗涤固定化酶，再用体积分数为0.05%的双氧水洗涤，然后于0～4℃下保存。

3.实验现象

两只试管中，砖红色较深的是A，说明固定的乳糖酶能分解乳糖，产生还原糖。

4.固定化酶应用的常见方式

（1）间歇式：

每次反应完后，经离心或过滤法收回的酶可以重复使用。

（2）连续式：

用固定化酶制成的反应柱进行不间断的重复使用，如图为固定化葡萄糖异构酶的反应柱示意图。

图中①是反应柱，②是固定化酶，③是分布着小孔的筛板，不允许酶颗粒通过，而反应液可以自由流出。

1.写出乳糖的组成及特点。

答案　乳糖是一种由半乳糖和葡萄糖通过β1,4糖苷键构成的二糖，它的甜度在甜味糖中最小，溶解度也最低。

2.利用斐林试剂检测还原糖的原理是什么？

答案　还原糖与斐林试剂沸水浴会出现砖红色沉淀。

3.为什么固定化酶要回收？

答案　因为固定化酶能在工艺流程中重复多次地使用。

归纳总结　检测牛奶中乳糖的分解实验的注意事项

（1）检测乳糖酶对牛奶的分解时，为了使实验现象更明显，可以适当减少底物鲜牛奶的量或增加固定化酶的含量，或适当延长保温时间。

（2）加酶分解时，温度不宜过高或过低，否则酶变性失活或活性太低，得不到实验结果或不明显。

（3）酶回收要用缓冲液反复洗涤固定化酶，维持酶的活性；再用体积分数为0.05%的双氧水洗涤，达到消毒目的，以防固定化酶被微生物污染；然后于0～4℃下保存，以备下次再使用。

3.下列关于检测牛奶中乳糖的分解实验的相关叙述，错误的是（　　）

A.乳糖酶可以将乳糖分解为半乳糖和葡萄糖

B.还原糖可与双缩脲试剂反应产生砖红色沉淀

C.根据化合物颜色的深浅变化，可以了解乳糖酶的作用活性

D.实验步骤：

鲜牛奶处理→加酶分解→检测乳糖的分解→固定化酶的回收

答案　B

解析　牛奶中乳糖分解的检测原理是乳糖酶可以将乳糖分解为半乳糖和葡萄糖；还原糖可与斐林试剂反应产生砖红色沉淀；根据化合物颜色的深浅变化，可以了解乳糖酶的作用活性。

实验步骤：

鲜牛奶处理→加酶分解→检测乳糖的分解→固定化酶的回收。

一题多变

（1）斐林试剂的组成成分？

答案　斐林试剂是由质量分数为10%的氢氧化钠溶液和质量分数为5%的硫酸铜溶液配制而成的。

（2）斐林试剂的使用特点？

答案　现配现用、混合使用。

1.下列关于固定化酶和固定化细胞的叙述，正确的是（　　）

A.固定化细胞技术在多步连续催化反应方面优势明显

B.在固定化酶的应用中，要控制好pH、温度和溶解氧

C.利用固定化酶降解水体中有机磷农药，需提供适宜的营养条件

D.利用固定化酵母菌细胞进行发酵，糖类的作用只是作为反应底物

答案　A

解析　A项中，固定化细胞技术由于保留了细胞内原有的多酶系统，多步连续催化反应的优势非常明显；B项中，酶的催化受温度、pH的影响，不受氧浓度的影响；C项中，酶的降解作用不需各种营养条件；D项中，糖类的作用不只是作为反应底物，还能维持酵母菌细胞的渗透压，防止酵母菌细胞过多地吸水或失水。

2.下列关于固定化酶技术的说法，正确的是（　　）

A.固定化酶技术就是固定反应物，并将酶依附着载体围绕反应物旋转的技术

B.固定化酶的优势在于能催化一系列的酶促反应

C.固定化酶中的酶无法重复利用

D.固定化酶是将酶固定在一定空间内的技术

答案　D

解析　固定化酶是利用物理或化学方法将酶固定在一定空间内的技术，其优点是酶被固定在一定装置内可以重复利用，缺点是无法同时催化一系列酶促反应；在固定过程中，固定的是酶而不是反应物，因此A、B、C均错误。

3.酶的固定方法不包括（　　）

A.将酶吸附在载体表面上

B.将酶相互连接起来

C.将酶包埋在细微网格里

D.将酶制成固体酶制剂，如加酶洗衣粉中的酶

答案　D

解析　加酶洗衣粉中的酶没有固定，不可重复利用。

4.如图表示某同学进行的澄清苹果汁生产实验，下列相关叙述正确的是（　　）

A.生产过程中不需考虑温度和pH

B.为防止杂菌污染，图示装置制作完毕后应瞬间高温灭菌

C.通过控制阀调节苹果汁流出的速率，保证反应充分进行

D.固定化果胶酶不可重复使用，每次生产前应重新填装反应柱

答案　C

课时作业

[基础过关]

1.固定化酶技术通常采用（　　）

A.包埋法

B.化学结合和物理吸附固定法

C.活化法

D.微囊化法

答案　B

解析　酶的体积较小，容易从包埋的材料中漏出来，所以一般采用化学结合和物理吸附固定法。

2.制备固定化乳糖酶时要用缓冲液配制凝胶单体，下列说法错误的是（　　）

A.酶活性不受温度的影响

B.酶活性易受酸碱度的影响

C.缓冲液配制凝胶单体是保持溶液中pH的相对稳定

D.缓冲液配制凝胶单体可以保证实验过程中酶的活性

答案　A

解析　酶活性易受温度和酸碱度的影响，用缓冲液配制凝胶单体是保持溶液中pH的相对稳定，从而保证实验过程中酶的活性。

3.下列有关检测牛奶中乳糖的分解的实验过程正确的是（　　）

A.取新鲜牛奶0.5kg放入1000mL干净烧杯中，100℃沸水灭菌。

将灭菌后的牛奶冷却至45℃～50℃，过滤后平均分为两部分，一部分放入A烧杯，另一部分放至B烧杯内作对照

B.向A烧杯内加入适量的固定化酶制剂，45℃～50℃条件下保温45min，保温过程中要用普通玻璃棒不停用力搅拌

C.保温到时后，将牛奶过滤。

用移液管分别取A烧杯和B烧杯内的牛奶滤液各2mL，放到两支试管中，用移液管取斐林试剂各2mL，分别放入被检试管中，然后把试管放入装有热水的烧杯中，摇动试管，观察试管中溶液颜色的变化

D.实验完成后，用蒸馏水反复洗涤固定化酶，再用体积分数为0.05%的双氧水洗涤，以防固定化酶被微生物污染，然后于0℃～4℃下保存

答案　C

解析　鲜牛奶处理中是在85℃～90℃温度下巴氏灭菌；加酶分解是用预先灭过菌的玻璃棒每隔一段时间轻轻搅拌；固定化酶的回收是用缓冲液反复冲洗固定化酶。

4.下列不属于固定化乳糖酶优越性的是（　　）

A.对酸、碱耐受力增强，且热稳定性强

B.可以一直使用，缩短生产周期

C.使成本显著降低

D.有利于酶的活性

答案　B

解析　固定化的乳糖酶不仅对酸、碱耐受力增强，而且热稳定性大大提高，有利于酶的活性；同时可以反复使用，缩短了生产周期，使成本显著降低，体现了固定化酶的优越性。

但不能一直使用，只能多次重复使用。

5.研究认为，用固定化酶技术处理污染物是很有前途的。

如将从大肠杆菌得到的磷酸二酯酶固定到尼龙膜上制成制剂，可用于降解残留在土壤中的有机磷农药，与微生物降解相比，其作用不需要适宜的（　　）

A.温度B.pH

C.水分D.营养

答案　D

解析　固定化酶技术是利用物理或化学方法将酶固定在一定空间内的技术，利用了酶的高效性和专一性。

酶与微生物比较来说，它的活性发挥不需要营养。

6.将鲜牛奶进行无菌操作的正确方法是（　　）

A.将牛奶进行高压蒸汽灭菌

B.将牛奶进行加热煮沸灭菌

C.将牛奶在85℃～90℃下巴氏灭菌

D.以上三种方法均可

答案　C

解析　对鲜牛奶的处理一般采用在85℃～90℃下巴氏灭菌。

7.乳糖酶是一种二糖酶，它的作用是（　　）

A.能将所有的二糖分解

B.能将麦芽糖分解成两分子葡萄糖

C.能将动物体内糖原水解成葡萄糖

D.能将乳糖分解成半乳糖和葡萄糖

答案　D

解析　乳糖酶只能将乳糖分解成半乳糖和葡萄糖，体现了酶的专一性。

8.下列说法中，哪项不是在应用酶的过程中常遇见的问题（　　）

A.酶与反应物混合，产品难以提纯

B.酶在生物化学反应中往往难以回收

C.酶遇强酸、强碱、高温等条件易失活

D.酶作为催化剂，绝大多数是蛋白质

答案　D

[能力提升]

9.下列关于固定化酶中酶的说法，正确的是（　　）

A.酶的种类多样，可催化一系列的酶促反应

B.酶被固定在不溶于水的载体上，可反复利用

C.酶作为催化剂，反应前后结构不改变，所以固定化酶可永远利用下去

D.固定化酶由于被固定在载体上，所以丧失了酶的高效性和专一性特点

答案　B

解析　固定化酶不能催化一系列酶促反应的进行；固定化酶被固定在不溶于水的载体上，可以被反复利用，但是随着利用次数的增加，受到外界因素的影响，其活性会逐渐降低；固定化酶具有高效性和专一性的特点。

10.下图中所示的酶固定化技术中属于包埋法的一组是（　　）

A.①②B.①③④

C.①④D.③④

答案　D

解析　①为吸附法，②为交联法，③④为包埋法，③包埋于网格中，④包埋于微胶囊中。

11.关于固定化乳糖酶的溶解操作，正确的是（　　）

A.将一定量的乳糖酶溶解在蒸馏水中

B.将一定量的乳糖酶溶解在56mL0.05mol/LpH7.3的磷酸缓冲液中

C.准确称取乳糖酶100mg，然后将其溶解在Arc浓度为质量分数20%，交联剂Bis浓度为质量分数5%的溶液中

D.准确称取乳糖酶100mg，然后将其溶解在56mL0.05mol/LpH7.3的磷酸缓冲液中，其中单体Arc浓度为质量分数20%，交联剂Bis浓度为质量分数5%（其中含Arc和Bis的磷酸缓冲液要过滤，除去不溶物）

答案　D

12.回答下列有关固定化乳糖酶的制备和应用的问题。

（1）制作固定化乳糖酶及检测牛奶中乳糖的分解步骤分别为：

乳糖酶的溶解→____________→____________；______________→______________→______________→固定化酶的回收。

（2）在制备固定化乳糖酶的过程中，乳糖酶溶解时，用磷酸缓冲液的目的是

______________________________。

（3）检测乳糖酶对牛奶的分解时，为了使实验现象更明显，可以适当

___________________________________________________________________________。

（4）固定化乳糖酶的回收过程是_________________________________________________。

答案　

（1）聚合　漂洗　鲜牛奶处理　加酶分解　检测乳糖的分解　

（2）酶活性易受温度和酸碱度的影响，用缓冲液配制凝胶单体是为了保持溶液中pH的相对稳定，从而保证实验过程中酶的活性　（3）减少底物牛奶的量或增加固定化酶的含量，或适当延长保温时间　（4）实验完成后，用缓冲液反复洗涤固定化酶，再用体积分数为0.05%的双氧水洗涤，以防固定化酶被微生物污染，然后于0℃～4℃下保存

13.固定化酶是从20世纪60年代迅速发展起来的一种技术。

东北农业大学科研人员利用双重固定法，即采用戊二醛作交联剂（使酶相互连接），海藻酸钠作为包埋剂来固定小麦酯酶，研究固定化酶的性质，并对其最佳固定条件进行了探究。

下图显示的是部分研究结果（注：

酶活力为固定化酶催化化学反应的总效率，包括酶活性和酶的数量），分析回答：

（1）从对温度变化适应性和应用范围的角度分析，甲图所示结果可以得出的结论是

________________________________________________________________________。

（2）乙图曲线表明浓度为________的海藻酸钠包埋效果最好，当海藻酸钠浓度较低时，酶活力较低的原因是_________________________________________________________________。

（3）固定化酶的活力随使用次数的增多而下降，由丙图可知，固定化酯酶一般可重复使用________次，以后酶活力明显下降。

（4）固定小麦酯酶不采用海藻酸钠直接包埋，同时用戊二醛作交联剂，这是因为

_____________________________________________________________________________。

答案　

（1）固定化酶比游离酶对温度变化适应性更强且应用范围较广　

（2）3%　海藻酸钠浓度较低时包埋不紧密，酶分子容易漏出，数量不足　（3）3　（4）酶分子很小，很容易从包埋材料中漏出

解析　

（1）从甲图中可看出固定化酶比游离酶对温度变化适应性更强且应用范围较广。

（2）从乙图中可看出海藻酸钠浓度为3%时，酶活力最大，此时的海藻酸钠包埋效果最好，当海藻酸钠浓度较低时包埋不紧密，酶分子容易漏出，数量不足，导致酶活力较低。

（3）从丙图中可看出，当固定化酯酶重复使用3次后，其酶活力明显下降。

（4）酶分子很小，若采用海藻酸钠直接包埋，很容易从包埋材料中漏出，因此一般用戊二醛作交联剂。

14.利用酶生产高果糖浆：

用α淀粉酶将玉米粉水解生成单糖，再用糖化酶处理产生95%～97%的葡萄糖溶液。

葡萄糖的甜度比蔗糖低得多，但利用葡萄糖异构酶将葡萄糖异构化转变成果糖，就可以解决这一问题。

再通过α淀粉酶、糖化酶和固定化葡萄糖异构酶，将玉米粉转化成含葡萄糖50%、果糖42%、其他糖8%的反应物，称为高果糖浆或果葡糖浆。

它虽然是一种混合物，但甜度与蔗糖相当，比葡萄糖高出许多，因此，在饮料、食品生产中大量应用。

现在，一些发达国家高果糖浆的年产量已达几百万吨，高果糖浆在许多饮料的制造中已经逐渐代替了蔗糖。

（1）在生产高果糖浆的过程中，为了使葡萄糖异构酶反复使用，采用了什么技术？

________________________________________________________________________。

（2）在上述生产过程中，若直接用固定化葡萄糖异构酶处理单糖，能得到高果糖浆吗？

说明理由。

________________________________________________________________________。

（3）为使固定化葡萄糖异构酶发挥最大催化效果，在生产过程中需要注意什么？

________________________________________________________________________。

（4）如何测定葡萄糖异构酶的最适pH和最适温度？

写出大致的实验设计思路。

________________________________________________________________________。

答案　

（1）固定化酶技术

（2）不能。

葡萄糖异构酶具有专一性

（3）控制生产过程中的温度和pH

（4）配制浓度相同的酶溶液，设置一系列合理的温度（或pH）梯度，用一系列合理的温度（或pH）梯度下的酶溶液分别与等量葡萄糖混合，经过相同的时间后，测定果糖的生成量，即可确定葡萄糖异构酶的最适温度（或pH）

解析　目前在食品加工、医药等行业广泛采用了固定化酶技术，使酶可以反复使用。

若直接用固定化葡萄糖异构酶处理单糖，不会得到高果糖浆，原因是葡萄糖异构酶只能作用于葡萄糖，使之转化为果糖，而对其他单糖不起作用，这是由酶的专一性决定的。

由于葡萄糖异构酶是生物催化剂，它需要适宜的温度和适宜的pH。

酶的最适温度和最适pH是人们在长期的实验摸索中得出的，一般测定方法是用温度或pH作为自变量，设置合理的梯度，通过比较生成物的量来确定。

[真题体验]

15.（2015·浙江自选，17节选）温度与植酸酶相对酶活性的关系如图所示。

下列叙述错误的是（　　）

A.测试温度中，固定化与非固定化植酸酶的最适温度分别为60℃和45℃

B.测试温度范围内，固定化植酸酶的相对酶活性波动低于非固定化植酸酶

C.固定化与非固定化植酸酶相比，相对酶活性在80%以上时的温度范围较宽

D.65℃时固定化与非固定化植酸酶的相对酶活性因蛋白质变性而位于最低点

答案　D

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