第六 章 人工授精技术Artificial inseminationAI.docx
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第六章人工授精技术ArtificialinseminationAI
第六章人工授精技术
第一节概述
一、人工授精的概念及在家畜生产中的意义（P155）
（一）AI（ArtificialInsemination）概念（记忆，P155）
AI：
使用器械采集公畜的精液，再用器械把经过检查和处理后的精液输入到母畜生殖道，以代替公母畜自然交配而繁殖后代的一种繁殖技术。
利用器械采集公畜的精液，经检查和处理后，再用器械将精液输入到母畜生殖道的适当部位，使之妊娠，以此来代替公母畜自然交配一种科学配种方法。
（二）意义（记忆，P155）
1、提高优良种公畜的利用率；
2、加速畜群的遗传改良；
3、降低饲养管理费用；
4、控制生殖疾病的传播；
5、提高母畜受胎率；
6、促进良种公畜的地区和国际交流。
（三）应注意的问题（P155）
1、遵守操作规程；
2、检查♂的健康及遗传性能。
防止遗传缺陷和某些通过精液传播疾病的扩散和蔓延，以及受胎率下降等问题
二、人工授精的发展概况（P155）记忆
（一）试验阶段
（二）实用阶段
（三）冷冻精液阶段
补充我国AI的情况
40年代未：
开始试验在牛和绵羊进行AI（在新疆、内蒙、广西等地）
50年代：
在猪（广西）。
马。
目前奶牛的AI率为90％左右，本地黄牛的杂交改良在河南、河北、山东、安徽、东三省、内蒙、新疆等省开展得较好。
水牛的AI和杂交改良在云南开展得较好，广西福建和贵州也有一定的基础。
猪的AI主要在南方各省开展得较好，如广西、湖南、福建、江苏、浙江、四川等省。
普及率约为40％—50％。
三、人工授精的基本技术环节（熟悉，P156）
采精
精液品质检查
精液的稀释、
保存（液态保存和冷冻保存）
运输
冷冻精液的解冻与检查
输精
第二节采精
一、采精前的准备
（一）采精场地
使公畜建立良好的性反射并防止精液污染，并能使采精工作易于进行。
采精场内设有采精架以保定台畜，或设立假台畜。
采精场可分为室内和室外两种，室内采精场一般为10×10m2。
（二）台畜的准备
采精时可以用假台畜，也可以用活台畜，但要进行训练，并且其尾根、外阴、肛门等部位要清洗，擦干净。
（三）公畜的准备
1、公畜体况：
必须选用体质健康的公畜。
2、公畜的调教与采精前准备
外激素法：
于假台畜后躯涂抹发情母畜尿液，或阴道粘液。
空爬跨：
在假台畜身旁放一发情母畜，采精前先让公畜空爬几次，待其性兴奋达高峰时即奔向假台畜使其爬跨。
观摩法（隔栏学习法）：
看已调教好的公畜爬跨假台畜采精。
二、采精方法（熟悉，P157-161）
有一定的技术要求：
（1）可以收集到公畜的一次射出的全部精液；
（2）不影响精液品质；
（3）公畜的生殖器官和性机能不受损伤或影响，当然人也要保证安全（利于人畜安全）；
（4）器械用具必须简单和使用方便。
目前常用的方法：
假阴道法、按摩法、电刺激法、手握法等
（一）假阴道法（于各种家畜）
原理：
利用模拟母畜阴道环境，并诱导公畜在其中射精，从而获取精液。
1、假阴道的结构：
外壳、内胎、集精瓶（杯）、及附件构成
定义：
借助特定的器械将雄性的精液采集出来的技术。
2、应满足三个条件：
温度、压力和润滑度
（1）适宜的温度：
加入温水（38-40℃）；外壳和内胎之间的容积装2/3入温水
（2）适当的压力：
冲入气体；
（3）一定的润滑度：
涂抹消毒润滑剂。
3、采精操作（实验和生产实习中学习）（P158-159）
（1）可以将假阴道置于假台畜后躯内，并使假阴道纵轴方向与公畜阴茎伸出方向在同一直线上。
（2）采精员也可以站在台畜右侧，手持假阴道采精，当公畜爬跨阴茎勃起伸出，将阴茎导入假阴道。
（二）手握法（于猪和犬）
1、公猪的手握法采精
是模仿母猪子宫颈对公猪螺旋状阴茎龟头约束力而引起射精的生理刺激，以手握住其阴茎龟头呈节奏性松紧给与压力进行刺激，因此适当压力很重要。
筒握法——是假阴道和手握法相结合的方法，具有假阴道和手握法双重优点。
用普通的假阴道，但前端未装集精瓶。
当公猪阴茎插入假阴道后，在假阴道漏斗部握住公猪龟头采精的方法。
2、犬的手握法采精（P159）自学
（三）电刺激法（P160）
利用电刺激采集器刺激公畜引起射精而进行采精的一种方法。
适合于各种家畜和动物，更适于那些种用价值高而失去爬跨能力的优良公畜、或不适宜用其他方法采精的小动物和野生动物。
（四）按摩法采精（P160-161）
采精时通过采精员的手指对生殖器官及副性腺进行按摩刺激，以引起性欲而出现射精。
该法适于无爬跨能力的公牛和禽类。
三、采精频率（P161）
采精频率（记忆）：
是指每周内对公畜的采精次数。
依据：
在正常下采集的数量和贮存量，每次射精量及精子总数，精子活率，精子形态正常率，公畜的饲养管理状况等。
对于在科学饲养条件下健壮的公畜——多贡献——可适当增加采精频率。
公牛：
2-3次/周
猪、马：
因为射精量大，隔日一次.
绵、山羊：
配种季节内，每天可采精多次，并连续数周。
（为何？
因为他们是季节性发情动物，所以配种季节短，而且他们的射精量少）
一般在观察到精子尾部有未脱落的原生质小滴，说明采精频率过高，此时应减少或停止采精。
采精频率是以雄性生产精子的能力来决定。
eg.每克睾丸组织每天产生2500万精子
一头公猪的一对睾丸重1000克
一次射精量为 250ml
每ml精子数为 2亿
则2500万×1000克×7日＝1750亿精子/周
每次射精精子数＝250ml×２＝500亿
每周采精次数为1750亿÷500亿＝2.5次
第三节精液品质检查
包括：
外观检查（精液量、色泽、气味、PH）
实验室检查（精子活率、密度、形态）
其他检查（精子生存时间、生存指数、代谢能力检查、微生物检查等）
一、外观评定
（一）精液量
定义：
指公畜一次采精时射出精液的量。
奶牛：
5-10；肉牛：
4-8；绵羊：
0.8-1.2；猪：
150-300；山羊：
0.5-1.5；马：
30-100
（二）颜色
一般为乳白色、浅灰色或浅乳黄色。
正常牛羊精液呈乳白色或乳黄色，猪、马的精液呈淡乳白色或浅灰白色。
颜色发生改变常表明精液异常，
如黄色表明混有尿液；淡红色为混有血液；浅绿色为混有脓液。
（三）气味（P162）
一般略带腥味。
（四）PH（P162）
一般新采集的原精液PH近中性，牛、羊精液呈弱酸性（pH值为6.5-6.9），猪、马精液呈弱碱性（PH值为7.4-7.5）。
一般同种精液pH值较低的品质较好。
但稀释的精液其pH与品质无太大关系
二、实验室检查（P163-166）
（一）精子的运动能力
1、精子活率（spermmotility）（记忆）：
指精液中呈直线运动的精子占精子数的百分比。
一般在37-38°C温度下进行评定，牛、羊精液尚需用生理盐水作稀释后才能评定。
活力一般用0-1.0的10级评分，一般新鲜采精液活率应该为0.7~0.8左右。
2、死活精子百分率（染色）
用伊红-苯胺黑，活不着色，死着色，用此法测得的结果要比实际活率高。
3、精子的云雾状运动状态
多见于牛羊。
浓份精液因精子密度大、活力强，使精液翻腾呈现旋涡云雾状。
（二）精子密度（精子浓度）
精子密度（spermconcentration）（记忆）：
指每毫升精液中所含的精子数。
它是衡量单位体积精液数量的指标，使计算稀释倍数和数量的依据。
（一）估测法
在低倍显微镜下根据精子之间的距离来定，分为密、中和稀三等。
此法在生产中应用最广。
但在熟练应用前应多与计数法比较，得到一个计数与目测的联系感觉。
（二）血细胞计数法
取1ul精液或其稀释液渗入血细胞计数板内，计数精子数目并根据倍数算出精液密度。
（三）光电比色法
是根据精子的透光性而测定精子数的方法。
透光性越高，则精子数越少，透光性越差，则精子数越多。
现在甚至可与计算机联接，立即知道被测精液的活率和密度。
四、精子的形态检查
1、精子畸形率头部、颈部、尾部，观察200个精子,求出比例。
用于输精的精子畸形率不得超过20%。
头部：
巨大，细小，缺失，双头，轮廓不明显，皱缩
颈部：
臌大，纤细，弯曲，不全，原生质滴
尾部：
屈折，带原生质滴，双尾，折断，纤细
2、精子顶体异常率
顶体与精子受精能力直接有关，牛超过14%，猪超过4.3%，显著降低受精率。
三、其他检查（P166-167）
（一）精子生存时间和生存指数
精子生存时间（记忆）—指精子在体外一定条件下（稀释液、稀释倍数、保存温度和方法等）的总生存时间。
精子生存指数（记忆）—相邻两次检查的间隔时间与平均活力之积。
是精子存活时间与精子活率下降变化的一项综合指标。
精子生存时间越长，则生存指数越大。
检查时间
间隔时间（h）
活率
2次检查平均活率
h×平均活率
日/月时间
6/46
0
0.8
—
14
8
0.6
0.7
5.6
22
8
0.5
0.55
4.4
7/46
8
0.3
0.4
3.2
14
8
0.2
0.25
2.0
22
8
0.1
0.15
1.2
8/46
8
摆动
0.05
0.4
∑=48
∑=16.8
生存指数：
h×平均活率=16.8
生存时间：
48-8/2=44h
（二）精子代谢能力测定（P167）自学
1、美蓝褪色试验
美蓝是氧化还原剂，氧化呈蓝色，还原呈无色，精子在美蓝溶液中，呼吸时氧化脱氢，美蓝获得H+后便使蓝色还原为无色。
因此，根据美蓝褪色时间可测知精液中存活精子数量多少，判定精子的活率和密度高低。
2、精液果糖分解测定
精液果糖分解能力与精子活力密切相关，因此测定一亿精子每小时消耗果糖的mg数来表示精子的果糖分解能力，甚至反映精子活率和密度的高低。
3、精子耗氧率
1亿精子在37℃1h内所消耗的O2，以μl数表示,反映精子活率和密度的高低。
4、乳酸产量
（三）微生物检查（P167）自学
第四节精液的稀释
一、精液稀释液的主要成分
精液稀释（记忆）：
指向精液中加入适宜于精子存活、保持其受精能力的稀释液。
精液稀释的目的（记忆）（P169）：
Ø扩大精液量—增加可配♀数；
Ø延长存活时间；通过向精液中添加营养物质和保护剂可延长精子在体外延长时间；
Ø便于运输和保存。
一、精液稀释液的主要成分
（一）营养物质——供能
糖类、奶类和卵黄均可。
如果糖、葡萄糖、
乳糖和蔗糖等。
（二）保护性物质——维持PH、防冷休克、抗冻及抗菌物质
1、缓冲物质：
保证精液适宜pH值，利于精子的存活，如柠檬酸钠、磷酸二氢钾、Tris。
2、防冷休克：
在精液在冷冻或解冻过程中，精子内外环境的水分，将经历液态和固态的转化过程，对精子危害较大。
抗冷物质中卵磷脂和乳脂的双向亲和性对保护精子不受或减弱冷打击。
常用卵黄或奶类。
3、抗冻：
在冷冻过程中，精液由液态向固态转化，对精子危害很大，不适用抗冻剂，精子复苏率很低。
而抗冻剂有提高精液冰点，少量渗入精子可降低冷冻损伤，从而达到抗冻作用。
常用的抗冷冻剂为甘油、乙二醇、DMSO。
4、抗菌：
抑制精液中和操作中带入的微生物的繁殖。
双抗等。
（三）其他添加剂
二、稀释液的种类和配制
（一）稀释液的种类
1、现用稀释液
奶类和等渗糖类为主。
2、常温保存稀释液
用于常温保存精液，pH较低。
3、低温保存稀释液
用于低温保存精液，含有卵黄和奶类等抗冷休克物质。
4、冷冻保存稀释液
用于冷冻保存精液，含有卵黄和奶类等抗冷休克物质。
和含抗冻物质如甘油、DMSO。
（二）稀释液的配制（P169）
原则上现用现配，稀释液与精液等渗。
1、容器洗涤、消毒；
2、稀释用水清洁无毒；（蒸馏水：
现制、灭菌）
3、药品纯净、称量准确；
4、高温消毒或过滤除菌；（成分要纯净，溶解过滤后消毒，高温变性药品应用细菌滤膜过滤）
5、注意保持酶类等物质的活性。
（抗生素、酶类、激素、维生素等，稀释液消毒冷却后加入）
三、精液稀释方法和稀释倍数（P169）
（一）方法（P169）
1、操作温度应在30℃左右；
2、稀释液与精液温度一致；
3、将稀释液缓慢倒入精液中；
4、高倍稀释应分次进行；
5、稀释后立即镜检。
以确保操作正确
（二）稀释倍数（P169）参考表6-3
稀释倍数=稀释液的量/精液量
1、公牛：
10-40倍（1000万/计量）
2、马、驴：
2-3倍
3、猪：
2-4倍（1亿/毫升）
4、羊：
2-4倍
如何精确计算一份精液的稀释倍数？
首先要考虑以下几个因素：
猪
1、该份精液总量250ml
2、精子密度2亿/ml
3、有效精子数（保存后使用前精子活率） 0.6
4、每次输入有效精子数10亿
5、每次输精量20ml
该份精液的有效精子数：
250ml×2×0.6=300
则分成的份数：
300亿/10亿=30份
则稀释后总量：
30×20=600ml
则稀释倍数：
600-250/250=1.4
第五节精液保存
精液保存（semenpreservation）目的：
1、延长精子的存活时间及维持其受精能力；
2、便于运输；
3、扩大精液使用范围，增加受配母畜数，提高种公畜的配种效能。
精液冷冻保存方法分二大类:
液态保存
冷冻保存
一、液态精液保存（P170）
定义（记忆）：
指精液稀释后，保存温度在0℃以上，以液态形式作短期保存。
分为：
常温保存和低温保存
（一）常温保存（15-25℃）P170（3-7d）
1、原理
酸性环境，抑制运动、代谢
2、稀释液
能量物（如葡萄糖）：
以补充精子活动消耗的能量；
缓冲体系（如柠檬酸钠、碳酸氢钠）：
以缓冲精子代谢产生的酸性物；
抗生素：
用于抑制微生物的繁殖。
猪（17-18℃）、马、绵羊、牛
3、保存方法（隔水降温）
储存在室内、地窖及自来水中
按输精剂量分装——封口——贴好标签——放入保温瓶，水井或地窖（保持温度恒定）。
（二）低温保存（0-5℃）P171（5-7d）
1、原理
低温抑制精子运动和代谢
2、稀释液
牛、猪、马、绵羊
加抗冷休克物质（奶类和卵黄）
3、保存方法
（1）缓慢降温（30℃→0-5℃，0.2℃/min）
（2）贮存在冰箱中，保持温度恒定
（3）输精前升温至30℃
二、精液的冷冻保存
定义（记忆，P172）：
是指将采集的新鲜精液，经过特殊处理后，主要利用液态氮（-196℃）作为冷源，以冻结的形式保存于超低温环境下，进行长期。
（一）精液冷冻保存的意义（记忆，P172-173）
1、极大地提高了优良种畜的利用效率；
2、开展国内、国际间的交流
3、推动繁殖新技术在生产上的应用；
4、建立动物精液基因库。
（二）精液冷冻保存的原理（记忆，P173）
1、冷冻保存的温度为-196℃（液氮）和-79℃（干冰）的超低温
2、超低温条件下精子代谢处于静止状态
3、精子内外水分子在低温下的变化
（1）晶体化（0--60℃）：
物、化伤害
（1）机械损伤：
精子形成冰晶和冰晶增长的过程；
（2）渗透压损伤：
精子细胞内外水分先后冻结，造成渗透压不平衡，促使细胞脱水，原生质变干死亡。
需快速通过该温度范围
（2）玻璃化（-60--250℃）：
快速降温形成。
水分子无序形成玻璃样的超微粒结晶，对精子无害。
精子在超低温条件下完全停止代谢活动，生命处在静止状态。
升温后又能复苏而不失去受精能力。
其原因是精子在冷冻过程中应尽可能形成玻璃化，防止精液形成大的冰晶。
因为冰晶的形成是造成精子死亡的主要物理因素。
精液经过特殊处理后在超低温下形成玻璃化。
水分子保持原来无序状态，形成纯粹玻璃样的超微粒结晶。
精子在玻璃化状态下，原生质不脱水，膜结构不受到破坏，解冻后仍可恢复活力。
玻璃化是可逆的，不稳定的，当缓慢升温时又可能形成冰晶化。
4、抗冻剂的作用
（1）防止冰晶形成、增强精子抗冻力（甘油亲水性很强：
在水结晶过程中限制和干扰水分子晶格排列，使水处于过冷状态，降低水形成结晶温度；甘油渗入精子：
使部分水分和盐类排出，避免了电解质浓度增加的不良影响。
但甘油、DMSO对精子有毒害作用，浓度过高又会影响精子的活力和受精能力）
（2）抗冻物质：
甘油、二甲基亚砜、乙二醇
原理：
利用超低温使精液和精子快速冷冻，快速越过形成冰晶的温度范围（0-60℃）、精液或精子中的水分不形成冰晶化（crystallization），而是形成玻璃化（vitrification）（-60--250℃）。
同时在抗冻剂的存在下使精子免受冻伤，在温度上升至体温精液解冻后精子能够保持完整的形态结构、功能和受精能力。
（三）冷冻保存稀释液（见表6-8，9，10）
（四）精液冷冻保存的技术程序
1、精液的稀释（P176-177）
（1）一次稀释法
快捷但甘油毒害大。
牛用甘油浓度以5%-7%为宜；猪用以1%-3%为宜
（2）二次稀释法
稀释一半（无甘油）
↓
1小时缓慢降温（30℃→5℃）
↓
等温稀释（甘油）
2、分装与平衡
（1）精液的分装
冷冻精液采用颗粒、细管、安瓿瓶和袋装四种分装方法，目前多用细管分装。
①颗粒精液（pelletsemen）：
约0.2ml一粒，似小黄豆大
优点：
易制作、体积小、易于保存占容器空间小
缺点：
无法标记、污染严重使用操作不便
此剂型在国外已被淘汰，国内也已逐渐淘汰
②细管精液（strawsemen）：
0.25ml和0.5ml
优点：
可标记、污染少、输精操作方便
缺点：
体积大、保存占容器空间大
此型已在国外广泛采用，国内已有约60％以上采用。
③安瓶和袋装——用于公猪和公马精液的冷冻
（2）平衡（P177）
①降温
1-2h缓慢降温（30℃→5℃）
降温：
指精液采出稀释后由30℃以上温度经1~2h缓慢降至5℃，以防低温打击。
②平衡
5℃的精液在冰箱中（5℃）放置1-2h
平衡：
指加含甘油稀释液对精子作用的时间。
目的是使精子有一段适应低温的时间，使甘油充分渗透进入精子体内，达到渗透的活性物质平衡，产生抗冻作用。
一般将降温至5℃的精液于这一温度下平衡1-2h或3-5h。
3、精液的冷冻即冻结（freezing）（液氮熏蒸法）距液氮平面一定距离，T为-80~-100℃范围之处进行熏蒸。
（1）颗粒精液冷冻法
（2）细管和安瓶精液冷冻法
4、精液的解冻（thawing）
有低温（0~5℃），温水（30~40℃），高温50~70℃三种。
目前都用30~40℃的温度进行解冻。
细管、安瓿或袋装精液都直接投入到35~40℃的温水中，等管中精液解冻一半时，立即取出备用。
牛细管精液解冻：
38℃±2℃温水
颗粒精液：
①干解冻：
将颗粒投入到于35~40℃温水中预热的试管内使之融化，同时加入1ml20~30℃的解冻液（2.9％柠檬酸钠液或2.9％柠檬酸钠液与5%葡萄糖液各半混合）
②温解冻：
将1ml解冻液在35~40℃温水中预热，然后将1个颗粒投入到其中摇动直至融化。
原则上，输精前解冻后的精子活率不低于0.3，解冻后即输精。
液态精液活率不低于0.6，可用于输精。
5、冷冻精液保存与运输
（1）冻精保存
合格的冻精，包装妥善并做好标记（站名、家畜品种、种畜号、冻精日期、剂型批号、精子活率、数量等），置入液氮罐内，保存过程中，温度恒定，精液品质不变，才能达到长期保存的目的。
（2）冻精运输
专人负责，用液氮容器盛装，内充满液氮，有保护外套，小心轻放。
装在车上要安放平稳、拴牢，严防撞击和倾倒。
切不可斜放、叠放或压入其他物品。
避免暴晒和强烈震动，如长途运输，要及时补充液氮。
第六节输精
一、输精前的准备
在输精前，在建场就必须考虑。
A精液处理室——８～１０m2，房屋尽可能高质量，根据要求设计，有精液处理的常用工具、器皿。
B输精场（室）——母猪输精通常在猪舍进行，奶牛大多数亦在奶牛的床位上进行，只是在县、乡的配种站用建输精场。
1、母畜的准备：
母畜的发情鉴定和保定
通常将母畜置于输精架内或用脚绊保定，母猪不需要保定，输精前要对阴户清洗干净。
2、输精器材的准备：
输精用具一般在用前要彻底洗涤并消毒，输精管内壁用前经稀释液冲冼。
每头母畜使用一支输精管，不能相互共用。
3、精液的准备
新鲜采集的精液，必须检验合格才能使用，常温或低温保存的精液必须升高温度至35℃，镜检活率不低于0.6，冷冻精液解冻后镜检活率不低于0.3,才能使用。
根据不同的畜种确定精液需要量后进行输精。
4、输精人员的准备：
主要是剪短并磨平指甲，用75%酒精消毒，再于手臂上涂上润滑剂。
目前已经使用长手套。
二、输精要求（记忆，P179-180）
参见表6-11
三、输精方法
（一）母牛输精方法
1、开膣器输精法：
目前已经不用
2、直肠把握子宫颈输精法
于直肠内隔直肠壁握住子宫颈外端，另一只手持输精导管插入阴门避开尿道口，
插入子宫颈口进行子宫输精。
优点：
（1）用具简单，操作安全，不易感染；
（2）母牛无痛感；
（3）输精部位深，受胎率较高；
（4）可防止误给孕牛输精而引起流产。
所以：
牛和水牛的输精方法和要求：
1、方法——直肠把握法
2、输精剂量：
冷冻精液0.25-1ml，液态精液1-2ml
3、输入有效精子数：
冷冻：
0.1-0.2亿,液态：
0.3-0.5亿
4、输精时间——发情开始后10-12h，或排卵前10-20h
5、输精次数——间隔8～10h2次
6、输精部位——子宫颈深部或子宫体内
（二）母猪输精方法
由于母猪子宫颈与阴道连接处无明显的界限，输精时可用输精管插入法。
母猪输精方法和要求（记忆）：
１、方法：
直接插入法输精（与母猪的生殖道结构特点有关）。
２、输精时间：
发情开始后1~1.5d（19-30h）或接受“压背试验”后8~12h。
３、输精次数：
间隔8～10h2次
４、输精量：
液态：
30-40ml，冷冻：
20-30ml
５、输入有效精子数：
液态：
20～50亿；冷冻：
10～20亿
6、输精部位——子宫内
其他动物的输精方法和要求自学。
四、影响受胎率的因素（熟悉，P182）
1、精液品质：
好坏主要反映在精子活率和受精能力强弱上。
这与公畜合理的饲养管理和配种制度有很大关系。
2、母畜体况和繁殖机能：
母畜正常的发情排卵及明显的发情都会对提高受胎率有帮助。
3、输精适期
4、操作人员技术水平：
输精员水平的高低可反映到受胎率上。
AI必须严格遵守卫生消毒制度和操作规程。
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