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内参即是内部参照

内参即是内部参照，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测基因的表达水平变化时常用它来做参照物。

常用的PCR内参有GAPDH、β-actin、18sRNA、28sRNA、B2M、ACTB、SDHA、HPRT1、ARBP内参基因等

正向引物（上游引物）是沿着负链进行不间断延长的

　　反向引物（下游引物）是沿着正链进行一段段延长的

　　正链是含有目的基因的那条链。

　RT-PCR为反转录RCR（reversetranscriptionPCR）和实时PCR（realtimePCR）共同的缩写。

逆转录PCR，或者称反转录PCR（reversetranscription-PCR,RT-PCR），是聚合酶链式反应（PCR）的一种广泛应用的变形。

在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。

　由一条RNA单链转录为互补DNA（cDNA）称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。

随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。

原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下互补DNA。

　RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。

RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。

（检测基因表达的方法，参见NorthernBlot法。

RT-PCR的关键步骤是在RNA的反转录，要求RNA模版为完整的且不含DNA、蛋白质等杂质。

常用的反转录酶有两种，即鸟类成髓细胞性白细胞病毒（avianmyeloblastosisvirus,AMV）反转录酶和莫罗尼鼠类白血病病毒（moloneymurineleukemiavrius,MMLV）反转录酶。

RT-PCR有时候也会指代实时PCR（real-timePCR）。

为了与逆转录PCR相区别，通常被写作“定量PCR”（quantitativePCR）或者RTQ-PCR（real-timequantitativePCR）。

3实时PCR

　　实时PCR（real-timePCR），属于定量PCR（Q-PCR）的一种，以一定时间内DNA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。

realtimePCR的定量使用荧光色素，目前有二种方法。

一种是在dsDNA中插入特异的荧光色素，例如SYBRGreen荧光染料；另一种使用一种能与增幅DNA序列中特定寡核酸序列相结合的一种荧光探针（probe），如Taqman探针。

两种方法原理不同。

SYBRGreen荧光染料游离时不发光，当反应体系中存在双链DNA时，SYBRGreen与双链DNA结合，此时才发光。

Taqman探针带有一个荧光基团和一个淬灭基团，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭基团则在3’末端。

PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，此时荧光基团发出的荧光信号可以被检测到。

　　realtimePCR与reversetranscriptionPCR相结合，能用微量的RNA来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。

这两种RTPCR的组合又被称之为“定量RT-PCR（quantitativeRT-PCR）”

RT-PCR技术相关试剂

1oligo:

多聚体，相当于mRNA引物

2AMVRT：

禽类成髓细胞瘤病毒逆转录酶

3MMLVRT：

莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶

4dNTPs：

脱氧核苷酸

5RNase：

RNA水解酶

6PCRBuffer：

RT-PCR缓冲液

7MgCl2：

2价镁离子

PCR各步骤的目的

5.1预变性

　　破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。

使DNA充分变性，减少DNA复杂结构对扩增的影响，以利于引物更好的和模板结合，特别是对于基因组来源的DNA模板，最好不要吝啬这个步骤。

此外，在一些使用热启动Taq酶的反应中，还可激活Taq酶，从而使PCR反应得以顺利进行。

5.2三种循环

8模板DNA的变性：

模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

9模板DNA与引物的退火（复性）：

模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

10引物的延伸：

DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。

5.3延伸时间原因

11用PCR仪扩增时,（变性.退火,延伸）循环完成后,继续72度延伸了10分钟的原因：

12延伸时间取决于待扩增DNA片段的长度。

（当然是在反应体系一定的条件下）例如，使用TaqDNA聚合酶，72度时的碱基掺入率为35-100bp/s，因此延伸速率为1kb/min。

13根据延伸速率推得，扩增1kb以内的DNA片段1min即可，而3-4kb则需要3-4min，依次照推。

通常在最后一轮要适当的将延伸时间延长至4-10min，这样做是使PCR反应完全以提高扩增产量。

14继续72度延伸了10分钟除了可以使PCR反应完全以提高扩增产量外，还有一个作用是：

在用普通Taq酶进行PCR扩增时在产物末端加A尾的作用，可以直接用于TA克隆的进行。

5.4PCR引物的选择

　　对靶序列中潜在的引物位点进行分析，这些位点应该不会形成同源多聚体机构，也没有明显的形成二级结构的趋势，不会自身互补，与基因组中的其他序列无显著的同源性。

15依据寡核苷酸引物与其靶序列形成杂合分子的熔解度的计算中提供的公式计算各引物的熔解温度。

16选择一对匹配完好的正向和反向引物。

两条引物的G+C含量相似，将产生一种大小和碱基组成合适的产物。

两条引物与所扩增片段的GC含量都应在40%-60%之间。

17对寡核苷酸的长度和/或位置进行细调。

使得引物的3‘末端核苷酸为G或C。

检查两条寡核苷酸之间有无明显的互补性。

作为一条经验性的规律，一条引物上不该含有三个连续的与另一条引物互补的核苷酸。

5.5注意事项

18双链DNA的变性温度是由双链中C+G的含量决定的，C+G含量越高，模板DNA的溶解温度就越高。

在选择的变性温度下，模板链越长变性所需时间就越长。

如果变性温度过低或变性时间过短，会使仅仅富含A+T区域变性。

当模板DNA的G+C含量超过55%的时需要更高的变性温度。

19复性过程采用的温度至关重要如果复性温度太高，寡核苷酸引物不能与模板很好的复性，扩增效率将会降低。

如果复性温度太低，引物将产生非特异性复性，从而导致非特异性的DNA片段的扩增。

复性通常在比理论计算的引物和模板的溶解温度低3—5℃的条件下进行。

20PCR扩增所需的循环数目决定于反应体系中起始的模板拷贝数以及引物延伸和扩增的效率。

一旦PCR反应进入几何级数的增长期，反应会一直持续下去，直至某一成分成为限制因素。

从这一点上来说，扩增产物中绝大多数应该是特异性的扩增产物，而非特异性的扩增产物应该低到难以检测到的程度。

用TaqDNA聚合酶（效率为0.7）在一个含有10的5次方个拷贝的靶序列的反应体系中进行30个循环后往往可以做到上述的理想情况。

RT-PCR的RNA如何定量

设计内参引物，一般来说，是actin基因先确定循环数：

设置不通的循环数，用反转录cDNA为模板进行PCR扩增，以能扩出来条带为循环数均一化模板：

不同体积的cDNA为模板，以确定的循环数为扩增循环数，进行PCR扩增，调节模板的量到扩增亮度一致时，cDNA的量就一样了然后，再用你自己的引物进行扩增，就可以得到理想结果了

RT-PCR技术原理、步骤与注意事项RT-PCR简介RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。

RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。

（检测基因表达的方法，参见NorthernBlot法。

）RT-PCR有时候也会指代实时PCR（real-timePCR）。

为了与逆转录PCR相区别，通常被写作“定量PCR”（quantitativePCR）或者RTQ-PCR（real-timequantitativePCR）。

实时PCR实时PCR（real-timePCR），属于定量PCR（Q-PCR）的一种，以一定时间内DNA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。

realtimePCR的定量使用萤光色素，目前有二种方法。

一种是在dsDNA（双链DNA）中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅DNA序列中特定寡核酸序列相结合的一种萤光探针（probe）。

realtimePCR与reversetranscriptionPCR（反转录PCR））相结合，能用微量的RNA来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。

这两种RTPCR的组合又被称之为“定量RT-PCR（quantitativeRT-PCR）”RT-PCR技术相关试剂oligo:

多聚体，相当于mRNA引物AMV（M-MLV）：

逆转录酶dNTP：

脱氧核苷酸RNase：

RNA酶抑制剂PCRBuffer：

RT-PCR缓冲液MgCl2：

2价镁离子PCR各步骤的目的

（一）预变性：

破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。

使DNA充分变性，减少DNA复杂结构对扩增的影响，以利于引物更好的和模板结合，特别是对于基因组来源的DNA模板，最好不要吝啬这个步骤。

此外，在一些使用热启动Taq酶的反应中，还可激活Taq酶，从而使PCR反应得以顺利进行。

（二）变性--退火--延伸循环：

①模板DNA的变性：

模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：

模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：

DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。

（三）PCR仪扩增循环后72度延伸10分钟用PCR仪扩增时,（变性.退火,延伸）循环完成后,继续72度延伸了10分钟的原因：

1.延伸时间取决于待扩增DNA片段的长度。

（当然是在反应体系一定的条件下）例如，使用taqDNA聚合酶，72度时的碱基掺入率为35-100bp/s，因此延伸速率为1kb/min。

2.根据延伸速率推得，扩增1kb以内的dna片段1min即可，而3-4kb则需要3-4min，依次照推。

通常在最后一轮要适当的将延伸时间延长至4-10min，这样做是使pcr反应完全以提高扩增产量。

3.继续72度延伸了10分钟除了可以使pcr反应完全以提高扩增产量外，还有一个作用是：

在用普通taq酶进行PCR扩增时在产物末端加A尾的作用，可以直接用于TA克隆的进行。

RT-PCR的注意事项在做Northern等杂交实验、构建Cdna（互补DNA）文库、获取能够编码真核生物蛋白的基因、获得RNA病毒基因时，会用到RNA提取和RT-PCR技术。

真核生物的基因组是DNA，为什么不直接从DNAPCR得到我们需要的基因呢？

因为真核生物的基因含有大量的非编码区，称为内元（intron），真正编码蛋白的区段是被这些内元隔开的，这些编码区叫做外元（exon）。

真核生物的DNA转录成为RNA之后，经过剪切和拼接，去掉这些非编码区，才形成成熟的mRNA，由mRNA再翻译成蛋白质。

所以，如果直接从真核生物的基因组DNA获取目的基因，克隆再表达，试图获取目的蛋白的思路是行不通的，因为获取的DNA里面会含有非编码区。

要表达真核生物的基因并表达出相应的蛋白，只能通过提取其mRNA并RT-PCR这条颇费周折的途径。

1．RNA的提取RNA的提取其实原理很简单：

通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。

但是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。

1．1分离高质量RNA成功的cDNA（DNA）合成来自高质量的RNA。

高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。

RNA的质量决定了你能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。

一般的RNA纯化方法是使用异硫氰酸胍／酸性酚的一步法。

一般不必使用oligo（dT多聚体RNA引物）选择性分离poly（A）+RNA（聚

（一）+RNA）。

不管起始模板是总RNA还是poly（A）+RNA，都可以检测到扩增结果。

另外，分离poly（A）+RNA会导致样品间mRNA丰度的波动变化，从而使信息的检出和定量产生偏差。

然而，当分析稀有mRNA时，poly（A）+RNA会增加检测的灵敏度。

1．2RNA提取的最大影响因素-RNA酶在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。

而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。

由于RNA酶广泛存在而稳定，可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等，RNA酶催化的反应一般不需要辅助因子。

因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以RNA的制备与分析操作难度极大。

在实验中，一方面要严格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。

外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。

在其它分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。

这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。

而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。

1．3常用的RNA酶抑制剂*焦碳酸二乙酯（DEPC）：

是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。

它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。

*异硫氰酸胍：

目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。

它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。

*氧钒核糖核苷复合物：

由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。

*RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：

从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。

RNasin（阻抑蛋白）是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。

*其它：

SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。

1．4防止RNA酶污染的措施、RNA提取之前需要注意和准备的工作*尽可能在实验室专门辟出RNA操作区，离心机、移液器、试剂等均应专用。

RNA操作区应保持清洁，并定期进行除菌。

*操作过程中应始终戴一次性橡胶手套和口罩，并经常更换，以防止手、臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNase（RNA酶抑制剂）带入各种容器内或污染用具。

尽量避免使用一次性塑料手套。

塑料手套不仅常常给操作带来不便，而且塑料手套的多出部分常常将器具有RNase处传递到RNase-free处，扩大污染。

*尽量使用一次性的塑料制品，避免共用器具如滤纸、tips（技巧）、tubes（管子）等，以防交叉污染。

例如，从事RNA探针工作的研究者经常使用RNaseH9（多聚酶和核酸内切酶）、T1等，在操作过程中极有可能造成移液器、离心机等的污染。

而这些污染了的器具是RNA操作的大敌。

*关于一次性塑料制品，建议使用厂家供应的出厂前已经灭菌的tips和tubes等。

多数厂家供应的无菌塑料制品很少有RNase污染，买来后可直接用于RNA操作。

用DEPC等处理的塑料制品，往往由于二次污染而带有RNase，从而导致实验失败。

*所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。

*无法用DEPC处理的用具可用氯仿擦拭若干次，这样通常可以消除RNase的活性。

*配制溶液用的乙醇、异丙醇、Tris等应采用未开封的新瓶装试剂。

*塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：

有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。

*有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。

*配制的溶液应尽可能的用0.1%DEPC，在37℃处理12hr以上。

然后用高压灭菌除去残留的DEPC。

不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。

1．5RNA提取的一般步骤RNA提取的一般步骤是：

破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行，可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织，加入β-ME可以抑制RNA酶活性。

分离RNA一半用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，RNA一般分布于上层，与蛋白层分开。

沉淀RNA一般用乙醇、3MNaAc（pH-5.2）或异丙醇。

洗涤RNA使用70％乙醇洗涤，有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。

融解RNA一般使用TE。

保存RNA应该尽量低温。

为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。

从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。

另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。

为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70℃。

用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。

来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。

当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA：

加入NaAc至0.3M，12,000×g离心5分钟。

1．6RNA抽提新方法-TRIZOL法TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。

它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。

加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。

RNA存在于水样层中。

收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。

在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。

乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。

共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。

TRIZOL是有毒物，接触皮肤或者不慎吞服，会导致灼伤，一旦接触皮肤后立即以大量的洗涤剂和清水清洗。

TRIZOL在室温下能稳定保存12个月。

尽管如此，为达到最佳效果，建议保存在2-8°C的环境下。

TRIZOL:

（RT-PCR）半定量检测bcr-ablmRNA表达收集经终浓度为10μmol/L的反义及正义寡核苷酸作用48小时的K562细胞，用RNA提取液（TRIzol）提取总RNA，经琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，紫外分光光度计进行RNA定量，取1μgRNA用引物OligodT15反转录成cDNA。

2．RT-PCRRT-PCR是指将逆转录（ReverseTranscription；RT）反应和PCR（PolymeraseChainReaction）反应组合在一起的方法。

2．1RT-PCR的原理RT-PCR将以RNA为模板的cDNA合成同PCR结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。

RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。

另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。

RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。

RT-PCR的模板可以为总RNA或poly（A）+选择性RNA。

逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo（dT）或基因特异性的引物（GSP）起始。

RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。

在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。

cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。

在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在一只管中顺次进行。

2．2RT-PCR的步骤⑴在冰浴离心管里面加入模板RNA4uL，引物2uL，去离子水5uL，混匀，离心3-5秒；⑵70度水浴5分钟，冰浴30秒（此处是为了使引物和模板正确配对）；⑶加入5×反应液4uL，RNase抑制剂1uL，dNTP2uL（这些应该先配好，然后分再装到每一管），混匀；⑷37度水浴5分钟，加入1uLAMV-RT反转录酶，混匀；⑸37度水浴1小时（此步是反转录过程）；⑹70度10分钟结束反应（此处是灭活酶活性，避免对后续实验产生干扰），产物置冰上进行下一步PCR实验，余下的-70度保存。

2．3RT-PCR的引物设计RT-PCR引物设计和一般PCR引物设计可以遵循同样的原则。

细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步。

理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。

设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。

设计理想的引物都有以下共同的特点，而设计失败的引物则各有各的缺点：

*典型的引物18到24个核苷长。

引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。

但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。

较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。

*选择GC含量为40％到60％或GC含量反映模板GC含量的引物。

*设计5'端和中间区为G或C的引物。

这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。

*避免引物对3'末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。

*避免3'末端富含GC。

设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。

*避免3'末端的错误配对。

3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶