工业微生物实验指导书林化.docx

工业微生物实验指导书林化.docx

《工业微生物实验指导书林化.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《工业微生物实验指导书林化.docx（13页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

工业微生物实验指导书林化

工业微生物实验指导书

（林产化工专业）

材料科学与工程学院

实验一培养基的制备与灭菌

一、实验原理

马铃薯中含有淀粉、蛋白质、脂类及多种维生素经煮沸后可把这些营养成分从中溶出以供酵母和霉菌生长需要，加入葡萄糖或蔗糖以补充微生物所需的碳源。

此培养基为半合成培养基。

二、实验目的：

1、掌握培养基的制备方法，2、学会高压蒸汽灭菌技术。

三、实验材料和仪器：

1、马铃薯、葡萄糖（或蔗糖）、琼脂。

2、烧杯、漏斗、试管、三角瓶、量筒、玻璃棒、纱布、棉花、细绳、牛皮纸、试管架、培养皿。

3、手提式高压蒸汽灭菌锅、天平、电炉。

四、实验方法与步骤：

（一）玻璃器皿的清洗

配制培养基需要一些玻璃器皿，并且在使用前要对器皿进行清洗、包装和灭菌。

新置的玻璃器皿应将其浸在2%的盐酸溶液中数小时；或用热水浸泡，再用去污粉或肥皂粉刷洗，最后经过热水洗涮、自来水冲洗、干燥灭菌备用。

用过的玻璃器皿因含有大量的微生物应需先经高压蒸汽灭菌或沸水煮沸30min后，倒掉污物方可洗刷。

吸过菌液的吸管，应将其放入盛有5%石炭酸溶液的高玻璃筒内消毒；未吸过菌液的，用水浸泡，防止干燥；吸过油的应在10%的NaOH溶液中浸泡30min，去油后清洗，如去不掉可置于洗液中清洗。

吸管上端的棉花用钢针钩出，洗净的吸管顶端向下，下面垫一块干净的厚布或几层纱布，使水分迅速吸干。

（二）器皿的包扎

试管和三角瓶灭菌前，试管口和瓶口均须塞好棉塞，再在其外面包一层牛皮纸，用棉绳包扎，置于烘箱，灭菌备用。

棉塞制作（如下图）

（1）要求：

棉塞紧贴玻璃管壁，没有皱纹和缝隙，松紧适宜。

制作好的棉塞拔出时会听到“叭”的一声响。

棉塞长度不小于管口直径的二倍，约2/3棉塞长度进入管口。

（2）作用：

棉塞起过滤作用，避免空气中的微生物进入培养基内。

图1-1棉塞的制作方法

洗净的培养皿按10~12套一包用报纸，或每10套一起放入特制的铁皮平皿圆筒内，加盖置于烘箱灭菌备用。

吸管在包扎前在其前部塞入少许普通棉花，以免使用时将菌液吸出污染或吹入空气污染。

塞入的棉花和吸管的管口应保持5mm左右的距离。

全长不得超过10mm。

然后把吸管的尖端放在宽5~8cm纸条的一端，呈45°角折叠纸条，包住尖端，一手捏住管身，一手将吸管压紧再桌面上，向前滚动，以螺旋式包扎，最后打结，灭菌备用。

（三）培养基的制备

培养基制备的简单过程：

配料→溶解→校正pH值→加凝固剂→融化→过滤→分装→加棉塞、包扎→灭菌→无菌检查

1、溶解配料先在烧杯中放入所需水量的一半，称取培养基配方中的各种原料，依次加入水中溶解，最后补足水分。

加入顺序缓冲化合物、主要元素、微量元素最后加维生素等。

2、调pH值在室温下，用精密pH试纸或酸度计测溶液的pH值，用酸（6mol/lHCl）或碱（10%NaOH）调整。

加入碱或酸时要搅拌，防止营养成分破坏。

3、加凝固剂将凝固剂加入煮沸的液体中不断搅拌至融化，最后补足水分。

4、过滤在两层纱布中夹入脱脂棉，趁热过滤。

5、分装装入试管中的固体培养基不宜超过试管高度的1/5，装入三角瓶的小于总体积的一半。

分装时应避免污染管口培养基的分装见下图

图1-2培养基分装示意图

6、包扎将分装好的试管和三角瓶塞好棉塞，若需好氧培养可以用6~8层纱布代替棉塞，其上用牛皮纸包好。

7、灭菌将分装灭菌后的琼脂培养基试管置于水平放置的试管上，凝固后即成斜面，斜面长度不得超过试管长度的一半。

8、无菌检查灭菌后的培养基在培养箱中培养24~48小时作无菌检查。

（四）本次实验步骤：

1、真菌培养基的制备

（1）选无芽、无腐烂的马铃薯、洗净、削皮、称40g切碎加水200ml,放入1000ml烧杯中煮沸0.5hr、冷却用纱布过滤去渣。

（2）在清液中加入4g葡萄糖溶解补水至200ml，此时到入一试管10ml。

余下溶液加3.8g琼脂加热熔化。

（3）试管分装：

取玻璃漏斗装在漏斗架上，漏斗下连一橡胶管，与玻璃管嘴相接，橡皮管上夹一弹簧夹，培养基倒入漏斗，通过弹簧夹控制培养基的流量。

每人两支试管。

（4）余下的培养基分装在250ml的三角瓶中。

（5）高压蒸汽灭菌：

把溶解完的培养基用棉塞塞上并用牛皮纸把棉花包住，在121℃，0.1Mpa下灭菌20min即可，灭菌时要注意放净阀气。

取出灭菌物品时一定要等到压力降到零时打开灭菌锅盖。

（6）斜面摆放：

将分装灭菌后的琼脂培养基试管置于水平放置的试管上，凝固后即成斜面。

（7）培养皿的洗涤与灭菌：

培养皿每人两套清洗干净，控干水后用报纸包扎好置于160℃的烘箱内灭菌1.5-2小时，备用。

（8）培养皿培养基的倾倒：

先用酒精棉球擦拭桌面及双手,在靠近酒精灯火焰的上方把冷却到45℃左右的培养基倒入培养皿内，每只倒入15ml左右。

。

注意：

温度太低培养基会凝固。

2、细菌培养基的制备

取营养琼脂1.65g于250ml的烧杯中，加水50ml，加热煮沸溶解，分装在三个试管中，包扎好于121℃高压灭菌15min，取出摆斜面冷却后备用。

3、无菌水的制备：

用10ml的吸管准确吸取0.9%的生理盐水9ml于一洁净的试管中，包扎好于121℃高压灭菌15min，冷却备用。

每组5-6只试管。

4、吸管的包扎与灭菌：

取洁净的1-2ml的吸管冲洗干净，干燥后在吸管的粗端，放置少许棉花，用报纸包扎好后置于160℃的烘箱内灭菌1.5-2小时，备用。

每组在本组制备的无菌水试管的数量的基础上加一。

五、思考题：

1．培养基配制好后为什么要灭菌？

2．蒸汽灭菌应注意几个问题？

为什么？

实验二微生物接种和培养

一、实验原理

好气性微生物，例如大多数细菌、霉菌、放线菌、藻类、酵母菌和原生动物等，都需要从空气中获得氧气进行有氧呼吸，以氧气作为呼吸基质氧化最终受氢体。

空气中不断地供应氧，微生物可彻底地氧化底物，释放出全部能量，以葡萄糖为基质的有氧呼吸可以分作两步进行，一部分是葡萄糖分子分解和脱氢，生成CO2和还原性氢；另一部分是分子氧被激活，使氧与还原性的氢化合成水。

其反应式如下：

4[H]+20[H]=24[H]

二、实验目的

1、了解无菌操作在微生物接种过程中的重要性，掌握无菌操作的基本环节。

2、掌握几种常用微生物的接种方法，为微生物的形态观察作准备。

三、实验材料

1、培养物:

（1）细菌大肠杆菌（Escherichiacoli）

（2）酵母酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）（3）霉菌黑曲霉（Aspergillusniger）

2、培养基

（1）营养琼脂固体斜面培养基。

（2）真菌培养基：

PDA培养基，液体培养基。

3、接种工具（图2-1）接种针，接种钩，接种环，涂布器，吸管。

4、酒精灯，标签纸，火柴，镊子，75%酒精棉球，电炉，无菌平皿。

四、实验步骤

1.接种步骤：

（1）.用酒精棉球擦拭手部皮肤及桌面。

（2）.点燃酒精灯。

（3）.将菌种和斜面培养基两只试管握在手中平面向上。

（4）.先将菌种和斜面的棉塞用右手拧松。

（5）.右手拿接种环，在火焰上将接种环及要进入试管内的部分灼烧灭菌。

图2-1接种工具

（6）.用右手小指、无名指或手掌拔掉棉塞并握紧，不得将棉塞放在桌子上。

（7）.用火焰灼烧管口，灼烧时应不断转动管口，杀灭沾染在管口上的其他微生物。

（8）.将烧过的接种环伸入菌种管内，先将接种环接触管壁冷却，然后轻轻接触菌体，取出少许，慢慢将接种环抽出试管，此时不要使环碰到管壁，并且接种环不在通过火焰。

（9）.迅速将沾有菌种的接种环在火旁伸入斜面培养试管，在培养基斜面上轻轻划直线、点接和画曲线，不要划破培养基，也不要使菌种污染管壁。

（10）.灼烧试管口，并在火焰旁将棉塞塞上，塞棉塞时不要用试管迎棉塞以免染菌。

（11）.接种环在火焰上烧红灭菌，放下接种环后，用右手将棉塞塞紧。

（12）.接种后的试管用标签标明菌种名称、接种日期、时间、接种者的姓名或组号。

（13）.将斜面放入培养箱内培养，控制温度在28℃。

2.划线分离：

（1）.取试管内菌种一环在培养皿内划线。

如图2-1

图2-2平板划线分离

（2）.每画完一次在酒精灯上灼烧接种环一次。

（3）.在第一次划线后转动培养皿约70°角，用烧过的接种环通过第一次划线部分作第二次划线，第三次相同，划线要密不能相互接触，不能划破培养基。

3．涂布分离：

（1）.取一环菌液，接种到10ml液体培养基内，培养24hr。

（2）.取1ml培养好的菌液进行稀释10倍、100倍、1000倍。

（3）.取后两种浓度溶液各0.1ml分别涂布于平面皿上。

注意：

涂布前一定要灼烧玻璃棒，涂布时一定要冷却玻璃棒。

4、斜面接种用接种环在肉汤斜面培养基上划密波蜿蜒曲线接种大肠杆菌，在PDA培养基斜面上用划直线和点接的方法分别接种酵母菌和黒曲霉。

5、液体接种：

用接种环在肉汤培养基液体中接种细菌，在PDA液体培养基中接种酵母菌。

液体接种时取一环菌苔，沿管壁轻轻擦下菌苔，塞上棉塞轻摇试管。

3、穿刺接种：

在肉汤培养基上接种细菌，在PDA培养基上接种酵母菌。

4、平板接种：

分别在不同的培养基平板上点接不同的菌种。

五、结果记录

1、斜面接种：

（1）检查斜面接种情况、绘制斜面生长草图。

（2）分析斜面接种好坏的原因

（3）保留斜面、以便观察形态时使用。

2、液体接种：

观察记录细菌、酵母的液体培养特征，保留酵母液体培养液备用。

3、平板接种

（1）检查平板接种的生长状况，有无污染（凡没接种地方长出菌落均为染菌）。

（2）描述各个菌落的特征。

六、思考题：

无菌操作技术体现在操作过程中哪些方面。

实验三微生物细胞大小及体积测定

一、实验原理

应月显微镜的成像原理，同时借助显微镜的镜台测微尺和目镜测微尺，两尺配合使用，进行测量和运算，得出细胞的大小。

镜台测微尺系一特制的载玻片（图3－1），它的中央是一具有刻度的标尺，全长为1mm，共划分为10大格，每一大格又分成10小格，每一小格长0.01mm，即10um。

也有全长为2mm，共分200小格，每小格的长度不变。

在标尺的外围有一小黒环，以便找到标尺的位置。

图3－1镜台测微尺

目镜测微尺是放在目镜内的一种标尺，它有固定式和移动式两种类趔。

固定式目镜测微尺为一块圆形玻璃片，直径为20～21mm，如图3－2所示。

在它的上面刻有各种形式的标尺，有为直线式的（图3一2A），有为网式的（图3—2B）通常用以测量长度的标尺为直线式的，一般为5mm，分成5大格，每一大格分成10小格，共计50小格。

也有用同样长度分为100小格的。

网式目镜测微尺主要用以计算数目和测量物体的面积。

在它上面刻有方格

的网状标尺。

方格的大小和数目各有不同，有25、36和49格，也有的一个正方形大格中划分100个方格，在中央的一个方格中再划分25个小方格。

图3－2目镜测微尺

A.直线式B.网式C.移动式（外形）D.移动式（内部）

移动式目镜测微尺基本上和直线式目镜测微尺相似，所不同的是除了泣种固定的标尺外，还有可以移动位置的指示线。

它装在一个特别的目镜中．右边由一个能旋转的小轮控制着，轮上有刻度，分成100格，该轮每旋转一圈，目镜内能移动的指示线就从标尺一端向另一端移动－格。

显微测量时，先用镜台测微尺标定目镜测微尺每小格代表的长度，然后才能用目镜微尺来测量细胞的长度。

二、实验目的：

1、学会测微尺的使用和计算方法。

2、掌握酵母菌细胞体积的测定方法

三、实验材料和仪器：

1．菌种酿酒酵母上次实验的液体培养物。

2．盖玻片、载玻片、显微镜、镜台测微尺、目镜测微尺。

3．擦镜纸、滤纸条、镊子、无菌吸管、酒精棉球。

四、实验方法与步骤

1、卸下目镜的上透镜．将目镜测微尺有刻度一面向下装在目镜镜面上，再旋上目镜透镜。

2、将镜台测微尺有刻度的一面朝上放在载物台上夹好，使测微尺刻度位于视野中央。

调焦至能看清镜台测微尺的刻度。

3、小心移动镜台测微尺和目镜测微尺（如目镜测微尺刻度模糊，可转动目镜上透镜进行调焦），使两尺左边的“0”点直线重合，然后由左向右找出两尺另一次重复的直线（图3-3）。

4、记录两条重合线间目镜测微尺和镜台测微尺的格数。

按下式计算目镜测微尺每格的长度等于多少um

图3—3目镜测微尺的标定

上，目镜测微尺；下，镜台测微尺

例如，图1－5中，在低倍镜下所标定的目镜测微尺的全长（50格），等于镜台测微尺70

格，则目镜测微尺每小格代表的长度则为：

取下镜台测微尺，换上要测量的玻片标本，用目镜测微尺测量细胞长度的格数，乘以每格的um数，即为细胞的实际长度。

如用不同倍数的物镜与目镜时，就需重新计算，方法同前。

在测量时应注意将被测量的标本移到视野中心，因为在这个位置上镜像最清晰．像差也最小，为减少误差．在测量同一物体时，要重复3次以上，再取其平均值．还需注意视野中的亮度应均匀一致，以免影响测量值的准确性。

根据长度测量结果可计算细胞的体积。

公式如下：

椭圆形V＝4лab2/3（a,b为长短轴的半径）圆球形V＝4лr3/3（r为半径）

5、酵母菌大小的测定

（1）取下镜台测微尺，换上酵母菌水浸片。

（2）测量菌体的长轴和轴各占目镜测微尺的格数，然后换算出菌体的实际长度。

（3）在同一标本上测量5~10个酵母细胞，取其平均植。

6、酵母菌体积的测定

用显微测微尺测量并换算出酵母菌的长轴和短轴的实际长度后，代入公式求出酵母菌的体积V。

五、实验结果

1、在低倍镜下：

目镜测微尺（）格＝镜台测微尺（　　　　　　）格，目镜测微尺每小格＝（）um;

2、在高倍镜下：

目镜测微尺（）格＝镜台测微尺（　　　　　　）格，目镜测微尺每小格＝（）um。

3、酵母细胞长=目镜侧微尺（）格=（）微米。

酵母细胞宽=目镜侧微尺（）格=（）微米。

酵母菌细胞体积=（）um3。

六、思考题

1、为什么采用不同放大倍数目镜和物镜时，必须重新用镜台测微尺对目镜测微尺进行标定？

2、若目镜不变，目镜测微尺也不变，只改变物镜，那么，目镜测微尺每格所测量的酵母的实际长度（或宽度）是否相同？

为什么？

实验四酵母菌细胞计数及出芽率测定

一、实验目的：

1、了解血球计数板的构造和使用方法。

2、学习并掌握利用血球计数板对酵母菌细胞数进行测量和酵母出芽率的测定。

二、实验材料和仪器：

1、菌种酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）上次实验的液体培养物

2、盖玻片、载玻片、显微镜、血球计数板、酒精灯、滤纸条、无菌吸管、酒精棉球、擦镜纸等。

三、实验方法与步骤：

1.血球计数板的构造:

测定微生物生长量的方法很多，对酵母来说有两大类：

总菌计数和活菌计数，分别称为直接和间接法。

总菌计数是利用血球计数板在显微镜下直接计数，立即得到数值，是死细胞和活细胞的总和；活菌计数是计算活菌在平皿上形成的菌落数，费时较长。

本实验利用血球计数板对酵母直接计数，计数的同时统计出出芽率。

血球计数板由四条平行槽而构成三个平台，中间平台较宽，并分为两部分，每部分均刻有长和宽各1mm的方格网，中间平台下陷0.1mm，故盖上盖玻片后计数室的体积为0.1mm3。

常用血球计数板有两种规格。

一种16x25型，称为麦氏血球计数板，共有16个大格，每个大格又分为25个小格；另一种是25x16型，称为希里格式血球计数板，共25个大格，每一大格又分为16个小格。

无论是哪一种血球计数板，都有一共同特点，即计数室的小格数相同，均为400个。

其结构见图4-1。

图4-1血球计数板的结构和类型

2.酵母菌细胞计数：

（1）检查血球计数板是否有杂质和菌体，若有用脱脂棉蘸取95%酒精轻轻擦洗计数板的计数室，用蒸馏水冲洗计数板，用滤纸吸干其上水分，勿用火烤，最后用擦镜纸揩干净。

（2）样品稀释：

稀释的目的在于便于计数，稀释要求每小格内4—5个细胞，一般稀释10倍。

（3）加样：

先将盖玻片置于计数室上，用吸管吸取一滴稀释好的菌液滴于盖玻片边缘，让菌液自行渗入，多余的菌液用滤纸吸去，稍待片刻，待酵母细胞全部沉降到计数室底部在进行计数。

（4）计数将加好样品的计数板放到显微镜载物台中央，按下列步骤寻找计数室并计数。

①找计数室先用低倍物镜寻找到大方格网位置。

寻找时，显微镜的光圈要适当缩小，使视野偏暗，然后顺着大方格移动计数板，使计数室位于视野中间。

②转换高倍镜转至高倍物镜后，适当调节光亮度，使菌体和计数室线条清晰，然后将计数室一角的小格移至视野中。

③计数16x25型取左上、右上、左下、右下四大格共100小格内的细胞逐一进行计数；25x16型取左上、右上、左下、右下和中间五大格共80小格进行计数，计数时遇到位于大格线上的酵母菌时，只计大格上方及右方线上的细胞（或只计下方及左方线上的细胞），将细胞数填入格中对每个样品重复三次，取平均值，计算酵母菌细胞数。

（5）计算公式：

25x16:

细胞数/ml=（80小格细胞总数÷80）x400x10x1000x稀释倍数

16x25:

细胞数/ml=（100小格细胞总数÷100）x400x10x1000x稀释倍数

（6）清洗计数板使用完毕后，用蒸馏水冲洗，绝不能用硬物洗刷，，洗后待其自行晾干或用滤纸吸干，最后用擦镜纸揩干净。

若为病原菌，则浸泡在5%石炭酸溶液中消毒后再清洗。

3.酵母出芽率的测定：

（1同上步骤数出酵母的出芽数并填在上面表格中（一般需平行计数三次）。

（2）观察酵母菌出芽率时，遇到芽体大于细胞本身50%时不作为芽体计数，而作为酵母数计数。

（3）计算公式：

酵母出芽率=（芽体数÷酵母菌细胞总数）x100%

四、实验结果

细胞总数测定表格：

计数次数

各大格中的细胞数

大格中

细胞总数

稀释倍数

细胞浓度

（个/ml）

芽体数

左上右上右下左下中间

第一次

第二次

第三次

平均值

三次测定结果：

每毫升菌液中酵母细胞数平均值________。

酵母细胞出芽率的测定

计算次数

总酵母细胞数

芽体数

出芽率（%）

第一次

第二次

第三次

三次测定结果平均值：

出芽率_______%

五、思考题：

1、试述计数板的计数原理。

为什么用两种不同规格的计数板来计数同一样品，结果是一样的？

2、试分析酵母计数时应注意的问题和影响计数准确的原因。

应如何尽量减少误差，力求准确？