转座子.docx
《转座子.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《转座子.docx（12页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
转座子
转座子
科技名词定义
中文名称：
转座子
英文名称：
transposon;Tn
定义1：
转座元件中的一种，具有完整转座元件的功能特征并能携带内外源基因组片段（单基因或多基因）。
在基因组内移动或在生命体之间传播并可表达出新的表型。
所属学科：
生物化学与分子生物学（一级学科）；基因表达与调控（二级学科）
定义2：
转座因子中的一种。
除含与转座有关的基因外，还含抗药基因、抗重金属基因和接合转移基因等，可赋予受体细胞一定的表型特征。
所属学科：
遗传学（一级学科）；分子遗传学（二级学科）
本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布
百科名片
Ac-Ds转座元件
转座因子或转座子是一类在很多后生动物中（包括线虫、昆虫和人）发现的可移动的遗传因子。
一段DNA顺序可以从原位上单独复制或断裂下来，环化后插入另一位点，并对其后的基因起调控作用，此过程称转座。
这段序列称跳跃基因或转座子，可分插入序列（Is因子），转座（Tn），转座phage。
目录
简介
转座因子的转座途径
1.复制转座
2.非复制转座
转座子的分类
转座子标签的转座元件体系
1.自主转座元件单因子体系
2.反转录转座元件体系
3.双元转座子体系
标签的策略
1.定向标签（directedtagging）
2.随机标签（randomtagging）
标签基因的分离和克隆
1.Southern-based分离法
2.PCR-based分离法
展望
1.简述
2.转座子标签技术克隆基因的基本原理
编辑本段简介
Transposon
asegmentofDNAthatcanbecomeintegratedatmanydifferentsitesalongachromosome（especiallyasegmentofbacterialDNAthatcanbetranslocate
转座子引起的插入突变
dasawhole）
转座子是一类在细菌的染色体,质粒或噬菌体之间自行移动的遗传成分,是基因组中一段特异的具有转位特性的独立的DNA序列.
转座子是存在于染色体DNA上可自主复制和位移的基本单位。
最简单的转座子不含有任何宿主基因而常被称为插入序列（IS），它们是细菌染色体或质粒DNA的正常组成部分
转座（因）子是基因组中一段可移动的DNA序列，可以通过切割、重新整合等一系列过程从基因组的一个位置“跳跃”到另一个位置。
复合型的转座因子称为转座子（trans—poson，Tn）。
这种转座因子带有同转座无关的一些基因，它的两端就是IS，构成了“左臂”和“右臂”。
两个“臂”可以是正向重复，也可以是反向重复。
这些两端的重复序列可以作为Tn的一部分随同Tn转座，也可以单独作为IS而转座。
玉米“花斑”由一种转座因子的存在所导致
转座子是细菌细胞里发现的一种复合型转座因子，这种转座因子带有同转座无关的一些基因，如抗药性基因；它的两端就是IS，构成了“左臂”和“右臂”。
两个“臂”可以是正向重复，也可以是反向重复。
这种复合型的转座因子称为转座子（trans—poson，Tn）。
这些两端的重复序列可以作为Tn的一部分随同Tn转座，也可以单独作为IS而转座。
Tn两端的IS有的是完全相同的，有的则有差别。
当两端的IS完全相同时，每一个IS都可使转座子转座；当两端是不同的IS时，则转座子的转座取决于其中的一个IS。
Tn有抗生素的抗性基因，Tn很容易从细菌染色体转座到噬菌体基因组或是接合型的质粒。
因此，Tn可以很快地传播到其他细菌细胞，这是自然界中细菌产生抗药性的重要来源。
两个相邻的IS可以使处于它们中间的DNA移动，同时也可制造出新的转座子。
Tn10的两端是两个取向相反的IS1O，中间有抗四环素的抗性基因（TetR），当TnlO整合在一个环状DNA分子中间时，就可以产生新的转座子。
当转座子转座插人宿主DNA时，在插入处产生正向重复序列，其过程是这样的：
先是在靶DNA插入处产生交错的切口，使靶DNA产生两个突出的单链末端，然后转座子同单链连接，留下的缺口补平，最后就在转座子插入处生成了宿主DNA的正向重复。
编辑本段转座因子的转座途径
已知的转座因子的转座途径有两种：
复制转座和非复制转座。
复制转座
复制转座（replicativetransposition）转座因子在转座期间先复制一份拷贝，而后拷贝转座到新的位置，在原先的位置上仍然保留原来的转座因子。
复制转座有转座酶（transposase）和解离酶（resolvase）的参与。
转座酶作用于原来的转座因子的末端，解离酶则作用于复制的拷贝。
TnA是复制转座的例子。
非复制转座
非复制转座（non-replicativetransposition）转座因子直接从原来位置上转座插入新的位置，并留在插入位置上，这种转座只需转座酶的作用。
非复制转座的结果是在原来的位置上丢失了转座因子，而在插入位置上增加了转座因子。
这可造成表型的变化。
保留转座（conservativetransposition）也是非复制转座的一种类型。
其特点是转座因子的切离和插人类似于入噬菌体的整合作用，所用的转座酶也是属于入整合酶（integrase）家族。
出现这种转座的转座因子都比较大，而且转座的往往不只是转座因子自身，而是连同宿主的一部分D
piggyBac转座子的老鼠，表达红色荧光蛋白
NA一起转座。
非复制转座可以是直接从供体分子的转座子两端产生双链断裂，使整个转座子释放出来，然后在受体分子上产生的交错接口处插入，这是“切割与黏接”（“cutandpaste"）的方式。
另一种方式是在转座子分子同受体分子之间形成一种交换结构（crossoverstructure），受体分子上产生交错的单链缺口，与酶切后产生的转座子单链游离末端连接，并在插入位点上产生正向重复序列；最后，由此生成的交换结构经产生缺口（nick）而使转座子转座在受体分子。
供体DNA分子上留下双链断裂，结果或是供体分子被降解，或是被DNA修复系统识别而得到修复。
在复制转座过程中，转座和切离是两个独立事件。
先是由转座酶分别切割转座子的供体和受体DNA分子。
转座子的末端与受体DNA分子连接，并将转座子复制一份拷贝，由此生成的中间体即共整合体（cointegrat，）有转座子的两份拷贝。
然后在转座子的两份拷贝间发生类似同源重组的反应，在解离酶的作用下，供体分子同受体分子分开，并且各带一份转座子拷贝。
同时受体分子的靶位点序列也重复了一份拷贝。
酵母接合型的相互转换也是复制转座所产生。
酿酒酵母（Saccharomvcescerf—visiae）的生命周期中有双倍体细胞和单倍体细胞两种类型。
单倍体细胞则有a型和α型两种接合型（matingtype）。
单倍体酵母是a型还是α型，由单个基因座MAT所决定。
MAT有一对等位基因MAT。
和MATα，在同宗接合（homothallic）的酵母菌株中，酵母菌十分频繁地转换其接合型，即从a转换成α，然后在下一代又转换为a。
这种转换和回复的频率已远远高于通常的自发突变，表明这不是通常的突变机制。
现在已经知道，在MAT基因座两侧有两个基因带有MATα和ATα的拷贝，这就是HMLα和HMRα基因。
这两个基因贮存了两种接合型等位基因，当转座给MAT基因座时就发生了接合型的转换。
因此，MAT基因座是通过转座而转换其接合型的。
MAT基因座的序列转换成另一个基因的序列，这种机制称为基因转换（geneconvertion）。
1951年BarbaraMclintock首先在玉米中发现了控制元件，后来命名为转座元件或转座子（transposon）。
转座子是基因组中一段可移动的DNA序列，可以通过切割、重新整合等一系列过程从基因组的一个位置“跳跃”到另一个位置。
这一元件不仅可用于分析生物遗传进化上分子作用引起的一些现象，还为基因工程和分子生物学研究提供了强有力的工具，可以在不了解基因产物的生化性质和表达模式的情况下，分离克隆植物基因，即转座子标签（transposontagging），又称为转座子示踪法。
其原理是利用转座子的插入造成基因突变，以转座子序列为基础，从突变株的基因文库中筛选出带有此转座子的克隆，它必定含有与转座子序列相邻的突变基因的部分序列，再利用这部分序列从野生型基因文库中获得完整的基因〔1〕。
1984年，用转座子标签法首先在玉米中分离了bronze基因，该基因编码了玉米花色素合成途径的关键酶——UDP-葡萄糖类黄3-O-葡萄糖基转移酶〔2〕。
此后还利用转座子标签技术分离了许多植物基因。
编辑本段转座子的分类
转座子可以分为两大类：
以DNA-DNA方式转座的转座子和反转录转座子（retrotransposon）。
第一类转座子可以通过DNA复制或直接切除两种方式获得可移片段，重新插入基因
双转座子插入引起的外显子改组
组DNA中。
根据转座的自主性，这类元件又可以分为自主转座元件和非自主转座元件，前者本身能够编码转座酶而进行转座，后者则需在自主元件存在时方可转座，以玉米的Ac/Ds体系为例，Ac（Activator）属于自主元件，Ds（Dissociation）则是非自主元件，必需在Ac元件存在下才能转座〔1〕。
第二类转座子又称为返座元（retroposon）〔3〕，是近年新发现的由RNA介导转座的转座元件，在结构和复制上与反转录病毒（retrovirus）类似，只是没有病毒感染必须的env基因，它通过转录合成mRNA,再逆转录合成新的元件整合到基因组中完成转座，每转座1次拷贝数就会增加1份，因此它是目前所知高等植物中数量最大的一类可活动遗传成分。
目前共发现了3种类型反转录转座子：
Tyl-copia类，Ty3-gypsy类和LINE（longinterspersednuclearClements）类转座子，前两类是具有长末端重复的转座子，LINE类转座子没有长末端重复。
高等植物中的反转录转座子主要属于Tyl-copia类，分布十分广泛，几乎覆盖了所有高等植物种类〔4〕。
克隆转座子主要有两条途径：
其一，利用抗体识别或cDNA探针从野生型植株中获得表达量降低或不稳定基因座的序列，再从突变体中分离得到相应的转座子：
其二是根据序列同源性，在基因组的不同位置分离同一家族的转座子成员。
目前已经克隆的植物转座子约156种（来自Genbank的报告），表1列出了常用于转座子标签的一些植物转座子。
表1常用植物转座子标签的转座子
名称来源类型
Ac（Activator）玉米Ⅰ类自主型转座子
Ds（Dissociation）玉米Ⅰ类非自主型转座子
Mu（Mutator）玉米Ⅰ类自主型转座子
Spm/En玉米Ⅰ类自主型转座子
Tam金鱼草Ⅰ类自主型转座子
dTphl拟南芥Ⅰ类自主型转座子
Tos17水稻反转录转座子
编辑本段转座子标签的转座元件体系
1984年首次用转座子标签法克隆了玉米bronze基因之后，在其它高等植物中一直没有发现象Ac/Ds、Spm/En类转座活性很高的转座子，因此在很长一段时间内都是利用玉米和金鱼草中转座性质较清楚的内源自主性转座子。
B.Baker等人首先证明了玉米的Ac/Ds转座元件在转基因烟草中有作用，此后又发现Ac/Ds在其他许多物种中如拟南芥、蕃茄、矮牵牛、亚麻、马铃薯、黄豆和水稻中都有活性〔5〕。
1993年用Ac元件从矮牵牛中成功地克隆了一个花色素苷合成基因，开创了用外源转座子
倒位和缺失
在异源宿主中分离克隆基因的先河〔6〕。
目前植物基因工程常用的转座元件体系分为天然和人工改造两大类，前者包括自主元件单因子体系和反转录转座元件体系，后者主要是人工改造的双元因子体系。
自主转座元件单因子体系
自主转座元件单因子体系利用了转座活性较高的自主转座子如玉米的Mu转座子、Ac转座子和矮牵牛的dTpH1转座子，已经克隆了拟南芥白化病基因（albino）、雄性育性基因、蕃茄的抗病基因Cf-9等基因〔7〕。
这一转座体系具有两大优点：
一是在植物中插入拷贝数高，如Mu元件每个基因组平均拷贝数可达100以上，因此可以在大田自然培养条件下获得大量突变个体；二是只需筛选相对较少量的植株就能标记所有基因。
然而，这一体系也存在一些问题：
自主转座元件高频率的转座有可能切除转座酶而留下一些序列导致永久突变；自主转座在体细胞内可能造成基因功能自动恢复；自主元件切除留下一些片段使转座元件不能与突变表型共分离，这些都增加了筛选克隆的困难，阻碍了转座子标签的推广〔8〕。
反转录转座元件体系
虽然反转录转座子作为一个整体，在整个植物基因组中拷贝数很多甚至是最多的一类成分，但它包括了许多亚群，有的亚群仅由一个或几个拷贝组成，这些以单拷贝或低拷贝方式存在的成分比较容易识别，同时实验证明反转录转座子的转座活动在组织培养中能被激活，因此它们是一类很有潜力的转座子标签体系。
1996年Hirchick等人就利用水稻反转录转座子Tos17建立了水稻基因敲除体系（geneknock-outsystem），Tos17可以在组织培养过程中被激活，插入水稻基因组中，使基因失效〔3〕。
1999年Sato等利用这一体系分离了6个水稻kn1—型同源异型框基因，发现了引起水稻植株矮化的突变基因OSH15〔9〕。
最近Lucas等将烟草中的有活性的Ty1-copia类反转录转座子导入拟南芥〔8〕，发现它在后者中进行了转座，新的拷贝插入到其它基因的可读框中。
之后又相继将它导入蕃茄和水稻中，在新的宿主中进行了表达，而且宿主的内源反转录转座子不影响新导入转座子的转座，说明反转录转座子并不受植物种类差异的影响。
双子叶植物中的反转录转座子不仅可在异源双子叶植物中转座，也可以在单子叶植物中表达，这为反转录转座子用于转座子标签提供了更广阔的前景。
双元转座子体系
双元转座子体系由一个非自主转座元件和一个改造过后自身不能转座的自主转座元件组成，后者仍编码转座酶引起前者的转座，分别构建含两个元件的植物表达载体，转化植物培育了分别含有非自主性转座子和转座酶的株系，再通过转基因植株杂交，在F2代就能获得大量由转座子引起的突变体。
Shimamoto等培育了含Ds转座元件和含Ac转座元件转座酶（AcTPase）基因的两种水稻株系（图1），通过杂交筛选得到了大量矮化、花期改变的突变体〔10〕。
图1含有Ds元件和Ac转座酶的
双元转座体系的构建
A:
缺失Ac元件的部分片段获得非自主性转座子Ds元件，加上35S启动子和潮霉素抗性基因。
B:
构建编码转座酶的转座因子，Ac元件的转座酶片段与35S启动子相连。
为了减少筛选子代突变体的工作量，可以在构建的转座元件上插入用于筛选转化和切除的标记基因如抗生素抗性基因、除草剂抗性基因等。
Knapp等构建了带潮霉素磷酸转移酶基因的Ds元件DsHPT，并将该元件插入除草剂抗性基因（ABR）中（图2），潮霉素抗性基因用于筛选含Ds元件的转基因植株，BAR基因用于筛选Ds从T-DNA位点切除的转基因植株〔7〕。
图2Ds元件的改造
注：
BLT-DNA左边界区；BRT-DNA左边界区；
Pnos胭脂碱合成酶启动子；HPT潮霉素磷酸转移酶基因；
BAR抗除草剂基因；P35S烟草花叶病毒35S启动子；
NPTII新霉素磷酸转移酶II。
编辑本段标签的策略
根据利用转座子标签的目的不同，可以采取两种方式的标签策略：
定向标签和随机标签。
定向标签（directedtagging）
定向标签是用一个稳定遗传的稳性纯合体与一个带有活跃转座元件的显性纯合体杂交，杂交后代可能产生3种表型：
跟显性亲本表型一致，新的表型与隐性亲本表型一致，后两种子代是由于转座子插入了显性等位基因座。
这一策略可以在F1代直接“标签”感兴趣的目的基因〔11〕。
随机标签（randomtagging）
随机标签是将带有功能性转位因子的显性纯合系植株与不带转位因子的同种植株杂交，产生的F1子代再自交，在F2代中就可筛选到转座子随机插入引起突变表型的突变株，这一策略的目的是为了发现、鉴定带有多种不同特征的新突变〔11〕。
编辑本段标签基因的分离和克隆
Southern-based分离法
这是转座子标签分离克隆“标签”基因的常用方法，它是通过杂交得到纯合突变株，构建该类突变株的核基因文库，以转座子片作作为探针从该基因文库中筛选中同源的转座子，因为转座子已插入目的基因中，于是就筛选得到含突变基因的片段，再将这一片段亚克隆标记作为探针，去筛选另一个正常植株的核基因文库，获得完整的正常目的基因。
为了增加转座子插入特定基因的机率，需要采用高效转座子体系，如玉米的Mu元件，但它的标签群在一个
制造出新的转座子
基因组内可达100个拷贝，这又给Southern-based分离法分析突变现象，鉴定特定插入序列的工作带来了相当大的工作量，只能通过多代与含低拷贝数元件的株系杂交来减少每一植株中插入序列的数量〔12〕。
PCR-based分离法
反向PCR分离法：
Souer等1995年设计了将反向PCR（Inversepolymerasechainreaction,IPCR）和差别筛选结合的方法，从矮牵牛W138中分离了高效转座子标签dTph1标记的基因（图3）〔13〕。
W138中含有200个拷贝以上的内源dTph1元件，自交后代形成大量不稳定的突变本，包括花色素合成、植物和花发育、育性或叶绿素合成等方面的突变体，用常规方法分离新基因需花大量的时间将突变株与含低拷贝数转座元件的株系多次杂交。
Souer等利用反向PCR扩增突变体和野生型的dTph侧翼序列，其中突变体的扩增产物克隆到M13mp18载体上，感染细菌，再以突变体和野生型的扩增片段为探针与噬菌斑复制滤膜杂交，筛选差示克隆，分离dTph1插入的侧翼片段作为探针，再从野生型基因文库中筛选基因。
反向PCR和差别筛选结合的方法不仅仅可以用于分离高拷贝转座子元件标签的基因，而且可以用于克隆基它植物轻微变异株中被标签基因，加速低拷贝转座元件标签基因的分离。
此外，采用嵌套的反向PCR引物可以提高有效扩增dTph1侧翼序列的产量〔13〕。
图3特异性克隆突变植株转座元件侧翼序列
TAIL-PCR分离法：
刘耀光等设计热不对称交错PCR方法，（Thermalasymmetricinterla
cedPCRTAIL-PCR）最初用于YAC和Pl载体克隆基因的分离，后又用于转座子标签基因的分离，取得了成功〔14〕。
其基本原理是利用多个嵌套的转座子插入序列特异性引物和一个短的随机简并引物（ArbitrarydegenerateprimerAD）组合，以突变体基因组DNA为模板，进行多次PCR反应，特异性引物的Tm值一般在57-62℃间，而AD引物的Tm值则在44-46℃范围，采取高温特异性扩增与低温随机扩增相间进行的方法，最后获得转座子插入侧翼区特异性扩增片段，可作为探针，筛选分离基因（图4）。
图4TAIL-PCR特异性扩增插入位点
TAIL-PCR分离法可以降低非侧翼区特异产物的背景，同时它可以产生2个以上嵌套的目的片段，与其它方法相比TAIL-PCR方法具有简便、特异、高效、快速和灵敏等特点，已经在拟南芥和水稻中获得了成功。
AIMS分离法：
Gierl等建立的插入突变位点扩增法（AmplificationofinsertionMutagenisedsitesAIMS）是以PCR为基础的分离转座子标签基因的方法，用它已经成功地从玉米Mu元件标签系统中分离了Bx1基因〔12〕。
其原理如图5所示，用2种限制性内切酶消化突变植株的基因组DNA，酶切片段一侧加上接头序列，再采用一组嵌套的插入序列特异引物和一个接头序列互补的引物进行PCR反应扩增插入序列的侧翼序列，为了减少扩增产物的复杂性，在与接头互补引物3’末端加上一个碱基（A/T/C/G），分离的侧翼序列可作为探针筛选目的基因。
利用AIMS进行转座子插入侧翼序列的分离可以减少分析片段的复杂性，同时扩增产物可以不经任何纯化步骤，直接用作探针从cDNA文库或基因组文库中筛选目的基因。
但是AIMS也存在一些问题，如难获得500bp以上的片段，可能是由于人工的未切动的DNA片段存在或是TaqDNA聚合酶不能完全扩增，解决这一问题就需要寻找一些更合适的限制性内切酶。
编辑本段展望
简述
目前转座子元件是植物分子生物学操作和植物基因工程中分离克隆基因和研究基因功能最有力的工具之一，其中的一大类—反转录转座子具有分布广、异源转座高和受组织培养诱导激活等优势，因此它的发现和利用又为转座子标签的应用提供了更广阔的前景。
此外通过对现有转座元件的改造以及转座元件作为载体改造的工具，也将大大加速植物基因和功能序列的分离与研究，如利用转座子元件构建启
P转座子引起杂交不育
动子捕捉载体，效率比T-DNA标签高〔11〕。
但转座子标签推广还存在一些困难，例如筛选鉴定转座元件引起的表型突变体。
目前，各种突变体筛选方法都在植物个体水平进行研究，先要得到基因型包含转座子插入突变的植株的种子，再在104～106个后代的群体中筛选突变体，工作量非常大，定向标签还要求有隐性纯合系可进行杂交。
最近开始研究利用单倍体进行细胞水平的突变体筛选，因为单倍体可直接表达隐性基因，瞿绍洪等鉴定了玉米转座因子Ac在单倍体烟草中的转座活性，这将有助于在单倍体细胞中进行转座因子研究〔15〕。
对转座子标签突变体筛选、标签基因分离等方面的改进将使这一技术更为完整，不仅为植物基因工程发展分离了更多的基因，同时可以大大促进植物基因表达机制等基础理论的研究。
转座子标签技术克隆基因的基本原理
转座子是染色体上一段可移动的DNA片段，它可从染色体的一个位置跳到另一个位置。
当转座子跳跃而插入到某个功能基因时，就会引起该基因的失活，并诱导产生突变型，而当转座子再次转座或切离这一位点时，失活基因的功能又可得一恢复。
遗传分析可确定某基因的突变是否由转座子引起。
由转座子引起的突变便可以转座子DNA为探针，从突变株的基因组文库中钓出含该转座子的DNA片段，并获得含有部分突变株DNA序列的克隆，进而以该DNA为探针，筛选野生型的基因组文库，最终得到完整的基因。
转座子标签技术
百科名片
复合转座子的结构
转座子标签技术是利用转座子作探针克隆出突变基因，再用突变基因做探针，从野生型个体中分离并克隆出野生型基因，最终得到完整的基因的技术方法。
转座子标签（transposontagging）技术是研究功能基因的有效的工具之一。
转座子标签法不但可以通过上述转座突变分离基因，而且当转座子作为外源基因通过农杆菌介导等方法导入植物时，还会由于T-DNA整合到染色体中引起插入突变，并进而分离基因，因此大大提高了分离基因的效率。
目录
基本原理
理论发展
应用实例
编辑本段基本原理
转座子标签（transposontagging）技术是研究功能基因的有效的工具之一。
转座子标签技术克隆基因的基本原理：
转座子是染色体上一段可移动的DNA片段，它可从染色体的一个位置跳到另一个位置。
当转座子跳跃而插入到某个功能基因时，就会引起该基因的失活，并诱导产
升级会员 