分子生物学 山西师范分子生物学121第六章 基因功能研究方法1.docx

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分子生物学山西师范分子生物学121第六章基因功能研究方法1

山西师范大学

教案

课程名称：

分子生物学

课程类型：

理论课□理论、实践课□实践课

学时：

52

学分：

2

授课教师：

郜刚

授课班级：

授课学期：

20至20学年第学期

教材名称：

朱玉贤分子生物学3rd

参考资料：

1．BenjaminLewin《GenesVIII》

2．：

[英]P.C.特纳A.G.麦克伦南A.D.贝茨M.R.H.怀特InstantNotesinMolecularBiology

3．韦弗（RobertF．Weaver）MolecularBiology

第六章基因功能研究技术

6.1转录组测序

什么是转录组？

某生物某特定生理条件下某个细胞或者组织中全部RNA；特指全部mRNA.

转录组研究的方法

传统方法（基于Sanger测序技术的）：

表达序列标签

expressedsequencetag,EST

基因表达序列分析

SerialAnalysisofGeneExpression,SAGE

新方法（基于新测序技术的）

454,solexa,SOLiD

5.6蛋白质组学的研究方法和进展page187

6.1基因表达研究技术

6.1.1基因表达系列分析技术

特点：

SAGE是以DNA序列测定为基础分析全基因组表达模式的技术。

原理：

任何长度超过9-10个碱基的核苷酸片段都可能代表一种特异性的转录产物，因此，将这些9-10碱基序列作为该转录物的标签，根据这个标签占总转录物的比例可分析所对应基因的表达频率

应用：

干什么的？

一个细胞中到底有多少种基因在表达

基因表达系列分析

（SerialAnalysisofGeneExpression,SAGE）

定义是一种用于定量、高通量基因表达分析的实验方法。

分离每个转录本的特定位置的较短的单一的序列标签（约9-14个碱基对），这些短的序列被连接、克隆和测序，特定的序列标签的出现次数就反应了对应基因的表达丰度。

SAGE是一种同时检测许多基因在同一时间、同一细胞中的表达及其水平的一种方法。

其理论依据在于“cDNA的同一种限制性内切酶位点旁边的9核苷酸序列可以作为代表一种cDNA的标签”。

因为，几乎不可能有两个基因cDNA的同一个酶切位点旁边的9个核苷酸完全相同，也就是说，相同的9核苷酸同时出现的概率是1/49＝1/262144，而细胞中表达基因的数目远小于这个数。

所以当检测到细胞中有多少种9核苷酸序列时，就可以判定有多少基因在表达，其表达产物的多少就反映了其表达水平的高低。

6.1.2RT-PCR法研究RNA的选择性剪接

RNA的选择性剪接是指用不同的剪接方式从一个mRNA前体产生不同的mRNA剪接异构体的过程。

平衡剪切

5’选择性剪切

3’选择性剪切

外显子遗漏型剪切

相互排斥性剪切。

RT-PCR法可以研究某个基因是否存在选择性剪切。

6.1.3原位杂交insituhybridization

原位杂交（ISH）是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段.

先经适当处理，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交。

因此原位杂交可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置，这一点具有重要的生物学和病理学意义。

检测基因表达的常用RNA和染色体原位杂交两大类。

RNA原位杂交:

用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等）标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，可通过放射性标记或经酶促免疫显色，对该基因的表达产物做出定性定量分析。

荧光原位杂交（fluorescenceinsituhybridization,FISH）

FISH（fluorescenceinsituhybridization）技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。

它的基本原理是:

如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。

将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，来确定该DNA序列在染色体上的位置。

6.1.4基因定点突变技术

概念：

通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列

作用：

用于研究基因产物功能：

氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响

改造DNA调控元件特征序列

修饰表达载体

引入新的酶切位点

定点突变的方法

1、经典的寡核苷酸介导的定点突变

2、PCR介导的定点突变方法

重叠延伸PCR技术

大引物诱变法

经典的寡核苷酸介导的定点突变

重叠延伸PCR介导的定点突变

原理：

PCR设计引物时，允许有个别碱基错配，也能退火。

特点：

可以定一个点的突变，也可以同时定两个点的突变

注意：

教材上199页图6-7是错误的，

文字描述也有问题

重叠延伸单点定点突变

大引物诱变法

原理1：

两条或者多条不同的引物存在时，可以通过控制某一个引物的退火温度来控制其为优势PCR

原理2：

用第一次PCR的产物（较大的片段）作为第二次PCR的引物

6.2基因敲除技术

6.2.1基本原理

经典遗传学（Forwardgenetics）是从一个突变体的表型出发，研究其基因型，进而找出该基因的编码序列。

反向遗传学（Reversegenetics）首先从基因序列出发，推测其表现型，进而推导出该基因的功能。

基因敲除（geneknock-out）又称基因打靶，通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改造，具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。

基因打靶技术常被用于灭活单个基因，又称为基因敲出。

科学家由此可以确定单个基因在健康和疾病中的角色。

这种基因“敲除”试验已经阐明了胚胎发育、成人生理学、衰老和疾病中无数个基因的角色。

目前已经有一万多个小鼠基因被敲除（大约为哺乳动物的基因组的一半）。

正在进行的国际性研究很快将能够实现所有小鼠基因的敲除。

基本原理1：

同源重组

基本原理2：

胚胎干细胞转基因动物

2.基因功能的研究方法

（1）转基因技术：

导入细胞，观察功能。

该方法用的最多，技术最成熟。

（2）基因敲除技术（geneknock-out/down又称基因打靶（genetargeting）。

这种技术是通过基因工程的方法将一个结构已知但功能未知的基因去除，或用其他序列相近的基因取代（又称基因敲入），然后从整体观察实验动物，从而推测相应基因的功能。

这种人为地把实验动物某一种有功能的基因完全缺失的技术称为基因敲除技术。

完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除ES细胞或者动物个体中的靶基因活性。

条件型基因剔除是指某一特定细胞类型或细胞发育的特定阶段剔除某一特定基因的技术。

具有发育的组织特异性。

geneknock-out的意义：

①研究基因功能

②转基因动物的制备

③用于药物筛选的动物模型

④转基因动物可作为“生物反应器”生产药物

（3）基因敲入技术（geneknock-in）

利用基因同源重组，将有功能的外源基因转入基因组中不存在或已失活的同源序列进行同源重组，在细胞内获得表达，这一技术称为基因敲进。

附录：

1转基因技术相关概念

1.转基因：

在DNA操作过程中整合到宿主细胞染色体上的外源基因

转基因技术包括下列：

转基因的重组子构建技术

重组分子导入宿主休内的转化技术

转基因在受体细胞染色体上的稳定整合

转基因的可控性表达技术

2.转基因生物品（GMO或TO）：

含有转基因并为其遗传修饰了的动

植物发育个体

一般的转基因方法

电穿孔法

显微注射法

脂质载体包埋法

裸露DNA直接注射

磷酸钙—DNA共沉淀法

病毒介导的生物学方法

转基因动物的制作方法

一、受精卵雄原核显微注射法

二、胚胎干细胞（ES细胞）法

三、逆转录病毒感染法

四、体细胞核移植法

五、精子载体法

六、YAC法

转基因植物方法

概括起来说主要有两类：

第一类是以载体为媒介的遗传转化，也称为间接转移系统法。

第二类是外源目的DNA的直接转化。

农杆菌Ti质粒（tumor-inducingplasmid）或Ri质粒（root-indcing plasmid）介导法是迄今为止植物基因工程中应用最多、机理最清楚、最理想的载体转移方法。

（1）叶盘法双子叶植物较为常用、简单有效的方法

（2）真空渗入法

（3）愈伤组织共培养

（4）原生质体共培养

（1）化学刺激法

细胞融合剂：

聚乙二醇（PEG）、聚乙烯醇（PVC）

（2）基因枪轰击法

（4）微注射法

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