免疫组化原理及概述.docx
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免疫组化原理及概述
免疫组化原理及概述
2008-05-2816:
42:
35|分类：
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一、免疫细胞化学技术的概述
*免疫细胞化学（immunocytochemistry,ICC）
-是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定细胞内抗原的成分（主要是多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫细胞化学。
（一）对抗原和抗体的要求
*具有特异性高和亲和力强的抗体是实验成功的首要条件。
-对抗体的要求：
纯度高、比活性强；
*高度特异性抗体的获得，取决于抗原的纯度。
-对抗原的要求：
纯度高，免疫原性强，稳定无变化。
（二）抗原（antigen,Ag）
*抗原的概念：
凡是在机体内引起体液免疫和（或）细胞免疫反应的物质，称为抗原。
抗原具有两个方面的特性：
-免疫原性：
引起机体产生抗体和（或）致敏淋细胞的特性；
-免疫反应性：
抗原能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异的结合或反应的特性。
*根据抗原是否显示免疫原性分为：
-完全抗原：
分子量较大，一般在10kDa以上，并具有较复杂的化学组成。
*免疫原性最强的是蛋白质抗原，多糖次之；脂类和核酸必需和蛋白质及多糖形成复合物才具有良好的免疫原性。
-半抗原：
又称为不完全抗原，分子量较小。
例如：
某些短肽、多糖、类脂和药物等。
*半抗原必需与载体结合，才能获得免疫原性。
载体
*通常是具有高度免疫原性的大分子物质，具有将免疫原性传递给耦联的半抗原能力。
-常用的载体有钥孔血蓝蛋白（keyholelimpethemocyanin，KLH）、牛血清白蛋白（bovineserumalbumin,BSA）、卵白蛋白（Ovalbumin，OVA）等。
-用戊二醛或碳化二亚胺作为交联剂通过功能基团-NH2、-COOH等将半抗原结合到载体上。
结合比例为5kDa结合5～25个分子的小肽。
（三）抗体（antibody,Ab）
1、抗体的概念：
*机体受到抗原刺激后，由浆细胞合成并分泌出一类具有与抗原发生特异性结合的球蛋白，被称为抗体。
-抗体主要存在于血清内；
-抗体都是免疫球蛋白，但免疫球蛋白并不一定都是抗体。
-免疫球蛋白根据重链的结构及抗原特异性不同分为五种，既IgG、IgD、IgE、IgA、IgM。
2、免疫组化实验中常用的抗体：
单克隆抗体和多克隆抗体。
*单克隆抗体：
是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，是应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备的。
-特异性强、抗体产量高。
*多克隆抗体：
是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。
-特异性低，会产生抗体的交叉反应。
-多克隆抗体广泛应用于石蜡包埋组织切片，可减少假阴性染色机会。
-抗原与抗体的结合，要求量保持一定比例，当抗原或抗体过量时，是不能聚合成大颗粒。
3、抗体的制备——多克隆抗体的制备
*动物的选择
*佐剂（adjuvant）
*免疫方法
*免疫剂量
*抗体效价的测定
*放血或定期抽血
（1）动物的选择
选择什么动物来免疫取决于：
*所需抗血清的量
-小鼠只能提供1.0～1.5ml的血液，而山羊能提供几升。
*能供免疫用的抗原量
-小鼠50&61549;g足够，而山羊需要几毫克。
（1）动物的选择（续）
*动物的品系：
免疫动物与提供抗原的动物之间的种系差异越大越好。
-例如哺乳动物的抗原可选择非哺乳动物来制备抗体。
-常用的动物有兔、羊、马、猪等，以兔（新西兰兔，年轻，健壮，体重在2.5kg左右，雄性）为最常用。
（2）佐剂（adjuvant）
*一般可溶性抗原注射后，迅速从注射部位扩散、吸收代谢。
佐剂可延长潴留时间，且延长免疫刺激作用。
因此在制备抗体的过程中，常将抗原和佐剂一起注射。
*最常用的佐剂是弗氏佐剂，又分为:
-弗氏不完全佐剂（Freund'sincompleteadjuvant）
-弗氏完全佐剂（Freund'scompleteadjuvant）
弗氏不完全佐剂
（Freund'sincompleteadjuvant,FIA）
*是由油剂（石蜡油或植物油）与乳化剂（羊毛脂或Tween80）混合而成，比例为1:
1、2:
1、3:
1或5:
1，可根据需要而定，通常2:
1。
*使用时与水溶性抗原按1:
1比例充分混合，使抗原分散在佐剂中形成油包水乳剂。
弗氏完全佐剂（Freund'scompleteadjuvant,FCA）
*在弗氏不完全佐剂中加入活卡介苗或死的结核分枝杆菌（终浓度为2～20mg/ml），即成为FCA。
*免疫动物时，将弗氏佐剂与抗原按体积1:
1混合乳化后（油包水）注入动物。
-一般首次注射时用完全佐剂乳化，第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。
佐剂与抗原乳化的方法
*研磨法：
适于制备大量的佐剂抗原
-先将不完全佐剂加热，取1.73ml放人无菌玻璃研钵内；缓缓滴入0.23ml活卡介苗，边滴边按同一方向研磨，使菌体完全分散。
-按同样方法滴人抗原，每加一滴应研磨至小滴消失。
滴加抗原的速度要慢，待抗原全部加人后，应成为乳白色粘稠的油包水乳剂。
*缺点：
研钵壁上粘附大量乳剂，抗原损失较大，对微量或难得抗原不宜采用。
佐剂与抗原乳化的方法（续）
*注射器混合法
-将等量的完全佐剂和抗原分别吸人两个5ml注射器内，然后插入三通管内，交替推动针管混匀，往复操作直至形成粘稠的乳剂为止。
*优点：
无菌操作，节省抗原或佐剂。
*缺点：
不易乳化，时间长。
佐剂与抗原乳化的方法（续）
*快速乳化法：
利用超声波粉碎器可快速乳化抗原和佐剂混合物。
-将抗原和佐剂按所需量加入一离心管中，置于超声波粉碎器上，粉碎头浸入液面下0.5cm，离瓶底0.5cm左右，以免打碎离心管。
-每次乳化10～15s，然后置冰箱lmin左右。
反复乳化3～4次即可完全乳化。
管内残余量800r/min离心5～10min收集。
*优点：
简单、快速、节省材料。
乳化剂的鉴定
*判断乳化是否充分，可将一滴乳化好的液体滴在水面上（冷水中），如能长时间保持圆珠形而不散开，表示乳化达到要求。
（3）免疫方法——免疫途径
*常有静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内、淋巴结、脚掌等注射。
*一般采用多点注射方法
-常在足、掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等处的皮内或皮下。
-皮内易引起细胞免疫反应，有利于提高抗体的效价。
（3）免疫方法——免疫途径（续）
*几点说明：
-大动物一般不用腹腔注射
-颗粒抗原和使用佐剂时不能静脉注射
-抗原宝贵可采用淋巴结内微量注射法，只需10～100&61549;g抗原即可获得较好的免疫效果。
-皮内注射较困难，特别是天冷时更难注入。
（3）免疫方法——次数及间隔时间
*次数一般为2～3次（初次免疫和加强免疫）
-首次注射后，10～15天再加强注射；
-剂量同首次或为首次的一半，用不全佐剂或不用佐剂。
*间隔时间，一般而言，动物越大，间隔越长
-豚鼠、大鼠为7～8天，兔子为10～15天，羊为14～28天；
-第三次注射的间隔时间更长些，效果更好。
举例1：
家兔的免疫
*初次免疫
-用50～200&61549;gAg加入FCA，在背部皮下注射6～8点，每点0.1～0.2ml，也可肌肉内或皮内注射；
*两周后，加强免疫
-将50～200&61549;gAg于PBS或FIA中，在肌肉、皮下、静脉或腹腔内注射；
*抗体效价的检测：
加强免疫一周后，耳缘静脉采血
-抗体效价测定可用环状沉淀试验、琼脂双向扩散法等方法。
前者抗体效价在1:
4000以上，后者在1:
16以上，即可采血，取血清进一步提纯。
举例2：
微量抗原淋巴结内注射免疫家兔
*一般选择2.5～3.0kg的新西兰种公兔
-先在其两脚垫注射完全福氏佐剂0.2ml（卡介苗每兔合5mg）；
-10天后，见胭窝淋巴结肿大，然后将抗原注射至肿大的淋巴结内，第一次注射抗原用完全福氏佐剂混合乳化；
-以后每隔20天用不完全福氏佐剂乳化抗原，以同样方法加强2次，各次注射的抗原均为25～50&61549;g；
-末次注射两周后兔耳放血测价（可达1:
128）。
举例3：
豚鼠和大鼠的免疫
*初次免疫
-用10～100&61549;gAg加入FCA，在背部皮内注射4～6点，每点0.lml，也可肌肉内或皮下注射；
*加强免疫
-每隔7～8天，将10～50&61549;gAg于PBS或FIA中。
在肌肉、皮下或静脉注射；
*抗体效价的检测
（4）免疫剂量
*抗原性强的抗原量应小，过大反会引起免疫抑制；
*免疫周期长的动物可少量多次注射，短的可大量少次。
（4）免疫剂量（续）
*各种动物首次免疫抗原剂量和加强免疫的剂量
（5）抗体效价的检测
多采免疫双向扩散法
【基本原理】
*指抗原和抗体在同一凝胶内都扩散，彼此相遇后形成特异性的沉淀线。
-将抗原与抗体分别加入同一凝胶板中两个相隔一定间距的小孔内，使两者进行相互扩散，当抗原抗体浓度之比相适宜时，彼此相遇形成一白色弧状沉淀线。
*优缺点：
简便，但敏感性较低，易出现假阴性结果。
免疫双向扩散法的操作步骤
*将玻璃板用水洗净后用75％乙醇冲洗，晾干后放在水平台上备用。
*将1％agar融化后，置56℃水浴。
*在玻璃板上铺胶，约1.5mm厚，凝固后打孔（直径3rnm），孔间距10mm。
*中心孔加5&61549;l抗原样品，周围孔内每孔加5&61549;l抗血清（抗体预先作系列倍比稀释即1:
2、1:
4、1:
8、1:
16、1:
32等比例）。
*凝胶板置湿盒内，室温扩散24h。
*观察结果。
抗体效价检测的其它方法
*环状沉淀试验，需较多的抗血清，现已很少用；
*对流免疫电泳，比琼脂免疫双扩散法敏感，较简便、实用；
*酶联免疫吸附试验（ELISA）。
#放血或定期抽血
常用以下3种方法
*颈动脉放血法：
放血量较多，动物不易中途死亡。
例如：
2.5kg白兔可放血约80ml。
家兔、山羊、绵羊等动物采血常用此法。
*心脏采血法：
常用于家兔、豚鼠、大白鼠、鸡等小动物，但操作不当易引起动物死亡。
*静脉采血：
家兔可用耳缘静脉采血；山羊、绵羊、马和驴可用颈静脉采血，这种放血法可隔日1次，有时可采集多量血液。
#放血或定期抽血（续）
*采血过程中，动作要轻柔，尽量避免溶血
*血液凝固后，及时离心收集血清，否则细胞溶解释放的杂蛋白（例如蛋白水解酶）将污染抗体并将抗体水解，降低效价；
*加叠氮化钠，分装，低温保存，也可加一定的保护剂如BSA、甘油等。
二、组织和细胞标本的制备
*标本制备恰当，是免疫组化成功的首要条件
*免疫组化对组织和细胞标本的要求
-保持所检标本原有的结构、形态；
-在原位最大程度地保持待测抗原（或抗体）的免疫活性，既不淬灭、流失或弥散，也不被隐蔽。
*免疫组化的组织和细胞标本，制作流程与常规处理方法基本相同，但对组织、细胞的处理又有其特殊要求及注意事项。
-各种抗原由于其含量及特性的差异对标本处理方式常有不同要求，因此要选择适用于本实验的最佳方法。
免疫组化中常用的组织和细胞标本
*组织标本
-石蜡切片
-冰冻切片
*细胞标本
-组织印片
-细胞培养片（细胞爬片）
-细胞涂片
（一）石蜡切片
*石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法
-最大优点是组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；
-石蜡块还能长期存档，供回顾研究。
*石蜡切片制作过程对组织内抗原显现有一定的影响，但可通过某些措施予以改善，因而它是大多数免疫组化中首选的组织标本制作方法。
1、取材的特殊要求及注意事项
*标本新鲜：
一般在2h以内进行，超过2h，组织将有不同程度的自溶，其抗原或变性消失，或严重弥散。
*取材部位：
除取病灶或含待检抗原部位外，还应取病灶与正常交界处，即所取组织切片中同时应有抗原阳性和阴性区，以形成自身对照。
-细胞坏死后，不仅抗原弥散或消失，而且常引起非特异着色，干扰观察，因此取材时应尽可能避开坏死区。
1、取材的特殊要求及注意事项（续）
*避免挤压：
取材时组织受挤压可使边缘部细胞形态改变并加深非特异着色，因而取材时应使用锋利的刀刃；
-镊取组织动作要轻；
-经窥镜直接钳取的组织往往有过度挤压，观察结果时应有所考虑。
2、固定及常用的固定液
*取材后的组织需立刻投于固定剂中
-固定使组织和细胞的蛋白质凝固，终止内源性或外源性酶反应，防止组织自溶或异溶，以保持原有结构和形态；
-对免疫组化而言更有原位保存抗原的作用，避免抗原失活或弥散。
*常用固定液：
固定剂品种很多，但大多属于醛类和醇类。
其固定原理不同，各有优缺点。
-醛类（常用甲醛、戊二醛和多聚甲醛）
-醇类（常用乙醇）
-其它（丙酮）
（1）醛类
*甲醛（福尔马林）应用最广
-原理：
形成分子间的交联，影响蛋白构型而使之固定。
-优点：
形态结构保存好，且穿透性强，组织收缩少。
-缺点：
*甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色；
*醛基与抗原蛋白的氨基交联形成羧甲基，使抗原决定簇的三维构象出现空间障碍；
*分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。
可造成假阴性的染色结果。
-注意事项：
*缩短固定时间，降低固定温度（4&61616;C），为此组织块不宜过厚。
*改用中性缓冲福尔马林，以pH值7.2～7.40.01mol/L的磷酸盐缓冲液配制成10％甲醛固定液，减少固定液pH的变化。
*固定后充分水洗以减少分子间交联。
*切片在作免疫组化染色前，先经预处理使抗原再现（抗原修复）。
*戊二醛：
-穿透性强，微细结构保存好，但对抗原有一定影响，常与其他固定剂联合用作免疫电镜固定液。
*多聚甲醛（常用4%）：
-可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光染色。
*主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇（CD）、主要组织相容性抗原等。
（2）醇类
*最常用的醇类固定剂是乙醇。
-其固定作用：
使细胞内蛋白、糖类发生沉淀。
-优点：
穿透性强、抗原性保存好。
-缺点：
*脱水性强，易引起组织收缩、变硬，影响切片质量，因而乙醇固定时间不宜过长（2h内）。
*乙醇使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度。
（3）其它固定剂
*丙酮：
-对抗原性的保存好，但脱水性更强，较少用于组织标本，但细胞爬片常用丙酮固定。
3、抗原修复——原因
*常规的石蜡切片标本均用甲醛固定，结果使得：
-抗原性物质形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇；
-蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。
*要求：
在染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。
3、抗原修复——方法
*化学方法
*加热方法
-水浴加热法
-微波照射法
-高压加热法
-酸水解法
（1）化学方法
*主要是通过一些酶的作用，使抗原决定簇暴露。
常用的酶有：
胰蛋白酶、胃蛋白酶等。
-胰蛋白酶：
一般使用浓度为0.05％～0.1％，消化时间为37℃，10～40min，主要用于细胞内抗原的显示；
-胃蛋白酶：
一般使用浓度为0.1%～0.4％，消化时间为37℃、30～180min，主要用于细胞间质抗原的显示。
*例如：
Laminin、CollagenIV
（2）水浴加热法
*将玻片放入装有抗原修复液的容器中，加热至沸腾，持续10～15分钟。
-优点：
操作简单、经济，适用于所有的实验室，
-缺点：
对封闭牢固的抗原决定簇暴露不理想。
（3）微波照射法
*将玻片放入装有抗原修复液的容器中，置微波炉加热至95℃以上，持续l0～15分钟，冷却后，按免疫组化染色步骤进行。
*此方法由于微波场内极性分子、离子高速运动，撞击交联的网链，使抗原异常的构想恢复正常，且因分子运动产热、效率高、时间短，对抗原再现效果好。
（4）高压加热法暴露抗原
*将玻片浸入抗原修复液内，置高压锅中高压2～3min，可取得极好的效果。
*由于高压下受热均匀，特别使用于大批量标本的染色。
（1）酸水解法
*酸水解可使交联断裂、暴露抗原。
*将玻片浸入1mol/LHCl溶液中，室温作用20min（温度升高，作用时间缩短）。
*此法能增强特异性染色，降低背景，但需注意水解过度将破坏抗原性及形态结构。
加热法的注意事项
*达到规定的温度（92～95℃以上）；
*维持一定的时间；
*避免切片干涸（抗原可能完全丢失）；
*加热后必须经过室温自然冷却20～30分钟，使未折叠的蛋白分子链恢复天然构型；
*修复液：
-最常用的是pH6.0的0.01mol/L的枸橼酸盐缓冲液；
-最新研究表明碱性修复液更有效，推荐使用1mM的EDTA缓冲液（pH8.0）。
4、载玻片的处理
*抗原修复过程中，由于高温、高压等诸多固素的影响，极易造成脱片。
为防止脱片，常用粘附剂处理载玻片。
-新载玻片上有油污，要用洗液浸泡12～24h，自来水冲洗后再用蒸馏水清洗；用绸布擦干或烤箱烤干。
清洁的载玻片再用粘附剂处理。
*常用的粘附剂有：
-APES（3-氨丙基三乙氧基硅烷）
-Polv-L-Lysine（多聚赖氨酸）
-铬明胶溶液
APES（3-aminopropyltriethoxysilane）
3-氨丙基三乙氧基硅烷
*现用现配。
用纯丙酮或甲醇配制2%APES（v/v）;
*将洗净的玻片浸于此液中20～30秒钟；
*取出稍停片刻，再入纯丙酮酮溶液洗去未结合的APES，置通风橱中晾干或60℃烤箱烤干。
Polv-L-Lysine（多聚赖氨酸）
*将清洁玻片浸于100&61549;g/ml（10%w/v）的多聚赖氨酸溶液中（去离子水稀释），37℃放置30min，然后60℃烤箱烘烤1h或室温过夜干燥。
装盒备用。
铬明胶溶液
*试剂：
铬明矾（chromealum）0.25g
明胶（gelatine）2.5g
蒸馏水500ml
*先将铬明矾溶解于40℃少量蒸馏水中，再加入明胶及蒸馏水，可在70℃水浴中使明胶溶化，搅拌均匀后，即可使用。
如有残渣，可过滤后再用。
*用时稍加溶化，切片浸入2～3min，过夜晾干。
（二）冰冻切片
*冰冻切片是指将组织在冷冻状态下直接切片。
*在切片前组织不经过任何化学药品处理或加热过程。
-缩短了制片时间
-抗原性不受损失
*对稳定性差的抗原，如淋巴细胞表面抗原尤其适合。
*组织冻结过程中，细胞内、外的水分会形成冰晶，冻结的速度愈慢，冰晶颗粒愈大，可严重影响组织、细胞的形态结构。
因此制备冻块时要求低温、速冻。
1、冰冻组织块的常用方法
*液氮中冰冻：
组织投入液氮中（一196℃）中10～20sec；
*干冰中加入丙酮（或异戊烷），液体立即气化起泡，温度降至一70℃，将组织投入，若在干冰丙酮中置一盛有异戊烷的容器，组织投入该容器内结冻则更好；
-上述组织在速冻时应浸埋于OCT包埋剂或甲基纤维素糊状液内，以保护组织。
-制成冻块后若需保存，应以铝箔或塑料薄膜封包，贮存于-70℃冰箱。
2、切片
*供免疫组化用的冰冻切片同样要求附贴平整，并有连续性。
*载玻片也应清洁无油污，但一般无需涂抹粘附剂；
*切片时，使用恒温冷冻切片机，在箱内温度-25℃。
切片厚度一般为4～8um。
3、切片后处理
*切好的冰冻切片，室温下自然晾干1～2h后，入4&61616;C丙酮固定10min，待干燥后作免疫组化染色或封存于-20℃。
*冰冻切片由于切片技术要求较高，不易得到连续性很好的切片，其形态结构亦不如石蜡片，且冻块和切片不便于长期贮存，因此冰冻切片的应用受限。
（三）组织印片
*将洁净载玻片轻压于已暴露病灶的新鲜组织切面，细胞即粘附于玻片，晾干后浸入冷丙酮或醋酸-乙醇固定10min，自然干燥后染片或-20℃保存。
（四）细胞培养片（细胞爬片）
*贴壁细胞培养时，置盖片于培养瓶中，使细胞在盖片上生长，达适当密度后取出固定（丙酮-20℃固定10～20min），再进行免疫染色。
-盖片的处理方法同载玻片的处理，但泡酸时间2h即可。
-为了防止细胞脱片，可用多聚赖氨酸处理。
（五）细胞涂片
*大多数细胞涂片由细胞悬液制成，包括：
-血液、尿液、脑脊液；
-体腔积液；
-组织穿刺吸取，如骨髓、淋巴结或其他实质性组织
-悬浮培养的细胞或贴壁细胞经消化后形成的悬液。
（五）细胞涂片（续）
*细胞涂片的方法：
-手涂法
*将细胞浓度调节到106/ml左右，可直接涂于载玻片上，但要均匀、不重叠。
*图片范围应小于1cm直径，以节约试剂。
-涂片机涂片法
*将细胞样品制成2×105～6/ml细胞悬液，吸取50～100&61549;l（1～2×104～5cells）加入涂片机内，1000rpm离心2min后细胞就均匀分布于玻片上。
三、免疫组化常用的染色方法
*根据标记物的不同分为
-
（一）免疫荧光法
-
（二）免疫酶标法
-（三）亲和组织化学法
（一）免疫荧光法
【原理】
*用于免疫荧光的标记物是小分子的荧光素，可标记抗体或抗原；
*荧光素经某种特定波长的光照射激发后，能发射出一种比激发光波波长更长而且能量较低的荧光，籍此可作定位观察或示踪；
*借助于荧光显微镜进行观察。
1、常用的荧光素
*
（1）异硫氰酸荧光素（FluoresceinIsothiocyanate,FITC）
*
（2）四甲基异硫氰酸罗丹明（TetramethylRhodamineIsothiocyanate,TRITC）
*（3）四乙基罗丹明（RB200）
*（4）碘化丙啶（propidiumiodide,PI）
（1）异硫氰酸荧光素（FITC）
*易溶于水和乙醇。
*最大吸收光谱为490～495nm，最大发射光谱为520～530nm．呈翠绿色荧光，分子量389.4。
*在碱性条件下，FITC的异硫氰酸基在水溶液中与Ig的自由氨基形成共价键，成为标记的荧光抗体。
一个lgG分子上最多能标记15～20个FITC分子。
（2）四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）
*最大吸收光谱550nm，最大发射光谱620nm，呈红色荧光，分子量为444。
*与蛋白质结合的方式同FITC。
（3）四乙基罗丹明（RB200）
*不溶于水，易溶于乙醇和丙酮。
*最大吸收光谱为570nm，最大发射光谱为595～600nm，呈橙红色荧光，分子量为580。
*RB200在五氯化磷（PCl5）作用下转变成磺酰氯（SO2Cl），在碱性条件下，易与蛋白质的赖氨酸&61541;-氨基反应而标记在蛋白分子上。
（4）碘化丙啶（PI）
*是常用的DNA荧光标记探针，可作为FITC的胞核对比染色。
*PI可嵌入到双链DNA和RNA碱基对中并与之结合，但对碱基无特异性选择。
*最大吸收光谱是493nm，最大发射光谱是630nm，呈红色荧光。
2、荧光抗体的保存
*一要防止抗体失活，二要保持荧光素不脱落和不受激发猝灭。
-一般认为0～4℃可保存1～2年，-20℃可保存3～4年。
-要小量分装，防止反复冻融。
-保存前需加防腐剂（浓度为1:
5000～10000的硫柳汞或1:
1000～5000叠氮化钠）。
3、免疫荧光的染色方法
*免疫荧光染色法常用的
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