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酶工程论文

酶工程论文

西北大学

生物工程

周智

（2009115261）

几丁质酶的概述

西北大学生物工程

周智（2009115261）

摘要：

本文就几丁质酶的基本结构和功能作一概述并就其研究进展进行探究。

关键词：

几丁质酶筛选方法测定方法性质功能

几丁质是由N一乙酰-D-氨基葡萄糖以β-1，4糖苷键连接而成的高分子聚合物，广泛存在于自然界，特别是海洋中．据统计，几丁质的全球年生物合成量超过

t，是仅次于纤维素的第二大可再生资源．几丁质的降解产物几丁寡糖、壳聚糖和N一乙酰氨基葡萄糖具有抗菌、抗肿瘤等活性，因而具有广泛的应用前景，目前这些产品一般用化学降解的方法来制取，造成较严重的环境污染，而用几丁质酶降解法能克服这个缺点，而且能控制降解的程度．

1.几丁质酶的简介

催化几丁质水解生成N-乙酰葡糖胺反应的酶。

EC3．2．1．14。

是卡勒和霍夫曼（P．Karrer，A．Hofmann，1929）从蜗牛（Helixpomatia）的胃液（中肠腺分泌液）中发现的，性质不详。

此外，在昆虫的蜕皮腺分泌液中也可找到，具有消化和吸收老的角质层的作用。

在昆虫的蜕皮液、扁桃（almond）的果皮和霉状菌中也有所发现。

　几丁质又名甲壳胺，是甲壳类动物（如虾、蟹）、昆虫和其他无脊椎动物外壳中的甲壳中的甲壳质，经脱乙酰化（提取）制得的一种天然高分子多糖体，是动物性的食物纤维。

几丁质脱乙酰化的程度越高，发挥的生理效应也越强，尚赫几丁质脱乙酰度可以达到来90%以上。

国际医学营养食品学会将这种物质命名为除糖、蛋白质、脂及、维生素和矿物质五大生命要素后的第六大生命要素，因此越来越受到广泛关注，它完全不同于一般天然营养品，它就是几丁质。

2.自然存在

几丁质是广泛存在于自然界的一种含氮多糖类生物性高分子，主要的来源为虾、蟹、昆虫等甲壳类动物的外壳与软件动物的器官（例如乌贼的软骨），以及真菌类的细胞壁等。

其蕴藏量在地球上的天然高分子中占第二位，估计每年自然界生物的合成量可达1×1011吨，仅次于纤维素。

一般由虾蟹壳提炼的几丁质，约含有15%的胺基（-NH2）与85%的乙醯基（-COCH3）。

几丁质不溶于一般的弱无机酸或有机溶剂，且不溶于碱液中，只溶于强无机酸。

几丁质具有强吸湿性，保湿效果亦相当好，并且具有吸附重金属离子的功能。

3.几丁质酶的种类

关于几丁质酶这一概念目前用得比较混乱，广义的几丁质酶是指所有与几丁质降解有关的酶，还包括脱乙酰酶，壳聚糖酶，几丁寡糖酶，几丁二糖酶等，狭义的几丁质酶是指催化水解至少含有一个N．乙酰葡萄糖胺基团糖苷键的酶，包括几丁内切酶和几丁外切酶，其中几丁外切酶又分为二亚类：

几丁二糖酶从非还原端开始水解几丁微纤维释放N．乙酰萄糖胺二聚体（GlcNAc）2，1，4．B．N乙酰葡萄糖胺酶水解几丁寡糖或几丁二糖释放N．乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）单体．另外每一种酶都有一系列同工酶，Saito曾在StreptomycescoelicolorA3

（2）中分离出7种几丁降解蛋白．Svital发现Vibrioharvey可诱导分泌至少10种不同的几丁质酶．

几丁质酶根据其氨基酸序列特征可分成6类，工、Ⅱ、Ⅳ型归于糖基化水解酶的第19族，主要存在于植物中，工和Ⅳ型在与几丁结合有关的N端有一半胱氨酸的富集区，而Ⅱ型缺乏这一区，Ⅳ的催化域与I、Ⅱ的催化域相比有二处氨基酸缺失．Ⅲ、V型归于第18族，广泛存在于病毒、细菌、真菌、昆虫、节肢动物、植物和哺乳动物中，其氨基酸序列与19族缺乏同源性．而N一乙酰葡萄糖胺酶被归于第20族．

绝大多数的细菌性几丁质酶属于第18家族，其主要功能是分解周围环境中的几丁质，以满足其自身对营养的需求，而对真菌的抑制能力较弱或无；这些酶具有多个功能区域，如催化部位、几丁结合部位、纤维连接蛋白（ifbronectin）Ⅲ区域及钙粘蛋白（cadheifn）区域，但各区域的功能尚未被明确阐明．这些酶对allosamidin敏感，催化部位有较多的．带状折叠，水解GlcNAc．GlcNAc和GlcNAc．GlcN键，水解产物保留异头构象（anomericconfiguration），其催化机理可用基质辅助的催化模型来解释。

植物产生的几丁质酶大部分为第19族糖基化水解酶类，其功能主要是抑制病原真菌的生长，进行自我防御，这类酶对allosamidin不敏感，催化部位有较高的a一螺旋含量，水解GlcNAc—GlcNAc和GlcN—GlcNAc键，水解产物无异头构象，其催化机理常用酸碱模型来解释．Ohno首次发现属于原核微生物的灰色链霉菌StreptomycesgriseusHUT6037能产生第19族的几丁质酶u，此后还发现一些真菌及土壤中的细菌也能产生具杀真菌活性的19族几丁质酶，这为生物防治及转几丁质酶基因植物的构建带来了佳音。

4.几丁质酶的性质

由于几丁质酶是一类复合酶，有多种蛋白组成，各种蛋白的性质有其自身的特点．几丁质酶的分子质量一般在20～120ku之间，其中细菌的几丁质酶多为60～110ku，放线菌的多为30ku或更低，真菌的一般大于30ku，植物几丁质酶也在30ku左右，昆虫几丁质酶的分子量较大，一般大于5Oku[．大多数细菌性几丁质酶有酸性的等电点，放线菌的一般为中性或碱性，而植物的几丁质酶往往有非常酸性或非常碱性的pI．大多数细菌性几丁质酶的最适pH为酸性或碱性，而放线菌和真菌的最适pH常是酸性的J．关于几丁质酶的热稳定性，一般在6O℃以下稳定，但地衣芽孢杆菌的几丁质酶在IO0~C处理10min后仍有一半多活性．WangSL发现一种假单胞菌PseudomonasaeruginosaK-187的胞外几丁酶F2有与地衣芽孢杆菌几丁质酶相似的热稳定性．值得注意的是近来Tanaka从嗜高热古细菌

kodakaraensisKOD1中分离到了抗热性很强的几丁质降解酶，ChiA的最适作用温度是85℃，在100℃处理3min后失活，但其缺失C端的同系物ChiAA2耐热性很强，在100℃处理3h后仍保留70％的酶活力，这极大地拓展了几丁质酶的应用范围．

5.表达几丁质酶的基因

不同的微生物具有不同的几丁质酶基因，即使同一种微生物内也会有不同的几丁质酶基因，这可能与生物进化过程中几丁质酶基因的获得方式有关．Techkamjanaruk从海洋细菌Pseudoalteromonasp．S91中分离到5个几丁质降解基因ll6J．Saito在一株链霉菌Streptomycescoelicolor中分离到了7个几丁质酶基因，其中5个为第18家族几丁质酶，2个为19家族．18家族的基因变异幅度很大，在它们编码结构域和催化域的核苷酸组成上显示出多样性．ChiE分子最大，从N端到C端依次为：

信号序列、几丁结合序列、串联重复的两个ifbronectinⅢ型区域（这二个区域有50％的同源性）和一个催化区，ChiC与ChiE相似，但缺少一个ifbronectinⅢ型区域，ChiD只包含一个信号序列和一个催化区．它们之间氨基酸的同源性为：

C与D74％，D与E34％，C与E36％；C与E间的结合序列、Ⅲ型区域和催化区的核苷酸序列同源性分别为38％、43％和36％，而A与B之间这三个区的同源性为62％、50％和38％．ChiF、ChiG为第19族，它们的序列高度保守，催化区序列间的同源性达84％，即便与s．griseus的19族基因ChiC的催化区也有70％以上的同源性．Watanabe认为这种高度保守的催化区与抗真菌活性有关_1，但也有人认为这种几丁质酶之间的差异与产生该酶的细菌间的进化距离有关．

6.几丁质酶的基因调节

一般认为几丁质酶基因的调节由抑制子／诱导子系统控制，几丁质的降解产物如N一乙酰葡萄糖胺是较好的诱导物，而一些易被利用的碳源如葡萄糖常是有效的抑制剂．但由于几丁质的存在形式多样，因而不同诱导物诱导出的酶也各异，且几丁质酶常以同功酶的形式分泌，经常相互有顺序地调节，构成了几丁质酶基因调节的多样性．Robert等曾发现Trichodermaatroviride的NAG1基因可通过低分子量的几丁寡糖和它本身的代谢产物诱导，而ECH42基因的表达似乎不被纯化的几丁质或几丁寡糖直接诱导，但可被碳饥饿和一些胁迫条件（2％乙醇，低温等）所诱导_24．Techkarnjanaruk等也发现几丁质酶基因的启动子可通过饥饿或高C07水平来诱导，但不能被镉离子，热冲击及紫外线所诱导．Ulhoa认为几丁质酶诱导的信号可能来自于细胞表面与不溶性底物间的物理接触，他们观察到几丁质酶的诱导被8-羟基喹啉（一种RNA抑制剂）和放线菌酮（一种蛋白质合成抑制剂）抑制，证明了此酶的诱导依赖于蛋白质的重新转录和翻译。

最近有报道说一种厌氧梭菌（ClostridiumparaputrficLtm）在以葡萄糖作为唯一碳源的培养基中其几丁质酶操纵子也能低水平转录，Morimoto用免疫分析法在该菌的培养上清液中检测到了几丁质酶的存在，Rivas也发现枯草芽孢杆菌168菌株的CSN基因转录不被代谢物反馈抑制J，说明这些几丁质酶很可能是组成型的．根据这些结果，有人推测一些微生物中存在着组成型的几丁质酶，它们在正常条件下能低水平地表达，一旦环境中含有几丁质，就可将几丁质降解成N-乙酰葡萄糖胺的低聚物，继而由这些低聚物诱导出各种各样的几丁质酶．

7．几丁质酶的应用

1）几丁质酶对果疏采后病害防治的效果

果蔬采后由真菌引起的几种常见病害有青霉病、灰霉病、软腐病、根霉病等,主要是由青霉菌（P.expansum）、灰葡萄孢（Botrytiscinerea）、根霉菌（Rhizopusstolonifer）、疫霉（Phytophthora）等引起的。

几丁质酶作为一种重要的抗真菌酶,应用于果蔬采后抗病害方面,可显著地抑制真菌生长。

目前已证明几丁质酶对多种果蔬采后病害引起的腐烂具有显著的防治作用。

国外,Benhamou等在研究菜豆几丁质酶基因时,发现几丁质酶对植物病原菌立枯丝核菌（Rhizoctoniasolanikuhn）有抑制作用;Tabaeizadeh等研究番茄抗枯萎病时,发现几丁酶能有效地抵御这类真菌对番茄的感染;AntonioIppolito等对苹果的采后贮藏期间腐烂情况进行观察时,发现灰霉病菌和青霉病菌这两种真菌会感染苹果的组织,从而诱导苹果的几丁质酶进行抗病反应;Maryline等发现,几丁质酶对葡萄的病原菌灰葡萄孢霉有生物防治作用。

国内,马桂珍等研究发现,链孢粘帚霉几丁质酶除对小麦雪腐病、葡萄白腐病、玉米黄斑病及斑点落叶病等病原菌的孢子萌发具有明显的抑制作用外,还能明显抑制核盘菌和立枯丝核菌的菌核萌发;王勇等在研究绿色木霉菌株Tr9701（Trichodermaviride）对黄瓜立枯病和番茄灰霉病的生物防治机理时,发现绿色木霉菌Tr9701产生几丁质酶,且经诱导处理酶产量明显提高,其酶粗提液对立枯病菌、灰霉病菌有显著抑制作用;曲明静等用网斑病菌和黄曲霉菌对17个花生品种室内接种研究花生网斑病菌和黄曲霉菌对花生几丁质酶诱导作用时,发现花生几丁质酶是与花生抗网斑病、黄曲霉病密切相关的一种抗性相关蛋白。

2）真菌几丁质合酶的生物学功能

酿酒酵母CS的功能是目前研究得最清楚的,CS3（Ⅳ类）在细胞周期开始时,在细胞出芽位点处合成几丁质环;CS2（Ⅱ类）在有丝分裂末期,在母细胞和子细胞之间合成初级隔膜;而CS1（Ⅰ类）则是在细胞分裂后起修复损伤作用。

假丝酵母CS的功能与酿酒酵母相似,Ⅳ类（Cachs3p）是主要的CS参与大部分几丁质的合成,Ⅱ类（Cachs1p）参与细胞隔膜的形成,Ⅰ类可能与修复损伤有关。

与酵母相比,丝状真菌中存在更多类别的CS同功酶。

丝状真菌中Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅶ类CS基因的单基因敲除通常不会导致明显表型缺陷,但是Ⅲ、Ⅴ或Ⅵ类CS单个基因的敲除却往往能导致菌株表型的明显缺陷,说明在丝状真菌中Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ类CS扮演重要的角色。

构巢曲霉的Ⅲ类CS基因（AnchsB）在整个发育过程中都表达,AnchsB敲除后导致菌株生长速率减慢、不产孢子、菌丝尖端膨大和侧壁异常等表型缺陷,并且不能通过添加渗透稳定剂来挽回。

但是在W.dermatitidis中的Ⅲ类CS基因的敲除仅使CS活性有所下降,但生长速率、形态、毒力、几丁质含量等都不受影响。

烟曲霉中存在两个Ⅲ类CS基因AfchsC和AfchsG,AfchsG的敲除会使菌株产生明显的表型缺陷,而AfchsC敲除的表型与野生型无异,表明在某些丝状真菌中存在两个相似的Ⅲ类CS基因,而仅有一种Ⅲ类CS基因在生命活动中起重要作用。

通过对构巢曲霉Ⅴ类CS基因（AncsmA）的研究发现,该基因在低渗条件下表达量高,而在高渗条件下则几乎不表达。

AncsmA基因敲除后菌株在低渗萌发时容易裂解,菌丝沿长度方向膨胀、形成空泡,对几丁质结合染料及抑制剂敏感,产生内生菌丝等缺陷,而这些表型缺陷能通过添加渗透稳定剂来部分挽回。

由此可以推测,Ⅴ类CS的功能是维持细胞壁的完整性,并在低渗条件下起尤为关键的作用。

Ⅵ类与Ⅴ类CS基因具有类似的结构,但是目前对Ⅵ类CS基因的研究相对较少。

在构巢曲霉中发现Ⅵ类与Ⅴ类CS的功能类似,同时敲除Ⅵ类与Ⅴ类CS基因的构巢曲霉是致死的。

在玉米黑粉菌中,单独敲除Ⅴ或Ⅵ类CS基因都不会使菌株产生明显的表型缺陷,而同时敲除Ⅴ或Ⅵ类CS基因会导致突变株膨胀,表明ⅥCS在功能上与Ⅴ类部分重复,并在维持细胞壁完整性中起作用。

3）植物几丁质酶的功能

几丁质酶存在于各种植物中,有广泛的功能,对于不同类型几丁质酶的各种功能进行研究,一方面可以加深对几丁质酶的了解、扩大其应用范围,另一方面也使在具体应用过程中对不同类型的选择更具目的性.

下面对此加以介绍.

3.1）参与植物抗胁迫反应　

现已证实几丁质酶是主要的植物病程相关蛋白之一,不过大多数几丁质酶也可受某些非生物因素的诱导,这说明几丁质酶的诱导表达是植物对逆境的一般反应.Hongetal的研究表明,病原诱导几丁质酶表达过程中ABA、NaCl和干旱等因素也有着重要的作用.Schneideretal[12]进一步发现,病原和水杨酸诱导的几丁质酶活性上升与植物体内的Ca2+密切相关.Ca2+是植物体内重要的第二信使,广泛地参与了植物逆境胁迫过程中的信息传导,这一研究成为上述推断的有力佐证.1986年Schlumbaumetal首次报道了提纯的菜豆几丁质酶具抗真菌活性.进一步研究表明,提纯的烟草、马铃薯、黄瓜等多种植物几丁质酶对立枯丝核菌等20多种病原真菌和非病原真菌的菌丝生长或孢子萌发具有抑制作用.除抗真菌外,几丁质酶对细菌、昆虫、螨等也表现出一定抗性.Ⅲ类几丁质酶大多兼具溶菌酶活性,可分解细菌细胞壁的肽聚糖,因而能对细菌产生毒害作用;昆虫围食膜中含有几丁质物质,几丁质酶可作用于围食膜而影响昆虫的消化.Dingetal的研究表明,转几丁质酶基因的植物叶片在昆虫幼虫每日食物量中占2%即可导致幼虫的全部死亡.几丁质酶也可对豇豆象鼻虫、蝴蝶幼虫等产生抑制或致死作用.线虫的卵壳和螨类均含有几丁质物质,几丁质酶对这两种病原物也起作用.

3.2）参与发育调控　

很多资料表明,植物几丁质酶的表达具有组织特异性,参与了植物的发育调控.目前此类研究大多集中在几丁质酶与植物有性生殖过程的关系上.Robinsonetal的研究表明,Ⅳ类几丁质酶和葡萄的成熟密切相关,并存在表达的组织或器官特异性;而在胡萝卜中,几丁质酶则参与了控制早期胚胎的发育.此外,几丁质酶和植物营养生长也有密切的关系.导入外源几丁质酶基因的植株生长更加迅速.从已有的资料来看,几丁质酶参与植物生长发育调控,可能在细胞分裂和分化以及在植物生长发育（如器官形成过程中）的信号分子的产生中起作用,其详细机制尚不清楚,有待进一步研究.

3.3）其它生理功能　

几丁质酶还具有其它多种生理功能.Minicetal研究表明,几丁质酶可以降解固氮菌产生的结瘤因子,从而控制结瘤因子水平,使植物与根瘤菌达到共生平衡,参与共生固氮调控;Stan2garlinetal的研究表明,几丁质酶广泛参与了植物光合作用等过程.这些研究均暗示着几丁质酶具有多种生理功能,可应用领域十分广泛.

8.展望

目前虽然对几丁质酶及其基因的研究报道较多，但由于几丁质酶的多样性，其调控机理的复杂性，再加上从自然界中分离到的酶活性不是太高，因此离工业应用的要求还相距甚远．今后应在生理上进一步加强诱导与阻遏的研究，在遗传上用定向突变技术搞清酶的催化与结合等效应部位，搞清操纵子的结构及特性，通过原生质体融合技术来增加几丁质酶的产量，通过基因克隆技术将几丁质酶转移到高效表达载体上．另外，昆虫致病真菌能产几丁质酶溶解昆虫体壁上的几丁质，而植物又能分泌几丁质酶溶解致病真菌细胞壁上的几丁质，那么昆虫和植物致病真菌体壁上的几丁质到底有什么不同，昆虫致病真菌的细胞壁上应该也有部分几丁质，这些几丁质为什么能抵抗自身产生的几丁质酶，而植物致病真菌为什么容易受植物产生的几丁质酶的攻击?

从分子水平上对几丁质及几丁质酶性质的阐明将有助于回答这些问题。

参考文献：

1.XX百科，几丁质酶词条。

2.几丁质酶的研究进展，陈少波，吴根福，科技通报，2004.5.第20卷。

3.几丁质酶对果蔬采后病害生物防治的研究进展，童志丹,易有金,柏连阳,胡瞬,王秀,温尤,纪乐，安徽农业科学，2010.38（19）。

4.真菌几丁质合酶的研究进展，冯贻安，崔志峰，微生物学通报，2008.35

（2）.

5.植物几丁质酶及其应用研究进展,张志忠,吴菁华,吕柳新,林义章,福建农林大学学报，2005.12.第34卷第4期。