人体中的比例.docx

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人体中的比例

人体中的比例

种类

重要的生物大分子！

占人体总重的16.3%

占人体干重的54%

人体中估计有10万种以上的蛋白质

第二章蛋白质

Chapter2protein

Ⅰ.概述

1.蛋白质的生理功能

2.蛋白质的元素组成elementscompositionofprotein

⑴元素组成

碳：

50~55%

氢：

6~8%

氧：

20~23%

氮：

15~19%（平均16%）

硫：

0.3~2.5%

微量：

磷、铁、铜、钼、碘、锌等

⑵蛋白质系数

蛋白质含量为氮含量的6.25倍。

16%的倒数

用途

问题

概念

测定氮含量可推测样品中的蛋白质含量。

糖、脂不含氮

蛋白质中氮含量稳定。

原因

许多物质含氮高，如三聚氰胺Melamine、甘氨酸等物质，一些企业为降低成本、提高蛋白质含量，在食品中添加这些物质。

3.蛋白质的分类

⑴按组成分类

水解产物全部为α-氨基酸。

简单蛋白质

simpleproteins

结合蛋白

complexproteins

水解产物有非α-氨基酸成分的蛋白质。

⑵按功能分类

按照蛋白质生物学功能，可分为9类。

⑶按分子对称性分类

分子接近球状或椭圆状，溶解度较好，能结晶，包括大多数蛋白质。

球状蛋白质

globularproteins

纤维状蛋白质

fibrousproteins

分子不对称，类似纤维或细棒。

⑷按蛋白质分子的形状和溶解度分类

①纤维状蛋白质fibrousprotein

线状、棒状、纤维状；

作用

形状

结构成分

种

类

胶原蛋白、弹性蛋白、角蛋白和丝蛋白等，不溶于水和稀盐。

肌球蛋白和血纤蛋白原，可溶于水和稀盐。

②球状蛋白质globularprotein

结构

形状

水溶性

作用

结构

组成

球形、椭球形

③膜蛋白membraneprotein

折叠紧密

疏水氨基酸在分子内部；

亲水侧链在外。

大多数蛋白质溶解度大

结合各种膜

疏水侧链在外部，亲水侧链在内

亲水氨基比胞质蛋白质少。

⑸按分子大小分类

烟草花叶病毒tobaccomosaicvirus，TMV

组成：

2130个亚基，一条RNA链，Mr约4×107

⑹简单蛋白质氨基酸分子数目估计

原

因

20种氨基酸的平均分子量为138；

蛋白质中氨基酸的平均分子量近128，小分子氨基酸比例大；

形成一个肽键除去一分子水。

Ⅱ.氨基酸aminoacids

组成蛋白质的α-氨基酸，共20种。

1.氨基酸的种类

⑴根据来源分

内源氨基酸：

体内蛋白质经蛋白酶分解产生

其他物质合成

外源氨基酸：

消化道吸收的

⑵从营养学角度分

必需氨基酸

essentialaminoacid

概念

名称

种类

动物不能合成或合成量微弱不能满足需要，必须从食物中获取的氨基酸。

婴儿和大白鼠：

10种必需氨基酸

大肠杆菌：

可合成全部氨基酸，无EAA

结论：

不同生物的必需氨基酸种类不同

⑶以R基团来分（4类）

①非极性R基团的氨基酸

8种：

Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Pro、Met、Trp

②极性不带电荷R基团氨基酸

7种：

Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、Cys和Gly

④带正电荷R基团氨基酸

3种：

Lys、Arg和His

③带负电荷R基团氨基酸

2种：

Asp和Glu

⑷稀有氨基酸

胶原和弹性蛋白：

4-羟脯氨酸

5-羟赖氨酸

甲状腺球蛋白：

二碘酪氨酸

L-甲状腺素

ε-N-甲基赖氨酸

α-角蛋白：

胱氨酸

⑸非蛋白质氨基酸

不形成蛋白质，如鸟氨酸和瓜氨酸

2.氨基酸的旋光性

氨基酸使偏振光的波动方向发生改变。

⑴对映异构体

标准

原因

甘氨酸

AA的α-C是手征性（chirality）碳原子

乳酸

D型：

右旋（destro）

L型：

左旋（levo），组成蛋白质的氨基酸。

无对映异构体

⑵旋光性

[α]tλ：

当c、l均为1时仪器测定的旋光度（物理常数）

c：

浓度（溶质g/mL溶液，固体物质为密度g/cm3）

l：

旋光物质厚度（dm）；

a：

仪器测定的旋光度（可变：

溶剂、浓度、pH）；

t：

温度；

λ：

波长；

specificrotation：

表示旋光程度

对映异构体使偏振光发生旋转的现象。

左旋

右旋

比旋光度

光线射向人面，顺时针旋转，“+”表示

逆时针旋转，“-”表示

旋光性

⑶旋光性与对映异构体

氨基酸的D、L型是人为规定的；

旋光性

对映

异构体

联

系

旋光性是氨基酸的自然属性，它们之间没有内在的必然联系；

有对映异构体（DL）才可以有旋光性（+-），也可以没有旋光性（内消旋、外消旋）

没有对映异构体（DL）时一定没有旋光性（+-）

3.氨基酸的酸碱性

⑴等电点的概念

两性分子所带电荷为零时溶液的pH值。

isoelectricpoint（pI）

两性电解质

等电点

ampholyteoramphotericelectrolyte

氨基酸是两性分子，氨基可结合H+带正电，羧基可解离出H+带负电。

⑵氨基酸的解离

A+（NH3+，COOH）→

A0（NH3+，COO-）→

A-（NH2，COO-）

按酸性递减顺序，标明氨基酸的电荷情况

；

第二步解离

得

第一步解离

得

⑶等电点的计算

⑷侧链解离的氨基酸

羟基一般不解离（酪、丝、苏）！

溶液pH

当[A+]=[A-]时，溶液pI

4.氨基酸的化学反应

⑴氨基参与的反应

①与酰化试剂的反应

②烷基化反应

氨基的一个H可被烃取代

原理

名称：

Sanger法，2,4-二硝基氟苯

2,4-dinitrofluorobenzene，DNFB

1-fluoro-2,4-dinitrobenzene，FDNB

原理：

弱减时生成二硝基苯基氨基酸

dinitrophenylaminoacid,DNP-AA

应用：

分析蛋白质N端。

DNFB

名称：

Edman法，苯异硫氰酸酯

phenylisothiocyanate,PITC

原理：

在弱减时形成苯氨基硫甲酰

phenylthoicarbamoyl,PTC

在硝基甲烷中与酸环化，

生成苯乙内酰硫脲phenylthiohydantoin,PTH衍

生物，无色，可层析分离。

应用：

分析蛋白质N端。

③形成西佛碱（Schiff'sbase）

PITC

氨基酸与醛反应生成西佛碱（弱碱），这是以氨基酸为底物的一些酶促反应的中间产物，如转氨基。

⑵羧基参与的反应

①成盐和成酯反应（活化氨基）

氨基酸和碱作用生成盐，重金属盐不溶于水。

盐

酯

②成酰氯反应（活化羧基）

条件：

氨基被保护，如被苄氧甲酰基保护

反应：

羧基与二氯亚砜或五氯化磷作用生成酰氯。

应用：

多肽人工合成

原因：

酰氯易去掉氯，使羧基与其它氨基酸的

氨基结合。

氨基酸的羧基与醇作用形成酯。

③脱羧基反应

氨基酸→→一级胺

④叠氮反应

⑶氨基和羧基同时参与的反应

应用

原理

茚三酮与α-氨基酸共热，使氨基酸脱氨脱羧，最后与茚三酮形成紫色物质（570nm最大光吸收）

比色定量测定氨基酸！

⑷侧链基团的反应

Ⅲ.蛋白质的一级结构

氨基酸组成、多肽链数目、

末端氨基酸组成、氨基酸排列顺序、

二硫键的位置等。

1.肽

⑴肽的结构（peptidebond）

蛋白质

化学结构

概念：

氨基酸的第一位羧基和另一个氨基酸的

α-氨基脱水缩合形成的碳氮键。

常识：

二肽：

两个氨基酸形成的肽，一个肽键

n肽：

n个氨基酸形成n肽，n-1个肽键

异肽键：

糖蛋白结构中介绍！

α-氨基未形成肽键的多肽链一端，

常作多肽链或蛋白质的起始端，

书写时写在左边开头。

N端

肽键

C端

氨基酸的第一位羧基未形成肽键的一端，

常作多肽链或蛋白质的结尾端，

书写时写在多肽链或蛋白质的后面。

⑵蛋白质一级结构primarystructure

蛋白质中氨基酸的排列顺序。

肽和

蛋白质

概念

寡肽：

＜10

多肽：

10~50

蛋白质：

＞50

按氨基酸的数目分类

⑶天然活性肽activepeptide

生物体内有生物学功能的多肽。

垂体后叶激素

概念

抗生素

antibiotics

催产素oxytocin：

9肽，促使妊娠子宫收缩

加压素vasopressin：

9肽，升高血压

短杆菌肽S：

gramicidinS，

[cyclo-（Val-Orn-Leu-D-Phe-Pro）2]

放线菌素：

抑制DNA转录而抑菌，临床用于恶性葡萄胎、绒毛膜上皮癌等，但毒性大，使用少。

来源：

蕈（mushrooms）的巨毒毒素

结构：

环状八肽

作用：

与真核RNA聚合酶Ⅱ牢固结合，

不能合成使RNA，但不影响原核

RNA合成。

α-鹅膏蕈碱amanitin

脑啡肽

enkephalin

结构：

有吗啡作用的5肽

前景：

研究前景广阔

内啡肽endorphin

结构：

91个AA，后五个AA与脑啡肽一样

研究：

脑室中注射后几小时内全身失去痛

觉，同时体温下降（但随后恢复正

常。

若注射内啡肽几秒钟后注射吗

啡的拮抗剂纳洛酮，马上逆转内啡肽

作用，痛觉恢复。

结构：

γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸，

含巯基，常表示为GSH

存在：

广泛存在动、植物细胞中

作用：

巯基缓冲剂，

维持半胱氨酸的还原状态。

谷胱甘肽glutathione

肌肽carnosine

β-丙氨酰组氨酸

鹅肌肽anserine

β-丙氨酰-1-甲基组氨酸

存在：

骨骼肌中含量高

20~30mmol/kg

功能：

至今尚不清，

估计与肌肉收缩有关

⑷肽和蛋白质的人工合成

至2010年，全球合成多肽类上市药品达50多种，II期临床试验的有70余种，III期临床试验的有30种，实验研究药品500~600种。

固相合成26肽的成本：

保护氨基酸约：

29%；

树脂及连接功能基团约：

18%；

溶剂约：

47%；

纯化约：

6%。

①肽的人工合成

A.基团保护

羧基保护

反应：

形成盐或酯

盐：

钾盐、钠盐、三乙胺盐、三丁胺盐等；

酯：

甲、乙酯：

引起氨基酸消旋，皂化除去

苄酯：

H2/Pd或金属钠-液氨法除去

叔丁酯：

温和条件下用酸除去。

种类多，常见的需要保护的如下：

侧链保护

Bzl：

苄基。

钠-液氨除去

MBzl：

对甲氧苄基，氟化氢0℃30min除去

合成结束时除去保护。

ε-NH2

（Lys）

SH

（Cys）

其它

Tosyl：

对甲苯磺酰基，

合成结束时在钠-氨液中除去。

Asp：

OBzl苄酯

Glu：

OMe甲酯

Ser（Bzl）、Thr（Bzl）

Tyr（Bzl）、Arg（Nε-Tosyl）

羧基

B.羧基活化

形成肽键需活化氨基或羧基，但常活化羧基。

原理：

氨基被保护、羧基被对-硝基苯酯活化

时，与另一个氨基酸形成肽

特点：

作用温和，产出率较高。

原理：

氨基被保护后，羧基在低温且有叔

氨（NR3）存在下与氯甲酸乙酯形成

混合酸酐，再与另一种氨基酸缩合形

成肽

特点：

易消旋，无水溶剂中消旋水平低。

原理

活化酯activeester

混合酸酐mixedanhydride

应用：

小肽合成大肽时

优点：

不消旋，光学纯度高。

叠氮azide

C.缩合接肽

可直接与一个羧基被保护的氨基酸和一个氨基被保护的氨基酸反应形成肽的物质。

接肽缩合剂

名称：

N,N-二环己基二亚胺，DDC

N,N-dicyclohexylcarbodiimide,

原理：

DDC从两个氨基酸中取一分子H2O，

变为不溶的N,N-二环己基脲，从反应

液中沉淀，也可用在固相肽合成中。

概念

常用物质

②固相肽合成Solid-phasepeptidesynthesis

Merrifield（1963）首创，80年代大量使用。

DNA合成

缘起

原理

支持物：

含反应基团如-OH的多聚体。

过程：

N端保护的α-氨基酸的羧基与支持物

反应结合到支持物上。

移走氨基的保护

基团，加入氨基保护的第二个氨基酸。

最后断开C-端与支持物的连接。

原理：

相似多肽固相合成法。

步骤：

先将目标DNA链3'-端核苷上的3'-OH

与树脂（固相）相连，然后将活化的单体核

苷酸（保护不参加反应基团）,按设计的顺序

依次加上去。

2.蛋白质的分解

⑴非特异性降解

缓慢：

用量：

100倍蛋白质的浓盐酸

方法：

密封后37℃中72~96h

产物：

25%的AA，其余为二肽和三肽

AA不消旋，Trp被破坏。

快速：

用量：

100倍蛋白质的6mol/L盐酸

方法：

密封或充氮110℃中10~24h

产物：

AA不消旋，Trp全破坏，Ser、Thr

和Tyr部分破坏，Asn和Gln的酰胺

水解生成AA和NH4+。

碱水解

酸水解

浓度：

5mol/L的NaOH

方法：

110℃真空或充氮下20h

产物：

氨基酸被消旋，但Trp完整，可定量Trp。

⑵特异性酶水解

产物：

多肽C端为Arg和Lys

肽段：

数目一般等于Arg和Lys总数加1。

胰蛋白酶

trypsin

糜蛋白酶

chymotrypsin

固相法

测序

固定剂：

双功能交联剂

名称：

对-苯异硫氰酸，PDITCorDITC

phenylenediisocyanate

切点：

马来酸酐（顺丁烯二酸酐）保护赖氨酸

的ε-NH2，酶切点减少，肽段减少

别称：

胰凝乳蛋白酶

产物：

水解Phe、Trp、Tyr等疏水AA羧基

形成的肽键。

活性：

断裂点临近基团碱性，活性增强；

若酸性，则减弱。

特点：

需Zn2+，Ca2+与热稳定有关。

专一性：

较差，但速度快。

嗜热菌蛋白酶thermolysin

木瓜蛋白酶

papain

胃蛋白酶

pepsin

专一性：

似糜蛋白酶，

但裂点两端AA都疏水！

来源：

木瓜（CaricapapayaL.）果实

特点：

专一性差！

对Arg和Lys的羧基端肽键敏感。

别称：

Glu蛋白酶

来源：

金黄色葡萄球菌Vs菌株

Staphylococcusaureus,strainVs

分子量：

12,000

专一性：

强！

①磷酸缓冲液（pH=7.8）

水解Glu和Asp羧基形成的肽！

②碳酸氢铵缓冲液（pH=7.8）

或乙酸铵缓冲液（pH=4.0）

水解谷氨酸羧基形成的肽。

梭菌蛋白酶clostripain

葡萄球菌蛋白酶Staphylococcalprotease

来源：

溶组织梭状芽孢杆菌

Clostridiumhistolyticum

专一性：

水解Arg羧基形成的肽键。

3.蛋白质一级结构的测定

⑴一级结构的测定步骤

①多肽链数目的测定

N端和C端AA摩尔数和蛋白质的分子量确定

一条多肽：

蛋白质摩尔数=AA摩尔数；

n条多肽：

蛋白质摩尔数=n×AA摩尔数；

杂多聚蛋白质heteromultimericprotein：

末端AA多于一种的蛋白质

实例

方法

②拆分蛋白质的多肽链

8mol/L尿素

6mol/L盐酸胍

高浓度盐

③拆开链内的二硫桥

拆分物

分离纯化

氧化剂或还原剂

断开二硫键。

变性剂

根据大小或/和电荷不同。

必须在进行第4步前断裂！

④测定每条多肽链的氨基酸组成

完全水解分离纯化后的样品，测定氨基酸组成，计算氨基酸的分子比。

⑤鉴定N端和C端氨基酸

鉴定末端，为建立氨基酸序列作参考！

⑥裂解多肽链成小片段

用多种断裂方法（断裂点不一样）降解样品成肽碎片。

分离纯化肽碎片，并分析氨基酸组成和末端残基。

⑦测定各肽断的氨基酸序列

⑧建立一级结构

⑨确定S-S的位置

常用方法：

Edman降解法，并自动序列分析仪

其他方法：

酶解法和质谱法等。

多套肽段的氨基酸序列彼此交错重叠，拼接多肽链的氨基酸序列。

原理

形成：

半胱氨酸（氧化或还原）

其他

辅基：

不属于氨基酸序列测定内容，

属蛋白质化学结构内容。

⑵N端测定

①二硝基氟苯法（DNFB或FDNB，sanger试剂）

广泛！

应用

侧链反应

原理

反应：

DNFB与多肽的α-NH2反应，再酸水解

产物：

DNP-多肽，酸水解比肽键稳定，

经酸水解后，N-末端AA形成为黄色

DNP-AA衍生物，其余为游离AA。

基团：

多肽侧链的ε-NH2、-OH等

产物：

侧链DNP衍生物

分析：

纸层析、薄层层析或HPLC分离

鉴定和定量测定。

②丹磺酰氯法（dansylchloride，DNS）

原理：

与DNFB法相同。

特点：

丹磺酰基有强烈荧光，灵敏度比DNFB法

高100倍，可测μg量，且水解后的DNS-AA

不需提取，可直接纸电泳或薄层层析鉴定。

③苯异硫氰酸酯法（PITC，Edman试剂）

α-NH2与PITC作用，生成苯氨基硫甲酰多肽，称PTC-多肽，它在酸性有机溶剂中加热时，N末端的PTC-AA环化，生成苯乙内酰硫脲的衍生物并从肽链上脱下，除去N端AA的肽链仍然完整。

反应

分离

有机溶剂抽提干燥后，薄层层析、

气相色谱、HPLC鉴定。

④氨肽酶法（aminopeptidase）

从多肽链N端逐个内切的肽链水解酶。

外肽酶

推测一级结构

氨肽酶

根据反应时间的不同测出酶水解所释放的氨基酸种类和数量，作出反应时间与残基释放的动力学曲线，推测蛋白质的N端氨基酸序列。

名称：

肽链外切酶（exopeptedase）

概念：

从多肽链末端逐个内切的肽链水解酶。

时间

产物量

A.酶对各种肽键的敏感程度不同，难于判断

氨基酸顺序的前后。

B.相邻的氨基酸一样，判断时位置提前。

困难

焦谷氨酸氨肽酶

亮氨酸氨肽酶

名称：

leucineaminopeptidase,LAP

应用：

广泛！

切点：

亮氨酸氨基形成的肽键的水解速度

最快，水解其它肽键的速度较慢。

名称：

pyroglutamateaminopeptidase

切点：

谷氨酸环化形成焦谷氨酸时

N端被封闭该酶可专一性地

水解焦谷氨酸NH2形成的肽键。

⑶C端测定

①肼解（hydrazinolysis）法

广泛且重要的方法！

②还原法

应用

其他

反应

与无水的肼加热时肼解，C端AA游离，其它AA形成相应的氨基酰肼化物，它与苯甲醛作用形成不溶于水的二苯基衍生物，游离的C端AA以FDNB和DNS鉴定。

Gln、Asn、Cys被破坏不易测定，

C端的精氨酸转变为鸟氨酸。

硼氢化锂还原C-末端AA为α-氨基醇，水解肽链后，C端AA的α-氨基醇可层析鉴别。

③羧肽酶法（carboxypeptidase）

类似氨肽酶的反应！

切点：

水解除Pro、Arg、Lys外的C端AA

来源：

牛胰，常用

常用四种羧肽酶

羧肽酶B

羧肽酶C

羧肽酶Y

羧肽酶A

切点：

仅水解Arg、Lys为C端AA形成的肽

来源：

猪胰，常用

切点：

非特异水解C端AA

来源：

柑橘叶，不常用

切点：

非特异性水解C端AA

来源：

面包酵母，常用自动分析

④溴化氰

断裂甲硫氨酸的羧基形成的肽键，常用。

优点：

A.一般蛋白质含Met少，可获得大片段；

B.专一性强

C.产率高达80%以上

D.条件温和，室温几到十几小时即可。

⑷二硫键定位

目的：

蛋白质变性松散

方法：

8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍

⑸氨基酸组成分析

氨基酸自动测序仪分析，分子量3万的蛋白质，仅需6μg样品，1小时即可测定完毕。

再

还原

先变性

巯基乙醇在pH=8~9，室温数小时使二硫键还原为巯基。

然后用烷化剂如碘乙酸保护生成的半胱氨酸SH，防止重新被氧化。

Ⅳ.蛋白质的空间结构

空间结构、高级结构、构象、

三维结构、立体结构。

1.维持蛋白质空间结构的力

⑴范德华引力Vanderwealsforce

名称

静电引力！

作用

种

类

本质

维持三、四级结构！

①取向力：

极性基团偶极间的静电吸引；

②诱导力：

极性基团偶极与非极性基团的诱

导偶极之间的静电吸引；

③色散力：

二个非极性基团瞬时偶极间的静

电吸引。

⑵氢键hydrogenbond

主要维持蛋二级结构，

对三、四级结构亦有一定作用。

⑶疏水作用力hydrophobicbond

⑷离子键ionicbond

原

理

作用

作用

疏水基团（非极性基团）排斥水分子接近，因范德华引力结合的力，称疏水作用力或疏水键。

（负压）

主要维持三、四级结构！

力源：

正负离子间的静电吸引

作用：

维持三、四级结构

⑸配位键coordinatebond

一个原子单独提供电子对形成的两原子间的共价键。

⑹二硫键disulfidebond

二硫键、二硫桥、硫硫桥！

作用

作用

名称

存在

含义

如血红蛋白等与金属离子的配位键。

在金属蛋白中维持三、四级结构。

稳定蛋白质空间结构！

2.肽单位平面结构和二面角

⑴肽单位（peptideunit）的特征

肽键peptidebond

侧链sidechain

氨基酸残基aminoacidresidues

主链骨架（mainchainbackbone或主链）

①肽键有部分双键性质，不能自由旋转；

②6个原子在同一个刚性平面（酰胺平面）。

③C＝O与N-H或Cα-C与Cα-N一般反式结构。

④平面结构有一定的键长、键角。

肽单位特征

肽单位组成

Cα原子相临肽平面的二个旋转角度（Φ，Ψ）。

⑵二面角dihedralangle

应

用

概

念

多肽链中，任何Cα的二面角（Φ，Ψ）改变，多肽链主链骨架构象必然发生相应的变化。

2.二级结构

多肽链主链上的一些借助于氢键形成的有规律构象。

⑴规则的二级结构

①α-螺旋α-helix

概念

种类

α-螺旋、β-折迭、β-转角、无规卷曲

不包括R侧链的构象。

α-螺旋、3.613-螺旋

名称

螺旋间链内形成氢键，维持稳定。

右手螺旋，每一圈含3.6个AA。

α-螺旋特征

B.力

C.侧链

D.螺距

E.左手

螺旋

与α碳原子相连的R侧链位于外侧，对α螺旋的形成和稳定影响较大。

5.44Å（0.544nm），两AA距离1.5Å

特征：

不稳定！

存在：

少！

仅嗜热菌蛋白酶中发现一个

左手α-螺旋。

A.螺旋数

②β-折迭pleatedsheet

多肽链中较伸展的周期性折迭的主链构象。

结构

侧链

概念

与相邻平面的交线垂直，交替位于片层两侧。

β-折迭链平行排列

氢键连接

形成β-折迭片，或β-折迭片层

平行β-折迭片：

二条β-折迭链走向相同！

反平行β-折迭片：

二条β-折迭链走向相反！

③β-转角turn

减少占有的空间！

名称

结构

概念

原因

多肽主链出现的弯曲、回折和重新定向，出现180°转弯的结构，

β-转角（turn）、或β-弯