真菌对几种杀菌剂的抗性机制研究.docx

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真菌对几种杀菌剂的抗性机制研究

真菌对几种杀菌剂的抗性机制研究

摘要：

苯并咪唑类杀菌剂通常被认为是一类高抗药性风险的药剂，主要是由于这类药剂作用靶标单一，病原菌很容易发生抗药性突变；另外，该类药剂由于有很好的杀菌活性和教宽的防治谱，在过去的一段时间内被大量单独使用,已在自然界形成很高的选择压力；二甲酰亚胺类杀菌剂是20世纪70年代初推出的一类广谱、触杀型、保护性杀菌剂，也有一定的治疗作用，对真菌的孢子萌发、菌丝生长都有抑制导致菌丝顶端产生不正常的分枝和肿胀，最近研究表明双组份组氨酸激酶的点突变可能是此类杀菌剂对病原菌产生抗性的机制；甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂是一类重要的新型杀菌剂,具有广谱、高效、安全的特点。

这类杀菌剂作用于真菌线粒体的电子传递链的复合物三，阻止电子传递，抑制能量合成。

由于作用位点单一，易产生抗药性，其抗药性机制主要是细胞色素b基因序列上发生点突变。

关键词：

苯并咪唑类二甲酰亚胺类甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂抗药性

苯并咪唑类（benzimidazoles）化合物是上世纪60年代后期开发的一类非常重要的药剂，被广泛应用于农用杀菌剂、兽药及临床抗癌药物。

苯并咪唑类药剂中最大的一类为农用杀菌剂，对大多数子囊菌、半子菌和担子菌引起的病害均有防治效果，又因为该类药剂被首先发现具有植物内吸性，对病害具有治疗作用，该类药剂的开发被认为在植物病害化学防治上具有里程碑式的意义。

我国从上世界70年代仿制多菌灵成功以来，该类药剂一直被广泛应用于一些重要农作物主要病害的控制。

该类杀菌剂主要作用于病原菌的β-微管蛋白，阻止纺锤丝的形成，从而干扰细胞核的分裂。

因此这类药剂作用位点单一，选择性较强，病原菌在药剂选择压力下很容易产生抗药性。

。

据统计，到1987年止，至少有55个属的病原菌对苯并咪唑类杀菌剂产生了抗药性[1]。

目前由于其突出的抗药性问题，苯并咪唑类杀菌剂的应用范围及前景受到很严重的制约。

苯并咪唑类化合物的母体结构中都含有一个苯并咪唑环的活性基团，主要品种有多菌灵（carbendazim）、苯菌灵（benomyl）、噻菌灵（thiabendazole）、麦穗宁（fuberidazole）等，另外由于甲基托布津（thiophanate-methyl）在生物体中主要代谢为多菌灵而起作用，因此也将其归入这类化合物[2]。

最初，Hastie研究发现[3]苯菌灵能使构巢曲霉（Aspergillusnidulans）的核不稳定，因此推测苯并咪唑类药剂可以干扰病原菌的核酸物质的合成。

但后来的研究表明[4-6]，该类杀菌剂可以使细胞核的分裂受阻，而抑制核酸物质的合成只是核分裂受阻的结果。

苯菌灵在处理菌丝后，细胞呈现类似于秋水仙素处理植物或动物细胞后的现象，而秋水仙素主要是通过干扰纺锤体的形成进而破坏哺乳动物或植物细胞的有丝分裂[7]。

由α-微管蛋白和β-微管蛋白组成的异二聚合体是组成微管的最基本的单元，而微管进一步可组装成为纺锤丝，而纺锤体的形成以来纺锤丝将处于赤道板的染色体往细胞两极牵引[8]。

当细胞用秋水仙素处理后，由于不能形成纺锤丝，使得有丝分裂过程停滞在细胞分裂中期，每个染色体复制的两个姊妹染色单体虽然分开了，却不能彼此往两极分离，不能形成两个子核，于是该细胞内的染色体就加倍了。

遗传上可以采用此染色体加倍的原理使用秋水仙素进行多倍体育种。

真菌的微管对秋水仙素不敏感，出现该现象可以说明苯并咪唑类药剂具有与秋水仙素相同或相似的作用机理。

Nocodazole是一种与多菌灵的结构类似的化合物，最初被作为抗癌药物应用于临床试验。

该化合物能强烈抑制哺乳动物细胞的有丝分裂[9]。

研究表明，nocodazole对哺乳动物微管的干扰作用与秋水仙素类似，能与秋水仙素竞争性地和哺乳动物的β-微管蛋白结合[10]。

同时，试验也发现nocodazole与多菌灵可与真菌的微管蛋白竞争性结合[7]，这说明多菌灵也作用于β-微管蛋白。

Davidse[11]用14C标记的多菌灵与构巢曲霉的菌丝粗提蛋白进行离体结合试验，发现多菌灵可与微管蛋白类似物发生结合，且结合能力与构巢曲霉对多菌灵的敏感性有关，来自对多菌灵敏感的构巢曲霉菌株的β-微管蛋白与多菌灵的结合能力比来自多菌灵抗药性菌株强。

Howard等对Fusariumacuminatum菌丝进行药剂处理后观察菌丝尖端发现，药剂处理后菌丝生长受到抑制，所有的有丝分裂在中期停滞，同时微管稳定剂D2O对多菌灵具有颉颃作用，说明多菌灵作用于真菌的微管，并且使微管更不稳定，易于分解[12-13]。

Künkel对构巢曲霉萌芽分生孢子有丝分裂的超微结构的观察发现，用多菌灵处理后无纺锤体形成[14]。

此外，更多的苯并咪唑类药剂作用于真菌的β-微管蛋白的证据来源于对许多病原菌抗性的生化机制和分子机制方面的研究[15]。

苯并咪唑类杀菌剂通常被认为是一类高抗药性风险的药剂，主要是由于这类药剂作用靶标单一，病原菌很容易发生抗药性突变；另外，该类药剂由于有很好的杀菌活性和教宽的防治谱，在过去的一段时间内被大量单独使用,已在自然界形成很高的选择压力。

这类药剂在20世纪60年代后期问世，在1969年，Schroeder等[18]就首次报道了黄瓜白粉病菌产生对苯菌灵的抗药性。

据统计，到1987年止，至少有55个属的植物病原菌对这类药剂产生了抗药性[1]。

病原真菌通常对苯并咪唑类杀菌剂的抗药性发展较快，在使用这类药剂1至3年就能在田间检测到抗药性菌株，如灰霉病菌（Botrytiscinerea）[19]、苹果黑星病菌（Venturiainaequalis）[20]。

但在大麦眼斑病菌（Pseudocercosporellaherpotrichoides）[21]中使用这类药剂10年后、在大麦云纹病菌（Rhynchosporiumsecalis）[22]中使用15年之后、在用多菌灵防治小麦赤霉病菌（F.graminearum）近20年之后才在田间检测到首例抗药菌株[23]。

从以上现象可以大致得到以下推论，灰霉病菌可在作物的生长季节中多次循环侵染，在一个生长季单一大量使用苯并咪唑药剂防治病害容易形成很大的选择压力，病原菌容易产生抗药性；而如小麦赤霉病菌（F.graminearum）等在小麦生长季节只需要在防治适期用药一次即可，药剂选择压力较弱，不容易产生抗药性问题，或延缓了抗药性出现的时间。

苯并咪唑类药剂的抗药病原群体在田间发展速度较快，药剂的选择作用是其中一个原因，另一个主要原因是大多数病菌对这类药剂的抗药突变体通常适合度较高，有较强的生存竞争能力，如灰霉病菌[24]、小麦赤霉病菌[25]等的抗药菌株在无性繁殖、有性生殖能力、生长速率、致病性等方面与野生敏感菌株无明显差异，有的抗性菌株在药剂停止使用多年后，仍能检测到。

与β-微管蛋白亲和性的降低被认为是病原菌对这类药剂产生抗性的生化机制。

大量研究结果表明病菌对苯并咪唑类药剂的抗性与β-微管蛋白的变化有关，研究者推断病原菌与药剂亲和性下降可能和β-微管蛋白上某些特定氨基酸的改变有关。

Jung等（1990，1992）克隆了构巢曲霉抗药突变体的benA基因，该基因的突变能使病菌对噻菌灵产生抗性，而对nocodazole、多菌灵、苯来特等更加敏感，测序比较发现，该基因的突变使得β-微管蛋白上的165位置上的丙氨酸突变成了缬氨酸，后来对更多室内诱导的构巢曲霉的抗药突变体研究发现，β-微管蛋白上第6、198、200等位置上氨基酸的改变也能导致抗性的产生。

Jung和Oakley检查了苯菌灵抗性突变区域在不同生物体间的保守程度，因为所有的β-微管蛋白是高度同源的，在长度上类似。

研究了哺乳动物、昆虫、植物、真菌、藻类和原生生物的44个β-微管蛋白氨基酸序列，结果发现第6位和第198位氨基酸是高度保守的，第6位的组氨酸存在于41/44个序列中，第198位的谷氨酸存在于43/44个序列中。

由于这两个位点的氨基酸在遗传背景如此不同的生物体中有如此高的保守性，这些氨基酸的改变很可能会引起一些不利的选择性，然而这些选择性上的不利是很小的，并不引起生长和产孢的明显下降。

第165位上差异大，但所有真菌均为丙氨酸。

在200位具有特定于各个门的差异，这解释了不同门的生物体对苯菌灵的敏感性。

真菌一般对苯菌灵敏感，所测的各个真菌β-微管蛋白在第200位为苯丙氨酸，酪氨酸代替苯丙氨酸导致了对苯菌灵的抗性。

大部分哺乳动物为酪氨酸，可以解释为什么哺乳动物对苯菌灵不敏感。

植物对苯菌灵及其他苯并咪唑类杀菌剂也很不敏感，其第200位为甲硫氨酸或丝氨酸。

Oakley等研究认为构巢曲霉β-微管蛋白第50、134或257位的氨基酸突变也可以产生对苯菌灵的抗性。

Fujimura（1992）研究发现，对多菌灵产生抗药性的粗糙脉孢霉菌株的突变连锁于编码β-微管蛋白的Bm1位点；第198位不同的氨基酸替代可导致对乙霉威不同程度的敏感性，谷氨酸（最不敏感）<赖氨酸<丙氨酸<甘氨酸（最敏感）；β-微管蛋白第250位的苯丙氨酸和第237位的丙氨酸影响了该菌株对乙霉威和多菌灵的抗性。

Fujimura（1994）进一步研究认为，β-微管蛋白165~167、237~250位的氨基酸控制着对苯并咪唑类杀菌剂和乙霉威的抗药性，导致菌株对两者之间的正交互抗性；而第198位氨基酸对苯并咪唑类杀菌剂和乙霉威的负交互抗性起着重要作用；在第198位，谷氨酸的大小和电荷有利于β-微管蛋白与多菌灵的结合，而更小的一些氨基酸利于乙霉威与β-微管蛋白结合。

Koenraadt（1993）发现粗糙脉孢霉对苯菌灵抗药性菌株的β-微管蛋白第198位和200位氨基酸突变，第198位由谷氨酸突变为丙氨酸，第200位氨基酸由苯丙氨酸突变为酪氨酸。

提取对苯菌灵具有抗药性的粗糙脉孢霉菌株β-微管蛋白基因，构建载体，转化到对苯菌灵的敏感菌株中，转化子对苯菌灵表现为抗性。

粗糙脉孢霉中β-微管蛋白第198位和200位的点突变也引起对苯菌灵的抗性，第198位的丙氨酸与菌株对乙霉威的敏感性相关。

目前所获得的多种具有对苯并咪唑类杀菌剂田间抗药性的植物病原真菌菌株中，氨基酸突变仅仅出现在两个位点：

198和200。

如β-微管蛋白198位氨基酸由谷氨酸（Glu）突变为丙氨酸（Ala）是导致S.sclerotiorum产生对多菌灵田间抗药性的主要原因（李红霞，2002、2003）。

其原因可能是β-微管蛋白中其他位点的突变与真菌的适合度的降低有关，大田条件下给这些突变体带来选择上的不利，从而导致生存能力的下降，无法在田间存活。

如在第50、134、257位突变的构巢曲霉对苯菌灵的抗性菌株都具有温度敏感性，适应性下降。

但Kawchuk等（2002）报道了引起贮藏期马铃薯干腐病菌（Gibberellapulicaris）的β-微管蛋白第40、144、226、307、312和354位氨基酸密码子发生变化，但与噻菌灵抗性无关。

大多数病菌对苯并咪唑类杀菌剂的抗性是由单个主效基因β-微管蛋白基因控制的，且该基因的不同碱基发生突变或同一碱基发生不同的突变可以使病菌对药剂产生不同的抗药性水平，如灰霉病菌（Faretra和Pollastro，1991）、苹果黑星病菌（Shabi和Katan等，1983）等。

但也有例外，如在尖镰孢（Fusariumoxysporum）（Molnar和Hornok等，1985）和意大利青霉（P.italicum）（BerahaGarber和Garber，1980）中，高水平的抗性受两个主效基因控制；Stover等发现在Mycosphaerellafijiensisvar.difformis和M.musicola中（Stover，1977），除染色体基因外，一些胞质因子也与抗性有关。

二甲酰亚胺类杀菌剂（dicarboximidefungicides,DCFs），如乙烯菌核利（vinclozolin）、菌核净（dimethachlon）、速克灵（procymidone）和扑海因（iprodione）等是20世纪70年代初推出的一类广谱、触杀型、保护性杀菌剂，也有一定的治疗作用。

因其杀菌谱广、防治效果显著，已被广泛应用于多个类群植物病原真菌，如葡萄孢属、丛梗孢属、青霉属、核盘菌属、链格孢属、长蠕孢属、丝核菌属、茎点霉属、球腔菌属、尾孢属等引起的作物、果树病害防治。

随着DCFs使用时间的延长、施用量的加大，植物病原真菌对二甲酰亚胺类杀菌剂抗药性问题日益严重，其抗性产生机制、抗药性监测治理等研究受到广泛重视，日前已取得较大进展。

但因二甲酰亚胺类杀菌剂的杀菌机制尚不清楚、大田抗药性的检测尚无有效的方法等原因，且抗药性的产生本身也很复杂，日前国内外对抗药性产生机制的研究仍处于探索阶段。

大多数的研究是以突变体（特别是实验室诱变菌株）为研究材料，旨在比较突变株和野生型菌株在某些关键酶编码基因的差异性，并未能证实这些关键酶编码基因在抗药性产生中的作用机制。

因而，进一步推断植物病原真菌二甲酰亚胺类杀菌剂抗性机制的研究有重要的理论意义和实践意义。

二甲酰亚胺类杀菌剂包括速克灵（procymidone），菌核净（dimethachlon）、扑海因（iprodione）和乙烯菌核利（vinclozolin），对防治B.cinerea引起的各科作物的灰霉病和Sclerotlniaspp引起的菌核病有特效（Brent，1995）。

此外也常用于防治Alternaria，Dydimella，Helminthosporiummonilinia，Phoma等属真菌引起的一些植物病害。

由于B.cinerea和上述其它病原真菌在许多作物上对苯并咪唑类杀菌剂产生了抗药性，因此二甲酰亚胺类杀菌剂更加受到重视。

自合成二甲酰亚胺类杀菌剂以来，各国学者一直在探讨这类杀菌剂的作用机制，但最终的作用靶点至今仍无定论。

二甲酰亚胺类杀菌剂对真菌的孢子萌发、菌丝生长都有抑制导致菌丝顶端产生不正常的分枝和肿胀。

进一步的研究表明，这一类药剂会增加线粒体膜和内质网膜上的脂质过氧化反应，这种过氧化反应从多方面干扰膜上脂质的合成加入脂肪酸过氧化反应拮抗剂如C，能减轻二甲酰亚胺类杀菌剂对菌体生长的抑制和过氧化物的形成，表现为影响膜的渗透势发生变化，不过这种结果与药剂较窄的抗菌谱似乎不符，因此这类药剂是否对B.cinerea，Sclerotiniaspp等有专化性的靶标位点蛋白质是很多专家感兴趣的问题。

二甲酰亚胺类杀菌剂自使用以来，首先用于防治B.cinerea引起的各类作物灰霉病，几年后出现抗性菌株。

Latorre等报道，在防治葡萄灰霉病使用10~15年后，抗性菌株比例达4.9，但未有抗性引起防治失败的报道，认为田间有耐药性菌株存在，而抗性菌株的适合度有所下降，表现为更高的对渗透压敏感性，但仍具有致病性。

因此认为这类药剂可在田间继续使用10~15年。

刘波在大棚草莓连续9次喷洒速克灵防治草莓灰霉病，每次间隔10~15天，未发现速克灵抗性菌株产生。

这说明在田间B.cinerea难以产生抗性，一旦产生抗性，抗性菌株的适合度也有所下降，在较长时间内难以因抗性而引起防治失败。

在对植物病原真菌DCFs抗药性机制探求过程中，研究者一直试图通过比较抗性菌株和敏感菌株的特性，试图将抗药性与其它直观性状联系起来。

早在1982年GrindleM曾发现粗糙脉孢菌os-1型渗透压突变菌株对DCFs表现抗药性，据此他猜测渗透压调节途径和DCFs抗药性之间应存在一定的联系。

之后，PillonelC,etal.（1997）和SchumacherMM,etal.（1997）对粗糙脉孢菌渗透压突变株进行更深入研究，发现渗透压的敏感性和DCFs抗药性之间确实存在联系，并提出同源于酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）SLN1蛋白的HK蛋白激酶（two-componenthistidinekinase）上游六个90个氨基酸的重复区域内突变的存在是导致植物病原真菌对DCFs抗药性产生的原因。

IanBD,etal.（2004）对A.alternata田间抗性菌株的抗性分子机理的研究中也证实了渗透压调节相关HK蛋白激酶突变导致抗药性的产生。

此外CuiW,etal.（2002）发现N.crassaos-1型渗透压突变体对芳香烃类杀菌剂的抗药性与渗透压调节相关蛋白Hog1的os-2基因相关，而DCFs与芳香烃类杀菌剂存在交互抗药性。

根据以上研究可以得出植物病原真菌对DCFs的抗药性与渗透压之间是相耦联的，抗药性的产生可能是信号传导途径中某些调控渗透压的基因发生了突变。

OrthAB,etal.（1995）以玉蜀黍黑粉病（U.maydis）乙菌核利高抗菌株VR43为研究材料，构建基因组文库，获得抗性相关基因adr-1，序列比对结果显示：

adr-1基因与丝氨酸蛋白激酶的催化结构域同源性高，维持激酶活性所必须的氨基酸残基在adr-1基因编码的蛋白中均能找到；直接以adr-1基因转化野生型菌株，野生型菌株产生抗药性。

虽然以突变株VR43得出的结论在普遍性方面仍有待进一步证实，但是抗性转化子的获得，证实了植物病原菌对DCFs抗药性是单基因控制（FaretraF,etal.,1991;MillerTK,etal.,2002），这在分子机制研究中是一个大的突破。

CuiWei,etal.（2002）对灰霉病菌DCFs抗性菌株研究中发现抗性菌株与敏感菌株相比对渗透压更为敏感，对敏感菌株和抗性菌株的Bos-1基因进行分析，抗性菌株Bos-1基因表现为多样性的单氨基酸突变。

结合突变子杂交分析，他们认为Bos-1基因编码一种组氨酸蛋白激酶，并提出组氨酸蛋白激酶是二甲酰亚胺类杀菌剂的作用靶点。

Bos-1基因是目前已知的灰霉病菌中唯一抗DCFs相关片断。

IanBD,etal.（2004）在链格孢对扑海因的抗药性研究过程中也发现HK基因N-末端氨基酸重复区位点的突变是抗药性产生的原因。

之后，MaZH等从8个灰霉二甲酰亚胺类抗性菌株和6个敏感菌株中克隆了双组分蛋白激酶（Bos1）的全序列，氨基酸序列比较表明：

2个抗性菌株在365位氨基酸发生点突变从异亮氨酸变为丝氨酸（I365S）或天冬酰胺（I365N），3个抗性菌株在369位从谷氨酰胺变为脯氨酸和在373位由天冬酰胺变为丝氨酸（Q369P），这三个突变都发生在90氨基酸重复序列。

在抗性菌株65-E8的1040位发现了一个新的无效突变位点，并在黄瓜上接种实验证明，发生该位点突变的菌株没有致病力。

将敏感菌株的Bos1基因转化到抗性菌株65-E8中，发现所有转化子对扑海因表现敏感并且对黄瓜有很好的致病力。

虽然很多研究发现DCFs的抗药性与双组分蛋白激酶有关，但是双组分蛋白激酶突变位点的存在如何保护病原菌细胞免受DCFs的破坏仍然不是很清楚。

由于二甲酰亚胺类与芳烃类杀菌剂有交互抗性（OchiaiN，2002），YanZhang,etal.（2002）研究对芳烃类杀菌剂和DCFs有交互抗药性的粗糙脉孢菌Os-2突变菌株，通过亲缘杂交克隆了一个与Hog1高度同源的Os-2基因。

将含Os-2基因全部编码区的片段导入酿酒酵母Hog1突变体，能使Os-2突变菌株回复渗透压敏感的表型。

以来源于敏感菌的Os-2基因转化抗性菌株，抗性菌株获得敏感菌渗透压不敏感和抗药性敏感的表型。

据此，他们提出产生一个有功能的os-2蛋白对正常的渗透压反应和杀菌剂的敏感性是必需的，丝状真菌的渗透压调节途径是芳烃类杀菌剂的作用靶点。

尽管对Os-2基因的改变如何引起的菌株抗DCFs水平的变化未报道，但证实了Os-2突变菌株对芳烃类杀菌剂和DCFs有交互抗药性。

甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂主要作用于真菌的线粒体呼吸作用，破坏能量合成从而抑制真菌生长或杀死真菌。

药剂进入病菌细胞内，与线粒体上细胞色素b（cytb）的Qo位点相结合，阻断细胞色素b和细胞色素c1之间的电子传递（通过阻断Ubiquinol的氧化），从而抑制线粒体的呼吸作用，破坏病菌的能量合成。

由于缺乏能量供应，病菌孢子萌发、菌丝生长和孢子的形成都受到抑制。

甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的活性来源于它们能键合在细胞色素b（Cytb）的还原型辅酶Q的氧化位点（Qo位点）,从而抑制线粒体的呼吸作用,也因此称为Qo抑制剂。

细胞色素b是细胞色素bc1复合物的一部分,位于真菌和其他真核体的线粒体内膜,一旦某个抑制剂与之键合,将阻止细胞色素b和c1之间的电子传递,通过阻止三磷酸腺苷（ATP）的产生,从而干扰真菌体内的能量循环。

在细胞色素bc1复合物的晶体结构得到解析后,人们主要从基因的角度来研究各个甲氧基丙烯酸酯类化合物的具体作用位点。

通过单点基因突变[10]发现,如果把病原体细胞的螺旋cd中143位的甘氨酸突变为丙氨酸（即突变体G143A）,则病原菌会对这类抑制剂产生很高的抗性。

此抗性的产生可能是由于甘氨酸突变为丙氨酸后抑制剂与细胞色素b之间的位阻增加了。

突变体G143A已在小麦白粉病菌、单囊壳白粉病菌、瓜类霜霉病菌、葡萄霜霉病菌、香蕉叶斑病菌和苹果黑星病菌的抗性菌株中被检测到。

说明G143是大多数Qo抑制剂的一个结合位点。

然而,G143A并不是存在于抗性菌株中的唯一突变体,氨基酸129位的苯丙氨酸突变为亮氨酸（F129L）、氨基酸275位的亮氨酸突变为苯丙氨酸（L275F）和氨基酸275位的亮氨酸突变为丝氨酸（L275S）等突变体也存在于不同的菌株中,只是它们不如突变体G143A普遍。

这些突变体使病原菌对抑制剂产生抗性原因可能是由于靶蛋白与抑制剂分子间的结合能增加所致。

目前，大多数学者认为，许多病原真菌对甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的分子抗性机制是Cytb基因DNA序列上氨基酸143位发生点突变，由丙氨酸（GCT）取代甘氨酸（GGT）。

氨基酸的改变使Cytb结构发生变化，药剂不再与其结合，药剂与靶标的亲和力下降。

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